郭曉璐，伍文彬，黃海波，李 想，胡蔣寧

(1.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，國家海洋食品工程技術(shù)研究中心，遼寧 大連 116034； 2.南昌大學(xué) 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，南昌 330047)

中華草龜，又稱烏龜、金龜?shù)?，主要分布在中國、韓國、日本等亞洲部分地區(qū)[1-2]，由于其適應(yīng)性強、易繁育、壽命長，經(jīng)常被用作食品和中藥材，具有很高的經(jīng)濟價值[3-4]。中華草龜富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，龜肉的粗蛋白質(zhì)中至少包含17種氨基酸，龜肉的脂肪中富含不飽和脂肪酸。據(jù)報道，龜?shù)鞍纂木哂卸喾N醫(yī)療作用，可以被用作抗氧化劑和抗腫瘤劑等[5]。龜甲是一味名貴的中藥，其主要含膠質(zhì)、角蛋白、脂肪、鈣鹽等多種營養(yǎng)成分[6]。

目前，隨著龜鱉養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模的不斷擴大，除了對龜甲、龜肉等有經(jīng)濟價值部位的傳統(tǒng)利用外，其他部位利用率不高，大多被丟棄，在某種程度上造成資源浪費且污染環(huán)境[7]。龜鱉副產(chǎn)物中含有許多重要的營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂類等，尤其是脂類中不飽和脂肪酸含量豐富[8]。因此，對龜鱉副產(chǎn)物中油脂的提取和利用有助于提高龜鱉資源的綜合利用率和商業(yè)價值。

近年來，水酶法因安全、環(huán)保、設(shè)備要求低等優(yōu)點[9-10]被廣泛應(yīng)用于植物種子中油脂的提取[11-15]，而目前還未見利用水酶法提取中華草龜內(nèi)臟油(ChinemysReevesiisviscera oil，CRVO)的相關(guān)研究報道。水酶法中酶的種類與添加量、酶解溫度、pH、酶解時間等因素均會顯著影響提油率[16-17]。因此，有必要探索從龜鱉副產(chǎn)物中高效提油的水酶法條件。

通過超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)能夠?qū)χ|(zhì)組成進行定性和定量分析，全面了解其營養(yǎng)價值并加以利用，并因其鑒定不同脂質(zhì)的可靠性，以及不同組分的高效率分離和離子抑制效果小等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用[18-20]。如Zhang等[21]利用此方法分析鮑魚不同部位的脂質(zhì)組成，共鑒定出10種類型，其中包括34種脂質(zhì)成分，如磷脂酰膽堿(PC)、甘油三酯(TAG)等。

針對中華草龜副產(chǎn)物，本文采用單因素實驗優(yōu)化了水酶法提取中華草龜內(nèi)臟油的工藝條件；同時，通過氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)和UPLC-ESI-Q-TOF-MS對中華草龜不同部位的脂質(zhì)進行全面的分析和評價，為有效提高中華草龜副產(chǎn)物的綜合利用，延長產(chǎn)業(yè)鏈以及增加龜鱉產(chǎn)業(yè)的附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中華草龜，安徽藍田龜鱉有限公司。

堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、中性蛋白酶，美國Sigma公司；甲醇、乙酸銨，均為色譜純，大連博諾有限公司；其他試劑均為分析純。

Agilent 7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；超高效液相色譜-電噴霧電離-四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀，德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水酶法提取中華草龜內(nèi)臟油

取中華草龜內(nèi)臟，洗凈、凍干、粉碎并真空包裝，置于-4℃冷藏，并在7 d內(nèi)使用。稱取一定量中華草龜內(nèi)臟凍干粉，添加一定量的純凈水和蛋白酶，調(diào)節(jié)至設(shè)定的溫度和pH，在旋轉(zhuǎn)水浴中磁力攪拌酶解一定時間后，95℃水浴10 min滅酶；取出并在7 800g離心10 min，用膠頭滴管吸出上層油相，烘干至恒重并記錄其質(zhì)量。按下式計算提油率(Y)。

Y=ma/mb×100%

(1)

式中：ma為中華草龜內(nèi)臟油的質(zhì)量，g；mb為原料的質(zhì)量，g。

1.2.2 脂質(zhì)的提取

采用Folch法[22]從中華草龜4個部位(肌肉、內(nèi)臟、脂肪塊、卵)提取脂質(zhì)。

1.2.3 脂質(zhì)脂肪酸組成分析

分別精確稱量提取的脂質(zhì)0.1 g，加入2.5 mL KOH溶液(500 g/L)和5 mL乙醇(95%)，在60℃磁力攪拌下加熱2 h進行皂化，然后冷卻到室溫用吸管吸走上層不皂化物，用3 mL正己烷洗滌下層液體6次，然后用6 mol/L HCl將下層液體pH調(diào)至2.0，再用3 mL正己烷重復(fù)提取脂肪酸；用去離子水洗滌正己烷提取物至中性，然后用吸管吸走下層水相，保留上層有機相，氮吹干燥。加入正己烷使其質(zhì)量濃度為10 mg/mL，再加入2.0 mL甲基化試劑(含1% H2SO4的色譜級甲醇)。在70℃水浴中磁力攪拌1 h，隨后冷卻至室溫并加入1 mL去離子水；靜置收集上層，過無水硫酸鈉后，過0.22 μm有機濾膜，進氣相色譜質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀進行分析，GC-MS分析條件見文獻[23]。

1.2.4 脂質(zhì)組成的測定

取一定量提取的脂質(zhì)溶于氯仿-甲醇(體積比1∶5)中，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，再用流動相B稀釋到200 μg/mL，過0.22 μm有機濾膜，待UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析[21]。

UPLC條件：Waters ACQUITY UPLC BEH C8柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相A為超純水，流動相B為甲醇-異丙醇 (體積比85∶15) ，流動相A、B中均含有0.1%的乙酸和10 mmol的乙酸銨；洗脫梯度為0～1 min 70% B，1～6 min 70%～75% B，6～10 min 75%～85% B，10～15 min 85%～88% B，15～32 min 88%～99.9% B，32～33 min 99.9%～75% B，33～35 min 75% B；流速0.4 mL/min；柱溫50℃；進樣量5 μL。MS條件：采用正離子模式，質(zhì)量掃描范圍(m/z)50～1 500，脫溶劑氣流量8 L/min，溶劑溫度200℃，噴霧器壓力0.2 MPa，毛細管電壓4 500 V，總循環(huán)時間1.2～1.8 s。儀器通過ESI-L低濃度調(diào)諧混合物進行校準。

1.2.5 脂質(zhì)種類的鑒別和定量

通過Bruker Q-TOF MS 系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，用甲酸鈉校準曲線校準脂質(zhì)的相對分子質(zhì)量。采用開源軟件MS-DIAL通過去卷積對小分子進行定性和定量，并且得到準確的相對分子質(zhì)量信息。通過分析保留時間、質(zhì)量精度和二級質(zhì)譜與譜庫(HMDB，ChEBI，F(xiàn)ooDB)的匹配度最終實現(xiàn)脂質(zhì)種類的鑒別。采用面積歸一化法確定脂質(zhì)的相對含量。通過序列方法對不同的樣品、不同的平行樣調(diào)整保留時間和質(zhì)荷比偏差。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

所有實驗均重復(fù)3次，結(jié)果以“平均值±標準差”表示。采用Origin9.5和SPSS16.0對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。其中主成分分析(PCA)采用SIMCA 13.0進行統(tǒng)計。樣品平均值之間的差異性使用Duncan法比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 水酶法提取中華草龜內(nèi)臟油的單因素實驗

2.1.1 酶的種類和酶解時間對提油率的影響

固定料液比1∶4、酶添加量0.5%(以中華草龜內(nèi)臟粉質(zhì)量計，下同)、酶解溫度55℃和pH 7，選用4種商業(yè)酶，按1.2.1方法提取中華草龜內(nèi)臟油，考察酶種類和酶解時間對中華草龜內(nèi)臟提油率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，隨著酶解時間的延長，4種蛋白酶的提油率均先增大后減小，堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶在酶解1.0 h時提油率達到最大，分別為(66.12±0.74)%和(64.29±0.70)%。而復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶的提油率在酶解2.0 h達到最大，分別為(62.76±0.44)%和(67.06±1.13)%。這可能與不同類型和來源的酶對蛋白質(zhì)的水解作用不同有關(guān)。酶解時間在影響提油率的同時，還影響油品的品質(zhì)，長時間加熱攪拌，可能會引起油品的氧化導(dǎo)致其品質(zhì)降低。因此，綜合考慮，選擇堿性蛋白酶對中華草龜內(nèi)臟油進行酶解提取，酶解時間為0.5 h。

圖1 酶的種類和酶解時間對提油率的影響

2.1.2 酶添加量、酶解溫度、pH和料液比對提油率的影響

在使用堿性蛋白酶、酶解時間0.5 h的條件下，采用水酶法提取中華草龜內(nèi)臟油，考察酶添加量、酶解溫度、pH和料液比對中華草龜內(nèi)臟提油率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2(a)可看出，隨著酶添加量的增加，提油率先增加后降低，在酶添加量為0.5%時，提油率最大。當酶添加量低時，酶量不夠?qū)е绿嵊吐实?；而當酶添加量增加時，酶逐漸過量，且酶與底物結(jié)合形成的復(fù)合物對酶形成反饋抑制作用，導(dǎo)致反應(yīng)速率降低[24]，提油率降低。綜合考慮，選擇酶添加量為0.5%。從圖2(b)、(c)可看出，隨著酶解溫度的升高和pH的增加，提油率呈明顯的先上升后下降趨勢，在55℃和pH 7時對中華草龜內(nèi)臟油的提取效果最佳。由圖2(d)可看出，料液比在1∶4時提油率最高，為63.56%，料液比過高和過低對提油率均有不利的影響，因為在料液比過高時存在稀釋效應(yīng)，在料液比過低時存在低流動性。

綜合考慮，確定水酶法提取中華草龜內(nèi)臟油的最優(yōu)工藝條件為：選用堿性蛋白酶，酶解時間0.5 h，酶添加量0.5%，酶解溫度55℃，pH 7和料液比1∶4。在最優(yōu)工藝條件下，經(jīng)驗證實驗提油率為(66.56±1.25)%。

2.2 不同部位脂質(zhì)脂肪酸組成(見表1)

由表1可看出：中華草龜肌肉、內(nèi)臟、脂肪塊和卵脂質(zhì)中共檢出包括同分異構(gòu)體在內(nèi)的16種脂肪酸，其中C18∶1n-9的含量最高，占4個部位脂質(zhì)中總脂肪酸的43.39%～50.66%；另外，含量相對較高的脂肪酸還有C16∶0(14.87%～20.82%)和C18∶2n-6(13.78%～17.40%)，同時還檢出一定量的二十碳五烯酸(EPA)(0.29%～0.60%)和二十二碳六烯酸(DHA)(0.36%～0.53%)。DHA和EPA是兩類重要的脂肪酸，有助于嬰兒的大腦發(fā)育，并具有抗癌、抗炎和抗衰老等功效。中華草龜4個部位脂質(zhì)中飽和脂肪酸含量為20.38%～29.53%，單不飽和脂肪酸含量為53.64%～64.57%，多不飽和脂肪酸含量為15.06%～18.16%。中華草龜脂質(zhì)的不飽和脂肪酸含量(70.49%～79.62%)較高，接近鱒魚魚油(72.6%～75.3%)[25]。

表1 中華草龜卵、內(nèi)臟、肌肉和脂肪塊脂質(zhì)的脂肪酸組成

2.3 不同部位脂質(zhì)組成

按1.2.4方法對中華草龜卵、內(nèi)臟、肌肉和脂肪塊的脂質(zhì)組成進行UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有脂質(zhì)在25 min內(nèi)溢出，并且甘三酯(TAG)主要在20～25 min被分離出來，而少量的鞘磷脂(SM)、磷脂(PC)和甘二酯(DAG)主要在7～14 min被分離出來，且TAG的種類和含量較多，而SM、PC和DAG種類和含量很少。圖3為通過正離子模式超高效液相色譜分離質(zhì)控樣的質(zhì)譜解卷積譜圖。

圖3 通過正離子模式超高效液相色譜分離質(zhì)控樣的質(zhì)譜解卷積譜圖

表2 中華草龜不同部位脂質(zhì)類別的相對含量

中華草龜卵脂質(zhì)中的PC含量最豐富，高達2.78%；而在脂肪塊和內(nèi)臟脂質(zhì)中，PC含量極少，這可能是由于這兩個部位中的細胞外脂質(zhì)含量較高，來自細胞膜或其他部分的脂質(zhì)含量低。

表3為中華草龜卵、內(nèi)臟、肌肉和脂肪塊脂質(zhì)中主要的TAG、DAG、PC和SM 組成和相對含量。

表3 中華草龜卵、內(nèi)臟、肌肉和脂肪塊脂質(zhì)中主要TAG、DAG、PC、SM組成和相對含量

續(xù)表3

2.4 脂質(zhì)主成分分析

圖4為中華草龜不同部位脂質(zhì)之間相關(guān)性的PCA結(jié)果。

由圖4(a)可看出，主成分1(82%)和主成分2(9%)的累積得分為91%，表明兩個成分可以較好地代表整體數(shù)據(jù)。內(nèi)臟脂質(zhì)和脂肪塊脂質(zhì)形成一簇，表明這兩個部位的脂質(zhì)組成相似，而與卵和肌肉的脂質(zhì)組成不同。結(jié)合圖4(b)可以發(fā)現(xiàn)：PC(14∶0/21∶1)獨立于其他物質(zhì)之外，并且沿著與卵脂質(zhì)簇矢量方向一致，表明卵脂質(zhì)中該物質(zhì)的含量較高；TAG(16∶1/18∶1/18∶2)、TAG(18∶2/18∶2/18∶2)和TAG(18∶1/18∶2/18∶2)形成簇并且其矢量方向表明這些物質(zhì)在肌肉脂質(zhì)中含量高于其他物質(zhì)；TAG(16∶0/16∶0/18∶1)、TAG(16∶0/18∶1/18∶1)和TAG(18∶0/18∶1/18∶1)形成一簇且矢量方向指向內(nèi)臟和脂肪塊脂質(zhì)，表明在內(nèi)臟和脂肪塊脂質(zhì)中這些物質(zhì)的含量較高。

3 結(jié) 論

本文首先采用單因素實驗優(yōu)化得到水酶法提取中華草龜內(nèi)臟油的工藝條件，即以堿性蛋白酶為酶解用酶、酶解時間0.5 h、酶添加量0.5%、酶解溫度55℃、pH 7和料液比1∶4，在此條件下提油率為(66.56±1.25)%。其次，分別采用GC-MS 和UPLC-ESI-Q-TOF-MS對中華草龜卵、內(nèi)臟、肌肉和脂肪塊脂質(zhì)的脂肪酸和脂質(zhì)組成進行分析，結(jié)果表明，不同部位的脂質(zhì)中不飽和脂肪酸含量均較高，并含有一定量的DHA和EPA。主要脂質(zhì)種類為TAG，同時含有少量DAG、PC和SM。PCA結(jié)果表明，脂肪塊和內(nèi)臟中的脂質(zhì)成分相似，但與卵和肌肉脂質(zhì)組成明顯不同。本研究通過對中華草龜脂質(zhì)的全面分析發(fā)現(xiàn)，龜鱉副產(chǎn)物具有作為食用油脂開發(fā)的潛力。