張卡， 王泳浩， 吳云峰， 許雷， 王海勝

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京100081

生物脫氮是自然界氮代謝過程中的重要環(huán)節(jié)，隨著人類生產(chǎn)活動的增加，自然界中的氮元素流入生物體內(nèi)也隨之增加，導(dǎo)致氮元素失衡。非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）參與細(xì)菌諸多生命活動，如脅迫應(yīng)答、生長、生物膜形成、生物代謝、毒性等，脅迫條件會刺激細(xì)菌ncRNA 的表達(dá)，使其能迅速適應(yīng)環(huán)境[1]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的ncRNA 被鑒定出來，雖然已有ncRNA 參與固氮代謝過程的研究報道[2]，但目前尚無ncRNA 調(diào)控脫氮代謝的報道。探究脫氮過程中ncRNA 的功能及其調(diào)控機(jī)制，對明確ncRNA 在氮代謝過程的作用具有重要意義，同時也可為維持自然界氮元素平衡提供理論依據(jù)。大量的研究者對苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）的生物信息學(xué)進(jìn)行了分析[3-5]，結(jié)果表明其可在土壤中單獨(dú)生存，也可與植物根系共生[6-7]。苜蓿中華根瘤菌已成為研究對環(huán)境脅迫的適應(yīng)和不同生活方式轉(zhuǎn)變的模式微生物。

異養(yǎng)硝化-好氧反硝化過程可以將氨氮轉(zhuǎn)化為氣態(tài)產(chǎn)物，并且不會造成硝態(tài)氮積累[8]。研究表明脫氮酶包括氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，AMO）、羥胺氧化酶（hydroxylamine oxidase，HAO）、硝酸鹽還原酶（nitrate reductase，NAR）、亞硝酸鹽還原酶（nitrite reductase，NIR）、一氧化氮還原酶（nitric oxide reductase，NOR）和氧化亞氮還原酶（nitrous oxide reductase，NOS）可能參與該代謝過程。傳統(tǒng)脫氮代謝的一般途徑為→N2O→N2，但菌株不同，代謝途徑也存在差異。Pahel 等[9]在研究大腸桿菌（Escherichia coli）谷氨酰胺合成酶的激活與抑制時，發(fā)現(xiàn)ntrC基因與glnA 緊密相連，命名為glnG，其編碼產(chǎn)物為NtrC。Mcfarland 等[10]研究發(fā)現(xiàn)各種細(xì)菌中均存在ntrC基因，其功能與碳氮代謝調(diào)控相關(guān)[10]。張宇等[11]研究發(fā)現(xiàn)與野生型相比，ntrC基因缺失菌株脫氮基因表達(dá)量下調(diào)，ntrC基因過表達(dá)菌株脫氮基因表達(dá)量上調(diào)，表明ntrC對氮代謝過程具有調(diào)控作用；此外，在氮代謝方面，假單胞菌sRNA 固氮條件下特異誘導(dǎo)表達(dá)的非編碼RNA（nitrogen fixation condition-inducible small ncRNA，NfiS）受氮限制條件誘導(dǎo)產(chǎn)生。RNA 分子伴侶Hfq依賴于NfiS的表達(dá)，受σ 因子RpoN、氮代謝全局激活因子NtrC、nif特異性激活因子NiftyA 的級聯(lián)調(diào)控。nifS 突變導(dǎo)致固氮酶活性降低，對滲透壓、氧化脅迫等更敏感。NfiS 直接與nifK mRNA 堿基互補(bǔ)配對，通過提高mRNA的翻譯效率和半衰期最終增強(qiáng)固氮酶活性[12]。目前尚無關(guān)于ncRNA參與脫氮代謝研究的報道。

本研究以苜蓿中華根瘤菌為出發(fā)菌株，利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測有可能與NtrC 蛋白相互作用的ncRNA（SM2011_c06248），構(gòu)建其敲除菌株；并通過分析相關(guān)菌株ntrC、nar等氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)量，初步探究該ncRNA 在脫氮代謝過程中的功能，并構(gòu)建SM2011_c06248、ntrC雙突變菌株SM∷248-NtrC 和SM2011_c06248過表達(dá)菌株SM:dld-248，以期探究ncRNA 對氮代謝過程的調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株及載體Sinorhizobium meliloti1021 由廣西大學(xué)李有志教授惠贈；菌株E.coliJM110 由本實(shí)驗(yàn)室保存；pGEM-T easy vector system（AmpR）購自 Promega 公司；pLAFR3（TcR）載體、pJQ200SK（GmR）質(zhì)粒、PBBR1MCS-3（TcR）載體由本實(shí)驗(yàn)室保存。pJQ200SK-248s-Tc（GmRTcR）載體、PBBR1MCS-3-dld-248（TcR）載體、pJQ200SKNtrC-Tc（GmRTcR）載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)菌株SM∷248、SM∷248-NtrC、SM∷248-dld 由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基、YMA 培養(yǎng)基、反硝化培養(yǎng)基、富氮培養(yǎng)基、微量元素溶液的配制參照《分子克隆指南》[13]。

1.1.3 試劑TaqDNA 聚合酶、RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR 反應(yīng)預(yù)混液、ClonExpress Ultra one Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒、細(xì)菌RNA 提取試劑盒均購自 Omega 公司；T4 DNA 連接 酶 、限 制 性 內(nèi) 切 酶PstⅠ 、SpeⅠ 、BamH Ⅰ 、SacⅠ、BstZ171 均購自賽默飛世爾科技公司；DIG High Prime DNA 標(biāo)記和 Detection Starter KitⅠ試劑盒購自Roche公司；Amp、IPTG、X-gal、Gm、Tc等抗生素為國產(chǎn)分析純試劑。qPCR 反應(yīng)八連管購自Axygen 公司。引物由上海生工生物科技有限公司完成（表1）。

表1 實(shí)驗(yàn)中使用的引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2 方法

1.2.1 氮代謝調(diào)控相關(guān)ncRNA 的獲取 通過網(wǎng)址（https://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime2011/rhime2011.cgi）在線檢索Sinorhizobium meliloti1021 全基因組所有 ncRNA，得到 74 條長度大于200 nt 的ncRNA。利用生信預(yù)測軟件lncPro（http://bioinfo.bjmu.edu.cn/lncpro/）在線分析苜蓿中華根瘤菌ncRNA 與調(diào)控蛋白NtrC 相互作用的可能性，并最終確定了評分較高的4個基因，即SM2011_c06191、SM2011_c06248、SM2011_c07 102和SM2011_c07132。

1.2.2 載體構(gòu)建 通過同源重組的方法[14-16]將載體PLAFR3 上的四環(huán)素（Tc）基因替換為苜蓿中華根瘤菌的SM2011_c06248基因，分析實(shí)驗(yàn)菌株ntrC、nar等氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)量，確定SM2011_c06248的功能。

利用重疊延伸PCR 技術(shù)，以苜蓿中華根瘤菌基因組 DNA 為模板，以 248a、248b、248c、248d 為引物通過2 次PCR 反應(yīng)后將SM2011_c06248基因上下游各100 bp的基因序列連接并在中間位置引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，獲得片段248s，將其連接至pGEM-T easy 載體 MCS 上，得到 pGEM-T-248s載體。設(shè)計含有BamHⅠ酶切位點(diǎn)的引物（Tc-F 和Tc-R）從PLAFR3 載體擴(kuò)增Tc基因。分別用BamHⅠ酶切pGEM-T-248s和Tc基因擴(kuò)增產(chǎn)物，連接轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒鑒定后獲得pGEM-T-248s-Tc載體，pJQ200SK 載體 MCS 處有PstⅠ、SpeⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計含有PstⅠ、SpeⅠ位點(diǎn)的引物從pGEMT-248s-Tc擴(kuò)增248s-Tc片段，分別用PstⅠ、SpeⅠ酶切pJQ200SK 和248s-Tc，連接轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒鑒定后獲得pJQ200SK-248s-Tc（圖1A）。

將ntrC基因1 026 bp 的基因序列連接到pGEM-T easy 載體上，得到 pGEM-T-ntrC載體。設(shè)計含有BstZ171酶切位點(diǎn)的引物（TcF1和TcR1）從PLAFR3 載體擴(kuò)增Tc基因。分別用BstZ171 酶切pGEM-T-ntrC和Tc基因擴(kuò)增產(chǎn)物，連接轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒鑒定后獲得pGEM-T-ntrC-Tc載體，pJQ200SK載體多克隆位點(diǎn)有BamHⅠ、EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，設(shè)計含有BamHⅠ、EcoRⅠ位點(diǎn)的引物從pGEM-T-ntrC-Tc擴(kuò) 增ntrC-Tc片 段 ，分 別 用BamH Ⅰ 、EcoRⅠ酶切pJQ200SK 和ntrC-Tc，連接轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒鑒定后獲得pJQ200SK-ntrC-Tc（圖1B）。

圖1 載體構(gòu)建示意圖Fig.1 The construction of vectors

實(shí)驗(yàn)證明SM2011_c0624基因的表達(dá)需要特定環(huán)境信號刺激，通過組成型啟動子dld可以啟動SM2011_c0624基因的表達(dá)，從而使該基因過量表達(dá)，pBBR1MCS-3 載體具有Tc 抗性，大小約5.2 kb，為廣宿主性載體，可以在大部分菌株中穩(wěn)定復(fù)制存在，用該質(zhì)粒構(gòu)建SM2011_c06248基因過表達(dá)菌株。利用無縫克隆將SM2011_c06248基因與組成型啟動子dld連接到pBBR1MCS-3載體，連接轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒鑒定后獲得pBBR1MCS-3-dld-248（圖1C）。

1.2.3 基因敲除菌株的篩選 通過電擊轉(zhuǎn)化的方法將敲除質(zhì)粒pJQ200SK-248s-Tc轉(zhuǎn)入苜蓿中華根瘤菌中，敲除載體上的248s-Tc與苜蓿中華根瘤菌基因組中SM2011_c06248發(fā)生同源重組，SM2011_c06248基因被敲除。在苜蓿中華根瘤菌中載體pJQ200SK-248s-Tc不能復(fù)制，可以利用Gm和Tc篩選到發(fā)生單交換的重組子，由于pJQ200 SK-248s-Tc上有蔗糖敏感基因SacB，因此可以用含7%蔗糖的YMA固體培養(yǎng)基篩選到發(fā)生雙交換的重組子[11（]圖2）。同時將敲除載體pJQ200SK-ntrC-Tc轉(zhuǎn)入SM2011_c06248基因敲除菌株中，通過雙交換可篩選出SM2011_c06248、ntrC基因雙突變菌株。

圖2 苜蓿中華根瘤菌基因發(fā)生雙交換的篩選路線Fig.2 Screening route for double exchange of genes in Sinorhizobium meliloti

1.2.4 總RNA的提取及cDNA的合成 將野生型和突變體菌株接種于20 mL 反硝化培養(yǎng)基中，30 ℃ 180 r·min-1震蕩培養(yǎng)至 OD600約為 0.6。再用富氮培養(yǎng)基分別培養(yǎng) 10、20、30、60、120、240、480 min 后，使用 RNA 提取試劑盒提取 RNA，再使用RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

1.2.5 Northern Blot 驗(yàn) 證SM2011_c06248基 因 表達(dá) 按照試劑盒DIG High Prime DNA 標(biāo)簽和Detection Starter KitⅠ的說明書制備雜交用探針，提取總RNA 后，在變性凝膠中電泳，電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜、雜交、洗膜、顯色，以雜交帶清晰、背景低為好。操作結(jié)束后拍照保存圖片。

1.2.6 qPCR 反應(yīng)檢測 檢索NCBI 數(shù)據(jù)庫，根據(jù)氮代謝調(diào)控蛋白基因ntrC、硝酸鹽還原酶基因nar序列設(shè)計qPCR引物，采用16S rRNA為內(nèi)標(biāo)基因，引物見表1。

熒光定量PCR 的反應(yīng)混合液：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，Primer1（10 μmol·L-1）0.4 μL，Primer2（10 μmol·L-1）0.4 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8.2 μL。qPCR 反 應(yīng) 程 序 ：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，40 個循環(huán)。

為減少實(shí)驗(yàn)誤差，內(nèi)標(biāo)基因與目的基因每個樣品分別設(shè)計3 個平行重復(fù)、3 次生物學(xué)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。采用相對定量方法[17]表示目標(biāo)基因的表達(dá)量。其中表示目的基因相對于對照基因的表達(dá)倍數(shù)[18]。苜蓿中華根瘤菌在硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)到對數(shù)生長期后，轉(zhuǎn)至富氮培養(yǎng)基中，分別培養(yǎng)0、10、20、30、60、120 min。以未富氮培養(yǎng)的樣品為對照測定菌樣中氮代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮代謝調(diào)控相關(guān)非編碼RNA的預(yù)測

通過網(wǎng)址（https://iant.toulouse.inra.fr/bacteria/annotation/cgi/rhime2011/rhime2011.cgi）在線檢索Sinorhizobium meliloti1021 全基因組所有ncRNA，得到74 條長度大于200 nt 的lncRNA。利用lncPro分析軟件（http://bioinfo.bjmu.edu.cn/lncpro/）在線分析苜蓿中華根瘤菌多個ncRNA 與調(diào)控蛋白NtrC 相互作用的可能性，并最終確定了評分較高的 4 個基因，即SM2011_c06191、SM2011_c06248、SM2011_c07102、SM2011_c07132，并對其中得分最高的SM2011_c06248進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證并探究其對ntrC及氮代謝調(diào)控過程的影響。

2.2 基因敲除載體及菌株的鑒定

將構(gòu)建的載體pJQ200SK-248s-Tc進(jìn)行PstⅠ、SpeⅠ雙酶切驗(yàn)證，1%瓊脂糖電泳檢測到大小約為 2 500 和 5 200 bp 的條帶，符合預(yù)期（圖 3A）。將篩選出來的基因敲除菌株進(jìn)行PCR 鑒定，以野生型菌株和突變菌株基因組DNA 為模板，用引物248F 和248R 進(jìn)行擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示，野生型菌株擴(kuò)增出大約300 bp 的條帶，基因敲除菌株未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖3B）。表明敲除載體上的片段248s-Tc通過雙交換整合入苜蓿中華根瘤菌基因組并取代了SM2011_c06248基因。將突變株命名為SM∷248。

將構(gòu)建的基因載體pJQ200SK-ntrC-Tc進(jìn)行BamHⅠ、EcoRⅠ雙酶切驗(yàn)證，1%瓊脂糖電泳檢測到大小約為3 000 和5 000 bp 的條帶，符合預(yù)期（圖3C）。將篩選出來的SM2011_c06248、ntrC基因雙敲除菌株進(jìn)行PCR 鑒定，以SM∷248 和雙突變菌株基因組DNA 為模板，以NtrCq-F、NtrCq-R為引物，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示SM∷248 菌株擴(kuò)增出約1 000 bp的條帶，雙突變菌株未擴(kuò)增出目標(biāo)條帶（圖3D）。結(jié)果表明敲除載體上的片段ntrC-Tc通過雙交換整合入SM∷248基因組并取代了ntrC基因。將突變株命名為SM∷248-NtrC。

圖3 SM2011_c06248基因敲除菌株和SM2011_c06248、ntrC雙突變菌株鑒定Fig.3 SM2011_c06248 gene knockout strain and identification of SM2011_c06248,ntrC double mutant strain

2.3 基因過表達(dá)載體及菌株的鑒定

將構(gòu)建的過表達(dá)載體pBBR1MCS-3-dld-248進(jìn)行PstⅠ、SacⅠ雙酶切驗(yàn)證，1%瓊脂糖電泳檢測到大小約為500和5 200 bp的條帶，符合預(yù)期的酶切條帶大?。▓D4A）。將篩選出來的過表達(dá)菌株進(jìn)行菌落PCR 鑒定，以篩選的過表達(dá)菌株為模板，以dldF、248R1為引物，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果擴(kuò)增出約500 bp的條帶（圖4B）。結(jié)果表明過表達(dá)載體pBBR1MCS-3-dld-248成功導(dǎo)入苜蓿中華根瘤菌，并穩(wěn)定存在，將其命名為SM:dld-248。

圖4 SM2011_c06248基因過表達(dá)載體及過表達(dá)菌株的鑒定Fig.4 SM2011_c06248 gene overexpression vector and identification of overexpression strain

2.4 基因過表達(dá)載體及菌株的鑒定

苜蓿中華根瘤在硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后分別進(jìn)行富氮和非富氮處理，分別在0、10、20、30、60和120 min后取樣，對SM2011_c06248基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RNA 豐度分析，由圖5 可知，在自然生長條件下該ncRNA 豐度無明顯變化，在富氮培養(yǎng)條件下其豐度呈先升高后降低的趨勢，表明苜蓿中華根瘤菌能響應(yīng)外界氮元素變化，進(jìn)而調(diào)節(jié)SM2011_c06248基因的表達(dá)以適應(yīng)外界環(huán)境的變化。

圖5 Nortern blot圖結(jié)果圖Fig.5 Nortern blot results

2.5 基因敲除菌株SM∷248 與野生菌株氮代謝相關(guān)基因表達(dá)差異分析

自然生長條件下野生型菌株ncRNASM2011_c06248表達(dá)水平變化無明顯規(guī)律（圖6A）；30 ℃富氮培養(yǎng)條件下野生型菌株SM2011_c06248自身表達(dá)水平先短暫降低，10 min 時降至最低，然后升高，富氮處理30 min 達(dá)到峰值，后持續(xù)降低（圖6B）。與自然生長相比，富氮處理后SM2011_c06248的表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖6C）。30 ℃富氮培養(yǎng)條件下，野生型菌株ntrC基因表達(dá)水平先降低，10 min 時降至最低，然后升高，30 min 時達(dá)到峰值，后持續(xù)降低（圖6D），nar基因表達(dá)水平呈相似變化趨勢（圖6E）。30 ℃富氮培養(yǎng)條件下基因敲除菌株SM∷248NtrC基因表達(dá)量顯著低于野生型，nar基因表達(dá)水平也顯著低于野生型（圖6D）。表明SM2011_c06248基因可響應(yīng)外界氮元素變化，敲除SM2011_c06248基因?qū)е缕鋵Φx調(diào)控功能喪失，在富氮脅迫條件下失去對氮代謝調(diào)控蛋白NtrC、Nar的調(diào)控功能。

圖6 基因敲除菌株SM∷248氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量Fig.6 Gene expression levels related to nitrogen metabolism in SM∷248

2.6 過表達(dá)菌株SM∷dld-248 與野生菌株氮代謝相關(guān)基因表達(dá)差異分析

如圖7所示，30 ℃富氮培養(yǎng)條件下，野生型菌株ntrC基因、nar基因表達(dá)水平先短暫降低，10 min 時降至最低，然后升高，富氮處理30 min 時達(dá)到峰值，后持續(xù)降低；過表達(dá)菌株SM∷dld-248 中ntrC基因、nar基因表達(dá)量顯著高于野生型。

圖7 基因過表達(dá)菌株SM∷dld-248氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量Fig.7 Gene overexpression strain SM∷dld-248 nitrogen metabolism-related gene expression

2.7 雙突變菌株SM∷248-NtrC 與野生菌株氮代謝相關(guān)基因表達(dá)差異分析

30 ℃富氮培養(yǎng)條件下，野生型菌株nar基因表達(dá)水平先短暫降低，10 min時降至最低，然后升高，富氮處理30 min 達(dá)到峰值，后持續(xù)降低；與野生型相比，雙突變菌株SM∷248-NtrCnar基因表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（圖8）。說明ntrC基因是nar基因的上位基因。

圖8 SM∷248-ntrC菌株氮代謝相關(guān)基因表達(dá)量Fig.8 SM∷248-ntrC strain nitrogen metabolism-related gene expression

3 討論

目前中華根瘤菌生物信息背景已明確[5]。Robledo 等[19]發(fā)現(xiàn)EcpR1 在不利環(huán)境下通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期以抵御逆境。在ncRNA 研究中使用較多的成熟技術(shù)有微陣列（microarray）、RNAseq、Northern 印跡（Northern blot）、實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（real time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）、熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization,FISH）、RNA 干 擾（RNA interference，RNAi）和RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation，RIP）等[20]。目前已有通過計算生物學(xué)的方法來預(yù)測RNA 與蛋白相互作用關(guān)系的報道[21]。lncPRO 只要求輸入RNA 和蛋白的一級序列，利用氨基酸和核苷酸的物理化學(xué)性質(zhì)來預(yù)測RNA 和蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)從而判斷兩者是否相互作用[22]。

最新研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌非編碼RNA（nitrogen fixation condition-inducible small ncRNA，NfiS）受氮限制條件誘導(dǎo)產(chǎn)生。RNA 分子伴侶Hfq依賴于NfiS 的表達(dá)，受σ 因子RpoN、氮代謝全局激活因子NtrC、nif 特異性激活因子NiftyA 的級聯(lián)調(diào)控。nifS 突變導(dǎo)致固氮酶活性降低，對滲透壓、氧化脅迫等更敏感。NfiS 直接與nifK mRNA 堿基互補(bǔ)配對，通過提高mRNA 的翻譯效率和半衰期最終增強(qiáng)固氮酶活性，相較于前人在固氮方面的發(fā)現(xiàn)，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ncRNASM2011_c06248能夠促進(jìn)基因ntrC、nar的表達(dá)，敲除ncRNASM2011_c06248則抑制基因ntrC、nar的表達(dá)，表明ncRNASM2011_c06248對脫氮代謝過程具有正調(diào)控作用。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)非編碼RNA 同樣參與脫氮代謝過程。為非編碼RNA參與氮代謝提供了新思路。

富氮培養(yǎng)條件下SM2011_c06248表達(dá)水平之所以短暫降低，可能的原因?yàn)楦坏幚韺甏嬖谝欢ù碳?，影響其正常的代謝過程。相比野生型，lncRNA 敲除菌株在富氮條件下ntrC、nar表達(dá)水平明顯下調(diào)，說明ncRNASM2011_c06248可調(diào)控ntrC、nar的功能，其響應(yīng)環(huán)境中氮元素信號變化參與脫氮代謝過程，對ntrC、nar基因的表達(dá)有正調(diào)控作用，且ntrC對nar有上位基因效應(yīng)，表明NtrC 蛋白對氮元素代謝的異化作用具有調(diào)控作用。張宇等[11]研究表明NtrC作為全局性調(diào)控因子對脫氮代謝過程具有正調(diào)控作用，本研究結(jié)果與其一致。故推測SM2011_c06248先調(diào)控ntrC的表達(dá)，然后NtrC 蛋白進(jìn)一步調(diào)控脫氮代謝過程重要酶基因nar的表達(dá)。目前已知ncRNA 作用機(jī)制有4 種 模 式 ，即 signal、decoy、guide、scaffold[23]，但SM2011_c06248對NtrC蛋白的具體調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。