黃 峰，孫 昕，位文倩，李鵬飛

(西安建筑科技大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，西北水資源與環(huán)境生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710055)

微藻是一種生長速度快、生存環(huán)境要求低、光合效率高、含有較高油脂的單細(xì)胞生物，在其生長過程中也能固定二氧化碳，從而減輕全球氣候變暖問題[1-2]。近年來，微藻作為一種極具有潛力的生物燃料原料被廣泛討論，微藻生物質(zhì)能源的發(fā)展對于我國在2060年實(shí)現(xiàn)碳中和的目標(biāo)具有重要意義。

盡管微藻作為生物柴油原料具有很多的優(yōu)勢，但是其商業(yè)化生產(chǎn)仍然存在著一些障礙，比如低脂質(zhì)產(chǎn)率和高運(yùn)營成本的問題，導(dǎo)致其發(fā)展水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于預(yù)期[3]。因此，獲得高生物量和高油脂含量的藻株對降低微藻生物柴油的生產(chǎn)成本至關(guān)重要[4]。目前已經(jīng)開發(fā)了多種微藻培養(yǎng)策略來增強(qiáng)微藻的油脂含量，例如化學(xué)脅迫，常見的氮或磷脅迫就是一種簡單經(jīng)濟(jì)的提高微藻油脂含量的方法[5-6]，但是營養(yǎng)元素的缺乏會抑制藻細(xì)胞生長，降低生物量，顯著降低油脂產(chǎn)率[7]。微藻誘變育種技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于許多不同藻類，以獲得能穩(wěn)定遺傳的高脂質(zhì)產(chǎn)率突變株[8]。常壓室溫等離子體誘變作為一種新型的物理誘變技術(shù)，其與紫外線、X射線、碳離子束等傳統(tǒng)誘變技術(shù)相比，操作更加簡單且安全，等離子體產(chǎn)生的活性粒子可以透過細(xì)胞膜與胞內(nèi)脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等發(fā)生反應(yīng)從而引起DNA突變，突變效率也遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他誘變[9-10]。曹旭鵬等[11]在輸入電流1.4 A、誘變時間30 s的條件下，獲得的等鞭金藻突變株油脂含量提高了11%。Fang等[12]在輸入功率100 W、作用時間60 s條件下，誘變所得的突變株碳水化合物較原始株提高了22%。在不同條件下，等離子體設(shè)備可能會產(chǎn)生不同活性和濃度的等離子體，而等離子體對不同的微藻有其獨(dú)特的作用機(jī)制，因此有必要尋找針對不同微藻的適宜誘變條件。

目前等離子體誘變應(yīng)用于雙對柵藻的研究較少，本研究通過在不同輸入電壓條件下產(chǎn)生等離子體，對雙對柵藻進(jìn)行誘變，確定了最適的誘變條件，并通過測定突變株生物量、光合性能、生化組分等指標(biāo)，分析了等離子體誘變促進(jìn)雙對柵藻油脂積累的可能途徑，為后續(xù)的高脂質(zhì)產(chǎn)率微藻的定向基因改造提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)基

雙對柵藻，購于中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。

液體培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基，在BG11培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂粉用作固體培養(yǎng)基，每次配制完成后調(diào)節(jié)pH為7，121℃滅菌30 min。

1.1.2 儀器與設(shè)備

CTP-2000K等離子體誘變儀，UV-6000紫外分光光度計(jì)，F(xiàn)-7000熒光分光光度計(jì)(日本日立)，IMAGING-PAM調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)(Heinz Walz GmbH公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 雙對柵藻的培養(yǎng)

將含有100 mL雙對柵藻藻液的250 mL培養(yǎng)瓶用無菌透氣封口膜封口，置于恒溫光照培養(yǎng)箱(溫度25℃)培養(yǎng)，平均光照強(qiáng)度80 μmol/(m2·s)，光照周期12 L/12 D，每天隨機(jī)調(diào)換培養(yǎng)瓶的位置并搖動3～4次使藻液分布均勻。

1.2.2 等離子體誘變及篩選

將藻液濃度調(diào)整至約1×106mL-1，取100 μL藻液置于滅菌的培養(yǎng)皿，在發(fā)射器與樣品的距離為2 mm、電流1 A、空氣流量5 L/min、誘變時間60 s條件下，分別調(diào)節(jié)電壓為0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 V，對雙對柵藻進(jìn)行誘變，誘變后立即測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)。將誘變后的藻液稀釋涂布于固體平板上培養(yǎng)，以存活率低于10%為指標(biāo)初選藻株進(jìn)行孔板培養(yǎng)，以培養(yǎng)3 d和8 d的藻液在680 nm處的吸光度計(jì)算比生長速率，測定培養(yǎng)8 d藻液的甘油三酯含量。經(jīng)兩步篩選即第一步篩選出比生長速率和相對熒光值均高于原始株的突變株，第二步選擇比生長速率或者相對熒光值特別突出的突變株，再將篩選出的突變株重復(fù)上述孔板培養(yǎng)過程，驗(yàn)證穩(wěn)定性，最終篩選出遺傳穩(wěn)定的優(yōu)勢突變株[13]。篩選的突變株按1.2.1方法培養(yǎng)35 d。

1.2.3 微藻生物量的測定

生物量即單位體積藻液內(nèi)的藻細(xì)胞干重，生物質(zhì)產(chǎn)率即單位時間內(nèi)生物量的增長量。將穩(wěn)定期雙對柵藻藻液分別稀釋成20 mL不同質(zhì)量濃度梯度的藻液，測定每個質(zhì)量濃度下的藻液在680 nm處的吸光度(A)和經(jīng)離心干燥恒重后的生物量(Y)，繪制生物量與吸光度之間的校準(zhǔn)曲線，得到曲線方程為Y=310.4A-19.7(R2=0.999)。通過測定不同培養(yǎng)時間下藻液的吸光度，代入曲線方程中計(jì)算生物量。

1.2.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)及色素含量測定

采用調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)測定雙對柵藻的最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、實(shí)際量子產(chǎn)量(Y(II))[14]。

取5 mL藻液于裝有5 mL 95%乙醇溶液的離心管中，在75℃水浴15 min后，于5 000 r/min離心10 min，取上清液，測定其在665、649、470 nm處的吸光度，再測定其經(jīng)鹽酸化后相應(yīng)波長處的吸光度，以酸化前后吸光度差計(jì)算色素含量，具體方法參照文獻(xiàn)[15]。

1.2.5 甘油三酯產(chǎn)量和總脂含量測定

采用優(yōu)化的尼羅紅法[16]測定雙對柵藻生長過程中甘油三酯產(chǎn)量，采用改進(jìn)的Bligh-Dyer法測定其總脂含量[17]。

1.2.6 碳水化合物含量和蛋白質(zhì)含量測定

采用苯酚-硫酸法[18]測定雙對柵藻碳水化合物含量(以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)溶液)。采用考馬斯亮藍(lán)法[19]測定雙對柵藻蛋白質(zhì)含量(以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)溶液)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同輸入電壓對雙對柵藻生長的影響

葉綠素?zé)晒饪梢宰鳛楣夂贤蛔凅w的篩選指標(biāo)[20]，F(xiàn)v/Fm反映植物的潛在光合能力，常用來反映微藻生長中的光合活性變化以及所受的外界環(huán)境脅迫程度[21]。不同輸入電壓下誘變對雙對柵藻的Fv/Fm和存活率的影響如圖1所示。

圖1 不同輸入電壓下誘變雙對柵藻的Fv/Fm、存活率

從圖1可以看出，F(xiàn)v/Fm隨著輸入電壓的升高呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，說明在短時間內(nèi)雙對柵藻所受到的脅迫程度逐漸加深。當(dāng)輸入電壓為140 V時，F(xiàn)v/Fm較初始值下降73.2%；當(dāng)輸入電壓高于160 V時，F(xiàn)v/Fm已接近0，這說明藻細(xì)胞受到較大的損害可能無法繼續(xù)生長。從存活率曲線可以看出，當(dāng)輸入電壓從60 V升至140 V時，存活率顯著下降，從83.9%下降至5.4%，160 V時存活率僅為2.5%，180 V以上時幾乎沒有存活藻株。圖1所示結(jié)果說明，隨著輸入電壓增大，藻細(xì)胞所受損害的程度加劇，可能是等離子體系統(tǒng)所產(chǎn)生的活性粒子濃度增加導(dǎo)致。根據(jù)誘變育種理論，通常存活率小于10%時可獲得更高的正突變率[22]。在本實(shí)驗(yàn)中，為了確保藻細(xì)胞光系統(tǒng)不受致命損害，平板上有足夠的可供挑選的藻株，選擇輸入電壓140 V條件下存活的藻株進(jìn)行兩步篩選，最終篩選出比生長速率和甘油三酯含量均高于原始株的突變株T-2、T-5和僅甘油三酯含量顯著提高的突變株T-6進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，并進(jìn)一步分析原始株與突變株之間的差異。

2.2 誘變對雙對柵藻生物量積累的影響(見圖2)

從圖2可以看出：在開始培養(yǎng)期間，原始株與突變株均以較高的速率增長；培養(yǎng)7 d左右，突變株T-2、T-5生長優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，直至培養(yǎng)35 d，突變株T-2、T-5的最高生物量分別達(dá)到788.9、764.1 mg/L，分別比原始株(672.5 mg/L)提高17.3%、13.6%。在培養(yǎng)前期，突變株T-6生物量積累慢于原始株，但T-6在培養(yǎng)29 d之后仍保持緩慢生長，而原始株此時已達(dá)到穩(wěn)定期，在培養(yǎng)結(jié)束時T-6生物量達(dá)到699.5 mg/L。實(shí)驗(yàn)表明，在適宜的輸入電壓下產(chǎn)生等離子體，可以誘變微藻，促進(jìn)微藻生物量積累。原因可能是在合適的電壓下，產(chǎn)生了含有適宜濃度的活性氧或活性粒子的等離子體。一方面，等離子體誘變使突變株的對數(shù)生長期延長，從而提高生長末期的生物量；另一方面，等離子體在損傷細(xì)胞的同時，也激發(fā)了更大的細(xì)胞自身修復(fù)作用，從而刺激藻細(xì)胞增殖，這與Rana等[23]的研究結(jié)果相似。等離子體誘變應(yīng)用于其他微藻中也有不同的效果，如：Cao等[24]利用等離子體誘變獲得的小球藻突變株平均生物量較原始株增加了7.75%；Fang等[12]通過等離子體誘變螺旋微藻獲得1株突變株，生長速率提高了10.3%。

圖2 突變株與原始株的生物量積累曲線

2.3 誘變對雙對柵藻色素含量及光合性能的影響

為了進(jìn)一步研究突變株與原始株在生物量增長上的差異，對突變株與原始株的色素含量和光合性能參數(shù)進(jìn)行了測定。光合色素是微藻在光合作用中捕獲光能的色素，對微藻生長起重要作用[25]。培養(yǎng)35 d的突變株與原始株的色素含量見圖3。

圖3 培養(yǎng)35 d的突變株與原始株色素含量

從圖3可以看出：在培養(yǎng)35 d時，突變株T-2、T-5的葉綠素a含量分別為13.5、12.8 mg/L，略高于原始株的11.8 mg/L，葉綠素b含量無明顯差異；突變株T-2、T-5、T-6的類胡蘿卜素含量分別為6.1、5.8、5.6 mg/L，均較原始株的5.3 mg/L有所增加，這可能是突變株對等離子體誘變所做出的抵抗應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果。因此，可能是光合色素含量增加使藻細(xì)胞光合活性提高，從而提高了突變株生物量的積累。

突變株與原始株實(shí)際量子產(chǎn)量(Y(Ⅱ))與最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)變化趨勢如圖4所示。

從圖4可以看出：在生長前期，F(xiàn)v/Fm與Y(Ⅱ)均有短暫的下降，隨著藻細(xì)胞增殖，細(xì)胞密度不斷增大，捕獲光能的能力也逐漸加強(qiáng)，二者呈現(xiàn)出上升趨勢并在培養(yǎng)22 d達(dá)到最大值；在培養(yǎng)后期，二者均有小幅度的下降，可能是后期藻細(xì)胞大量增殖，藻類之間發(fā)生遮蔽效應(yīng)，導(dǎo)致光照不均，或是后期營養(yǎng)物質(zhì)減少，引起光合效率下降。在整個培養(yǎng)過程中，突變株T-2的Y(Ⅱ)均高于原始株，突變株T-6的Y(Ⅱ)均小于原始株，與圖2所示生物量變化趨勢類似。在培養(yǎng)后期，4個藻株的Fv/Fm均保持在0.5～0.7正常范圍內(nèi)[26]，說明藻株基本適應(yīng)了等離子體輻射產(chǎn)生的脅迫。

2.4 誘變對雙對柵藻脂質(zhì)積累的影響

突變株與原始株的甘油三酯積累曲線如圖5所示。

圖5 突變株與原始株甘油三酯積累曲線

從圖5可以看出，甘油三酯積累與生物量積累保持著一致性，從培養(yǎng)5 d開始，甘油三酯積累速率明顯加快，但是突變株與原始株在甘油三酯積累上的差異也逐漸加大，突變株T-6在甘油三酯積累上的優(yōu)勢最為突出。培養(yǎng)30 d后，藻株生長逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，甘油三酯的積累量也趨于穩(wěn)定，突變株T-2、T-5、T-6 最高甘油三酯產(chǎn)量分別達(dá)到229.7、263.0、283.6 mg/L，較原始株的165.5 mg/L分別提高了38.8%、58.9%、71.3%。

甘油三酯產(chǎn)量反映藻細(xì)胞內(nèi)中性脂含量，還需結(jié)合總脂含量和總脂產(chǎn)率作為評估微藻生產(chǎn)生物柴油潛力的重要指標(biāo)[27]。培養(yǎng)35 d的突變株與原始株生物量、生物質(zhì)產(chǎn)率、總脂含量和總脂產(chǎn)率如圖6所示。

圖6 培養(yǎng)35 d的突變株與原始株生物量、生物質(zhì)產(chǎn)率、總脂含量、總脂產(chǎn)率

由圖6可以看出，原始株和突變株T-2、T-5、T-6的總脂含量分別為25.9%、32.4%、38.2%、42.7%。突變株T-2、T-5、T-6的總脂產(chǎn)率分別達(dá)到7.3、8.3、8.5 mg/(L·d)，較原始株的5.0 mg/(L·d)分別提高了46%、66%、70%。說明在此條件下的等離子體誘變明顯促進(jìn)了雙對柵藻的總脂積累。

2.5 誘變對雙對柵藻碳水化合物和蛋白質(zhì)積累的影響(見圖7)

微藻的生化組分主要包括脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物，三者之間保持著動態(tài)的平衡，脂質(zhì)含量的提升必然會導(dǎo)致其他成分的降低[28]。從圖7(a)可以看出，隨著培養(yǎng)時間的延長，碳水化合物不斷積累，原始株和突變株T-2、T-5、T-6在生長末期碳水化合物含量分別為79.6、89.3、83.6、81.5 mg/L，分別占生物量干重的11.8%、11.3%、10.9%、11.7%，說明誘變并沒有明顯影響雙對柵藻的碳水化合物合成。從圖7(b)可以看出，突變株蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，突變株T-2、T-5、T-6蛋白質(zhì)含量在培養(yǎng)21 d時達(dá)到最大，分別為175.7、170.3、166.1 mg/L，之后3株突變株蛋白質(zhì)含量發(fā)生了不同程度的下降，待培養(yǎng)結(jié)束時，突變株T-2、T-5、T-6蛋白質(zhì)含量較原始株分別下降了15.2%、24.4%、31.8%。這說明誘變可能影響了雙對柵藻的蛋白質(zhì)代謝途徑，在培養(yǎng)后期突變株可能是以消耗蛋白質(zhì)為代價來促進(jìn)油脂的積累。Williams等[29]通過監(jiān)測在不同氮磷比的培養(yǎng)基中生長的微擬球藻發(fā)現(xiàn)，在低氮磷比的情況下，蛋白質(zhì)含量較正常時下降了30.3%，而總脂質(zhì)是對照組的2倍。藻細(xì)胞內(nèi)不同組分之間的相互變化，可能是由于等離子體所產(chǎn)生的活性粒子對藻細(xì)胞內(nèi)調(diào)控相關(guān)組分代謝的部分基因產(chǎn)生突變，導(dǎo)致油脂快速積累，后續(xù)還需對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析進(jìn)一步確定差異基因表達(dá)，以便更好地闡明誘變對雙對柵藻代謝途徑的影響。

3 結(jié) 論

對雙對柵藻進(jìn)行不同輸入電壓條件下的等離子體誘變，確定了最適誘變條件為140 V，篩選出突變株T-2、T-5、T-6，分析了它們與原始株之間的生物量積累、光合性能以及油脂積累的差異。在培養(yǎng)至35 d時，突變株T-2、T-5生物量分別達(dá)到788.9、764.1 mg/L，較原始株(672.5 mg/L)分別提高了17.3%、13.6%，突變株T-6的生物量為699.5 mg/L，較原始株略有提升，誘變并未對突變株的葉綠素?zé)晒馓匦詤?shù)產(chǎn)生較大影響，突變株均保持著良好的光合性能。突變株T-2、T-5、T-6培養(yǎng)35 d的總脂產(chǎn)率較原始株分別提高了46%、66%、70%，蛋白質(zhì)含量較原始株都有不同程度的下降。突變株T-5的總脂產(chǎn)率與T-6相差不大，但其生物量比T-6高9.24%，因此突變株T-5更具產(chǎn)業(yè)化潛力。