付思晗，齊玉堂，張維農(nóng)，賀軍波，張燕鵬，呂曉雅

(武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢430023)

玉米醇溶蛋白是玉米蛋白中的主要成分，因其氨基酸組成主要是疏水性氨基酸，如谷氨酰胺、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，而極性、帶電的酸性氨基酸和堿性氨基酸含量則很少，所以其具有特殊的溶解性，即在純水中的溶解度非常低[1]，而溶于乙醇溶液。玉米醇溶蛋白特殊的溶解性阻礙了其在食品行業(yè)的應(yīng)用。因此，很多研究利用殼聚糖、阿拉伯膠、果膠等多糖提高其親水性，從而提高乳液的穩(wěn)定性[2]。

研究表明，在低pH、低離子強(qiáng)度、高溫和長時(shí)間加熱條件下可促進(jìn)蛋白質(zhì)的展開，進(jìn)而形成纖維聚合物。Gao等[3]在pH 2.0、90℃條件下加熱乳清蛋白10 h后形成狀態(tài)良好的纖維聚合物。纖維聚合物的形成過程分為成核期、增長期和穩(wěn)定期，成核期形成的主要是纖維核[4]。纖維核屬于低聚物，具有高活化能和穩(wěn)定性[5]。乳清蛋白纖維核是一種具有高活化能的低聚物，是乳清蛋白纖維形成過程中一種穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，具有良好的溶解性和乳化性。乳清蛋白纖維核與玉米醇溶蛋白的復(fù)合納米粒能顯著提升玉米醇溶蛋白的水溶性、乳化性及穩(wěn)定性[6]。

Pickering乳液是指利用固體顆粒穩(wěn)定、不添加表面活性劑的乳液，近年來受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注[7]。然而，目前鮮有利用玉米醇溶蛋白顆粒穩(wěn)定Pickering乳液的研究。本文基于乳清蛋白纖維核的良好溶解性和乳化性，與玉米醇溶蛋白復(fù)配，并用于制備玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纖維核復(fù)合納米粒穩(wěn)定的Pickering乳液，探究不同復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液粒徑、微觀形貌、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性及流變學(xué)特性的影響，從而促進(jìn)玉米醇溶蛋白作為乳化劑制備Pickering乳液的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

微胚乳玉米，廣西益寶油料玉米開發(fā)有限公司；乳清蛋白，合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；鹽酸、氫氧化鈉、碘、碘化鉀，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；玉米油，購于超市；異硫氰胺熒光素、尼羅紅，Sigma-Aldrich 中國有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ME204/02電子天平、F20 pH 計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；冷凍干燥機(jī)，美國Labconco公司；Mastersizer 3000激光粒度儀，馬爾文帕納科公司；激光共聚焦顯微鏡，日本Olympus公司；多功能流變儀，美國TA公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 玉米醇溶蛋白的提取

將微胚乳玉米粉碎，過0.250 mm(60目)篩，按料水比1∶10加入去離子水，在60℃下加熱糊化15 min，加入1.5%淀粉酶酶解，攪拌。每10 min利用碘液檢測(cè)溶液中是否還有淀粉殘余，直至碘液不變藍(lán)，酶解結(jié)束，水洗，分離，所得沉淀在50℃下真空干燥10 h。

將脫淀粉樣品在50℃下以料液比1∶5加入正己烷攪拌1 h，抽濾，然后重復(fù)提取，直至殘油低于1%。將脫脂樣品以料液比1∶10加入80%乙醇溶液超聲40 min，離心，取上清液，加入與上清液等體積的4℃去離子水，靜置12 h，離心，將沉淀冷凍干燥，得到玉米醇溶蛋白。

1.2.2 乳清蛋白纖維核的制備

準(zhǔn)確稱取10 g乳清蛋白，溶于250 mL去離子水中，調(diào)節(jié)pH為2，在5 000 r/min條件下離心30 min，取上清液，測(cè)定蛋白質(zhì)含量，用去離子水稀釋，使蛋白質(zhì)含量為3%。然后調(diào)節(jié)pH為2, 在90℃水浴下加熱2 h，得到乳清蛋白纖維核[8-10]。

1.2.3 玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纖維核復(fù)合納米粒的制備

準(zhǔn)確稱取3.0 g玉米醇溶蛋白，溶于100 mL 70%乙醇溶液作為儲(chǔ)備液，將儲(chǔ)備液 pH調(diào)節(jié)至2.0。配制玉米醇溶蛋白與乳清蛋白纖維核質(zhì)量比2∶3的復(fù)合納米粒溶液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將混合液中乙醇除去，然后于4 000 r/min離心10 min，取上清液，使用激光粒度儀測(cè)定復(fù)合納米粒的粒徑和多分散性系數(shù)(PDI)，然后將上清液冷凍干燥，得到復(fù)合納米粒[11]。

1.2.4 復(fù)合納米粒乳化性的測(cè)定

為確定不同pH對(duì)復(fù)合納米粒乳化性的影響，分別將pH為2、7、12的15 mL 0.5%復(fù)合納米粒溶液與5 mL玉米油混合，使用高速分散機(jī)于10 000 r/min分散3 min。立即取底部乳液100 μL，加入到5 mL 0.1%SDS中混合均勻，以0.1%SDS為空白，在500 nm處測(cè)定吸光值(A)[12]。以玉米醇溶蛋白為對(duì)照。按下式計(jì)算乳化性(Es)。

(1)

式中：N為稀釋倍數(shù)；C為樣品中蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度；Φ為油相體積分?jǐn)?shù)。

1.2.5 Pickering乳液的制備

分別取1、2、3、4、5 g復(fù)合納米粒溶于100 mL去離子水中，充分?jǐn)嚢韬?，依次加?00 mL玉米油，于14 000 r/min高速剪切3 min，形成Pickering乳液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 Pickering乳液粒徑的測(cè)定

分別取制備的Pickering乳液，用Mastersizer 3000激光粒度儀進(jìn)行粒徑的測(cè)定。水和玉米油的折射率分別是1.33和1.47。乳液的粒徑以面積平均徑(d(3,2))及體積平均徑(d(4,3))表示[13]。

1.2.7 Pickering乳液微觀形貌的表征

使用異硫氰胺熒光素和尼羅紅進(jìn)行染色，以異丙醇為溶劑配制1 mg/mL的異硫氰胺熒光素和尼羅紅溶液， 在1 mL Pickering乳液中分別加入20 μL異硫氰胺熒光素溶液和10 μL尼羅紅溶液，混勻，取10 μL染色后的乳液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片后使用激光共聚焦顯微鏡觀察乳液的微觀形貌，其中尼羅紅染色激發(fā)波長為488 nm，異硫氰胺熒光素染色激發(fā)波長為543 nm[14]。

1.2.8 Pickering乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

將Pickering乳液常溫儲(chǔ)存于5 mL儲(chǔ)藏瓶中，在儲(chǔ)藏0、5 d時(shí)測(cè)定粒徑。

1.2.9 Pickering乳液的表觀黏度

使用多功能流變儀測(cè)定Pickering乳液的表觀黏度[15]。測(cè)定條件：模具平板為PU40 mm，剪切速率0.1～10 s-1，間隙1 mm，25℃平衡5 min。

1.2.10 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 2018軟件繪圖，SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析。顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合納米粒的粒徑與PDI值

玉米醇溶蛋白與乳清蛋白纖維核質(zhì)量比2∶3制備的復(fù)合納米粒的粒徑為(205.0±4.2)nm，PDI值為0.198±0.009，表明復(fù)合納米粒呈均一的納米分散體系。

2.2 pH對(duì)復(fù)合納米粒乳化性的影響

pH對(duì)玉米醇溶蛋白和復(fù)合納米粒乳化性的影響如圖1所示。

圖1 pH對(duì)玉米醇溶蛋白和復(fù)合納米粒乳化性的影響

由圖1可知，隨著pH的增加，玉米醇溶蛋白的乳化性先減弱后增強(qiáng)， pH為7時(shí)乳化性最弱，因?yàn)榇藭r(shí)pH接近玉米醇溶蛋白的等電點(diǎn)(pI 6.2～6.8)[16]，分子之間的相互作用力減弱，液滴容易發(fā)生聚集，從而乳化性減弱，該結(jié)果與吳娜娜等[17]的研究結(jié)果一致。乳清蛋白纖維核有著良好的乳化性，與乳清蛋白纖維核復(fù)配后，玉米醇溶蛋白在不同pH下乳化性都有顯著改善，其中中性條件下乳化性增強(qiáng)最為明顯，可能是因?yàn)閺?fù)配后等電點(diǎn)降低，在pH為7時(shí)蛋白質(zhì)分子之間凈電荷增加，相同電荷相互排斥，蛋白質(zhì)顆粒凝聚減少，故液滴之間聚集減少，乳化性增強(qiáng)。因此，選擇在中性條件下制備Pickering乳液。

2.3 Pickering乳液體系的確定

采用異硫氰胺熒光素和尼羅紅分別對(duì)蛋白質(zhì)和油相進(jìn)行染色，然后，使用激光共聚焦顯微鏡觀察乳液液滴的分布情況。結(jié)果顯示，水相中較均勻地分布著油相液滴，復(fù)合納米粒包裹在油滴上，制備的Pickering乳液為水包油型乳液。

2.4 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液粒徑的影響

復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液粒徑的影響如圖2所示。

圖2 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液粒徑的影響

復(fù)合納米粒添加量為1、2、3、4、5 g時(shí)，Pickering乳液的d(3,2)分別為7.16、4.21、3.85、2.74、3.10 μm。所有乳液的平均粒徑都在10 μm以下，隨著復(fù)合納米粒添加量的增加，乳液的平均粒徑先減小后稍增大(見圖2)。這與王麗娟[18]的研究結(jié)果相似。在復(fù)合納米粒添加量較低時(shí)，顆粒多吸附于油滴表面，此時(shí)顆粒較少，乳液體系并不穩(wěn)定，油滴易聚集，故粒徑較大。在一定范圍內(nèi)，隨著復(fù)合納米粒添加量的增加，顆粒間排斥增強(qiáng)，油滴不易聚集，粒徑變小。當(dāng)達(dá)到最小粒徑時(shí)，增加復(fù)合納米粒添加量不會(huì)使粒徑繼續(xù)變小。

2.5 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液微觀形貌的影響

復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液微觀形貌的影響如圖3所示。由圖3可知，Pickering乳液中油滴均為球型，復(fù)合納米粒添加量少時(shí)，油滴大小不均一，體積較大的油滴周圍圍繞著體積較小的油滴，隨著復(fù)合納米粒添加量增大，提高了油滴間的排斥力，導(dǎo)致油滴尺寸變小和均勻度變好。在復(fù)合納米粒添加量為4 g時(shí)，油滴的粒徑最小且最均一，這與粒徑測(cè)定結(jié)果一致。

圖3 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液微觀形貌的影響

2.6 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響

不同復(fù)合納米粒添加量的Pickering乳液儲(chǔ)藏0 d和5 d的粒徑如表1所示。

由表1可知，儲(chǔ)藏5 d后，不同添加量的復(fù)合納米粒穩(wěn)定的Pickering乳液粒徑都有所增加，但添加量大的乳液粒徑始終較小。添加量為4 g和5 g的復(fù)合納米粒穩(wěn)定的Pickering乳液在儲(chǔ)藏5 d后粒徑趨于一致。添加量為1～3 g的復(fù)合納米粒穩(wěn)定的Pickering乳液在儲(chǔ)藏1 d后出現(xiàn)明顯的分層現(xiàn)象，乳液上浮，水相析出，說明體系不穩(wěn)定。儲(chǔ)藏5 d后，添加量為4 g和5 g的復(fù)合納米粒穩(wěn)定的Pickering乳液也出現(xiàn)分層現(xiàn)象，但隨著添加量的上升，乳析速率變緩。添加量為1 g的乳液水相析出明顯，而添加量為5 g時(shí)乳液出現(xiàn)分層但界面并不明顯，這說明提高復(fù)合納米粒添加量有利于提高乳液的穩(wěn)定性，因?yàn)樘砑恿看?，濃度增加，從而形成了凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，而這種結(jié)構(gòu)對(duì)乳液穩(wěn)定性十分重要[19-20]。

表1 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響

2.7 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液表觀黏度的影響

復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液表觀黏度的影響如圖4所示。

圖4 復(fù)合納米粒添加量對(duì)Pickering乳液表觀黏度的影響

由圖4可知，隨著剪切速率的增大，乳液的表觀黏度逐漸減小，為非牛頓流體中的假塑性流體。隨著復(fù)合納米粒添加量的增大，溶液的表觀黏度先減小后增大。可能是因?yàn)樵趶?fù)合納米粒添加量較低時(shí)，顆粒量不足以維持界面的穩(wěn)定[21]，油滴易于聚集，從而黏度較大；隨著復(fù)合納米粒添加量增大，乳液達(dá)到最小粒徑的過程中，油滴逐漸均一，流動(dòng)阻力減小，使黏度減?。淮撕髲?fù)合納米粒添加量繼續(xù)增大，不需要維持界面穩(wěn)定的顆粒增多，這些顆粒相互聚集，使黏度增大。

3 結(jié) 論

為了改善玉米醇溶蛋白的水溶性和乳化性，利用反溶劑共沉淀法制備了玉米醇溶蛋白/乳清蛋白纖維核復(fù)合納米粒，并將其用于制備Pickering乳液。結(jié)果表明：玉米醇溶蛋白與乳清蛋白纖維核復(fù)合后，乳化性明顯提升，制備的Pickering乳液為水包油型乳液；在中性條件下Pickering乳液穩(wěn)定性更佳；復(fù)合納米粒添加量分別為1、2、3、4、5 g時(shí)，Pickering乳液的d(3,2)分別為7.16、4.21、3.85、2.74、3.10 μm，粒徑先減小后稍增大；復(fù)合納米粒添加量為4 g時(shí)Pickering乳液的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性較好；隨著復(fù)合納米粒添加量的增大，Pickering乳液的表觀黏度先減小后增大。