黎妍妍，李春黎，楊小瓊，陳守文，李錫宏*，楊 勇*

1. 湖北省煙草科學(xué)研究院，武漢市硚口區(qū)寶豐路6 號香溢大酒店4 樓 430030

2. 湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢市武昌區(qū)友誼大道368 號 430062

煙草青枯病是由土傳病原菌青枯勞爾氏菌（R.solanacearum）引起，每年給煙葉生產(chǎn)造成巨大的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。因此煙草青枯病防治也成為煙葉生產(chǎn)中亟待解決的問題和研究熱點(diǎn)。有研究表明，一些土傳病害發(fā)生區(qū)域中存在發(fā)病較輕或不發(fā)病的地塊，稱為抑病型土壤（Suppressive soil）［3-4］。在這種土壤中病原菌不易定殖，或雖能定殖但危害很小或不產(chǎn)生危害，或能定殖并一時(shí)造成危害但隨后即使在病原菌存在的情況下發(fā)病也很輕。與之相對應(yīng)的是導(dǎo)病型土壤（Conducive soil），即易發(fā)生病害的土壤。在抑病型土壤中，土壤微生物的數(shù)量、生物量、多樣性及活性等與土壤抑病性有關(guān)。Mendes等［5］試驗(yàn)證實(shí)在立枯絲核菌（R. solani）抑病型土壤中存在大量的變形菌、厚壁菌和放線菌，植物在受到病原菌侵染時(shí)，可利用這些微生物群落保護(hù)自己并抵抗病原菌的侵染。沈宗專［6］和鄧照亮［7］研究發(fā)現(xiàn)香蕉枯萎病及連作園抑病型土壤中芽胞桿菌屬（Bacillus）、酸桿菌屬（Acidobacterium）、木霉菌屬（Trichoderma）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對豐度顯著高于導(dǎo)病型土壤，而致病菌鐮刀菌屬（Fusarium）的相對豐度卻顯著低于導(dǎo)病型土壤?？梢?，抑病型土壤的抑病能力與土壤中特定的有益微生物富集有關(guān)［8］。目前，關(guān)于青枯病抑病型和導(dǎo)病型土壤的相關(guān)研究主要集中在兩種類型土壤中微生物結(jié)構(gòu)的差異等方面［9-10］，而對于其中有益微生物的差異分析方面則鮮見報(bào)道。為此，對連作多年的煙草青枯病抑病型煙田和導(dǎo)病型煙田進(jìn)行了青枯病發(fā)病情況調(diào)查及土壤中有益和致病微生物的組成分析，以期為挖掘青枯病拮抗微生物資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)及樣品采集

供試土壤取自湖北省宣恩縣（北緯29.97°，東經(jīng)109.38°）煙田，連續(xù)種植煙草（云煙87）15 年以上。選擇海拔500 m（L500）、900 m（L900）和1 300 m（L1300）的種植區(qū)域，每區(qū)域包含抑病型土壤（SS）和導(dǎo)病型土壤（CS）各1 塊。于煙草移栽后70 d，按照五點(diǎn)取樣法采集煙株根際土壤。依據(jù)海拔高度和土壤類型，所采集樣品分別標(biāo)記為L500SS、L900SS、L1300SS和L500CS、L900CS、L1300CS。每田塊3次重復(fù)，共計(jì)采集18個(gè)土樣。土樣混勻后，將其置于干冰中帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱中，用于后續(xù)DNA的提取。

1.2 煙草青枯病病情調(diào)查

在采集土壤樣品的同時(shí)，調(diào)查煙草青枯病的發(fā)生情況。以株為單位，調(diào)查每株煙發(fā)病情況，并計(jì)算發(fā)病率。

1.3 土壤微生物群落分析

1.3.1 DNA提取和PCR擴(kuò)增

土壤總DNA 利用FastDNA Spin Kit 試劑盒（美國MP Biomedicals 公司）進(jìn)行提取，DNA 提取后經(jīng)PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物檢測合格后進(jìn)行文庫構(gòu)建，由諾禾致源生物信息科技有限公司通過Illumina Hiseq PE250 測序平臺測序，具體方法參考文獻(xiàn)［11］。

1.3.2 OTU聚類與物種注釋

所有樣品的Effective Tags 進(jìn)行聚類后以97%的一致性將序列聚類成為OTUs。參考文獻(xiàn)［11］進(jìn)行細(xì)菌物種和真菌物種的注釋分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0 中的T 檢驗(yàn)分析煙草青枯病發(fā)病率差異，用R軟件中的Amova（Analysis of molecular variance）分析土壤微生物群落組成的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草青枯病的發(fā)病情況分析

對不同海拔高度下抑病型和導(dǎo)病型土壤煙草青枯病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。結(jié)果（圖1a和圖1b）表明，L500、L900 和L1300 抑病型煙田煙草青枯病發(fā)病率分別為4.657%、3.573%和2.893%，土壤中青枯病原菌的相對豐度分別為 6.10×10-4、5.10×10-4和 3.60×10-4；L500、L900 和 L1300 的導(dǎo)病型煙田煙草青枯病發(fā)病率分別為32.853%、26.392%和21.893%，土壤中青枯病原菌的相對豐度分別為3.57×10-3、2.97×10-3和2.39×10-3。同一海拔高度下抑病型煙田煙草青枯病發(fā)病率和土壤青枯菌相對豐度均極顯著（p＜0.01）低于導(dǎo)病型土壤。

圖1 抑病型和導(dǎo)病型土壤青枯病發(fā)病率（a）和青枯菌相對豐度變化（b）Fig.1 Incidence of bacterial wilt（a) and the relative abundance of R. solanacearum（b）in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS）

2.2 土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化

圖2可知，在500 m、900 m和1 300 m海拔高度下抑病型和導(dǎo)病型土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)存在明顯差異，變形菌門（Proteobacteria）、子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的相對豐度在導(dǎo)病型土壤中較高，放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Fimicutes）、壺菌門（Chytridiomycota）和接合菌門（Zygomycota）的相對豐度在抑病型土壤中較高?；贐ray-Curtis 算法，通過Amova 分析了同一海拔高度下抑病型和導(dǎo)病型土壤中微生物群落的差異顯著性，結(jié)果（表1）表明細(xì)菌門類豐度差異不顯著，而真菌門類豐度存在顯著性差異。

圖2 門水平上抑病型和導(dǎo)病型土壤中細(xì)菌和真菌群落的組成Fig.2 Bacterial and fungal community structures in disease-suppressive soils（SS）and disease-conducive soils（CS）at phylum level

表1 抑病型和導(dǎo)病型土壤中細(xì)菌和真菌門類豐度差異分析Tab.1 Differential analysis of bacterial and fungal abundances in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS) at phylum level

對不同海拔高度下抑病型和導(dǎo)病型土壤中細(xì)菌和真菌群落屬水平上的差異進(jìn)行分析，結(jié)果（圖3）表明，500 m 海拔高度下，抑病型土壤中無色桿菌屬（Achromobacter）、德沃斯氏菌屬（Devosia）和微桿菌屬（Microbacterium）的相對豐度顯著低于導(dǎo)病型土壤（圖3a），而木霉菌屬（Trichoderma）真菌的相對豐度顯著高于導(dǎo)病型土壤（圖3b）。900 m海拔高度下，土壤中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）和貪銅菌屬（Cupriavidus）為具有顯著差異的細(xì)菌類群，毛殼菌屬（Chaetomium）、被孢霉屬（Mortierella）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）為具有顯著差異的真菌類群；其中，抑病型土壤中芽單胞菌屬（Gemmatimonas）、鞘脂菌屬（Sphingobium）、鞘脂單胞菌屬（Sphingopyxis）和毛殼菌屬（Chaetomium）的相對豐度顯著低于導(dǎo)病型土壤，貪銅菌屬（Cupriavidus）、被孢霉屬（Mortierella）和短梗蠕孢屬（Trichocladium）的相對豐度顯著高于導(dǎo)病型土壤（圖3c 和圖3d）。1 300 m 海拔高度下，抑病型和導(dǎo)病型土壤中勞爾氏菌屬（Ralstonia）、無色桿菌屬（Achromobacter）、中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）和Gemmatirosa 等5 個(gè)細(xì)菌屬的相對豐度存在顯著差異（圖 3e），木霉菌屬（Trichoderma）、被孢霉屬（Mortierella）等10 個(gè)真菌屬的相對豐度存在顯著差異（圖3f）。

圖3 抑病型和導(dǎo)病型土壤中屬水平上細(xì)菌和真菌組成差異顯著分析Fig.3 Significance analysis of differences between bacteria and fungi in disease-suppressive soils（SS)and disease-conducive soils（CS）at genus level

2.3 青枯菌拮抗菌相對豐度及與青枯病發(fā)病率的相關(guān)性

目前已報(bào)道的青枯病拮抗菌有100多株［12］，主要包括細(xì)菌型拮抗菌類，如類芽胞桿菌（Paenibacillus）、鏈霉菌（Streptomyces）、紅假單胞菌屬（Rhodopseudomonas）、鞘氨醇單胞菌（Sphingomonas）、嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas）、金黃桿菌（Chryseobacterium）、梭狀芽胞桿菌（Clostridium）、黃桿菌（Flavobacterium）、芽胞桿菌（Bacillus）、叢生放線菌（Actinospica）、細(xì) 鏈 胞 菌（Catenulispora）、Haliangium和溶桿菌（Lysobacter）等［6,13-17］以及真菌型拮 抗 菌 類 ，如 曲 霉 菌（Aspergillus）、青 霉 菌（Penicillium）、淡色生赤殼菌（Bionectria）、漆斑菌（Myrothecium）、木霉菌（Trichoderma）、巨孢囊霉（Gigaspora）和盾巨孢囊霉（Scutellospora）等［18-21］。根據(jù)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成，對已報(bào)道的拮抗菌的相對豐度進(jìn)行分析，結(jié)果（圖4）表明，拮抗細(xì)菌假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、黃單胞菌（Xanthomonas）、細(xì)鏈胞菌屬（Catenulispora）和拮抗真菌曲霉菌屬（Aspergillus）、漆斑菌屬（Myrothecium）和木霉菌屬（Trichoderma）在3 種海拔高度抑病型土壤中的相對豐度均顯著高于導(dǎo)病型土壤；500 m和900 m海拔高度下，嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、盾巨孢囊霉屬（Scutellospora）在抑病型土壤中的相對豐度均顯著高于導(dǎo)病型土壤。對拮抗菌的相對豐度與青枯病發(fā)病率的相關(guān)性進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示這些拮抗菌的相對豐度與青枯病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，且假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Rhizobium）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、曲霉菌屬（Aspergillus）、漆斑菌屬（Myrothecium）和木霉菌屬（Trichoderma）的相對豐度與青枯病發(fā)病率間的相關(guān)性總體達(dá)到顯著水平，見表2。

表2 不同海拔條件下拮抗微生物相對豐度與煙草青枯病發(fā)病率的Pearson相關(guān)性①Tab.2 Pearson correlations between relative abundances of antagonistic microorganisms and incidence of tobacco bacterial wilt at different altitudes

圖4 抑病型和導(dǎo)病型土壤中拮抗微生物的相對豐度Fig.4 Relative abundances of antagonistic microorganisms in disease-suppressive soils（SS）and disease-conducive soils（CS）

3 討論

本研究中通過擴(kuò)增子測序技術(shù)探究了煙草導(dǎo)病型土壤和抑病型土壤中細(xì)菌和真菌群落的結(jié)構(gòu)變化，分析了致病微生物和有益微生物的差異。致病細(xì)菌Ralstonia的相對豐度在導(dǎo)病型土壤明顯高于抑病型土壤。除導(dǎo)病微生物外，抑病型土壤和導(dǎo)病型土壤中有益微生物差異較大。有益微生物能刺激植物根部生長、進(jìn)行根際修復(fù)、調(diào)控非生物脅迫和控制病害等［22］。

在門水平上，抑病型土壤和導(dǎo)病型土壤微生物豐度和結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯的動(dòng)態(tài)變化。與導(dǎo)病型土壤相比，抑病型土壤中變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的相對豐度下降，放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）、接合菌門（Zygomycota）、壺菌門（Chytridiomycota）的相對豐度升高。在細(xì)菌門中，厚壁菌門（Firmicutes）中的芽胞桿菌產(chǎn)生抑制病原菌的抗菌脂化合物；放線菌門（Actinobacteria）中的鏈霉菌產(chǎn)生抗生素和揮發(fā)性物質(zhì)具有抗真菌的作用［23］；Lee等［24］證明土壤根際中的厚壁菌門和放線菌門在病害抑制中起關(guān)鍵作用。真菌門中，壺菌門（Chytridiomycota）的大多數(shù)種類能分解纖維素和幾丁質(zhì)，促進(jìn)土壤碳氮循環(huán)［25］。因此，抑病型土壤中含有的有益微生物群體對防控植物病害發(fā)揮著十分重要的作用。

從屬水平上分析，抑病型土壤中中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、貪銅菌屬（Cupriavidus）等細(xì)菌屬和被孢霉屬（Mortierella）、短梗蠕孢屬（Trichocladium）、木霉菌屬（Trichoderma）等真菌屬的相對豐度顯著高于導(dǎo)病型土壤。其中，中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）通過固定空氣中的氮?dú)?，可將其轉(zhuǎn)化成植物可利用吸收的化合態(tài)氮［26］，亞硝化螺菌（Nitrosospira）可以參與土壤中氮的循環(huán)［27］，土壤接種被孢霉屬（Mortierella）能夠促進(jìn)植物幼苗根系對磷和鉀的吸收［28］，而木霉菌屬（Trichoderma）可以產(chǎn)生真菌細(xì)胞壁降解酶和次生代謝產(chǎn)物等生物活性物質(zhì)，對多種病原真菌具備較強(qiáng)的拮抗作用［29］。由此可見，在受到病原菌侵染時(shí)，不同的微生物發(fā)揮各自的功能，調(diào)節(jié)根際土壤微生物群落，共同達(dá)到抗菌促生的作用［30］。關(guān)于土壤中青枯菌的拮抗微生物的分析結(jié)果表明，青枯菌的拮抗菌 根 瘤 菌 屬（Rhizobium）、黃 單 胞 菌 屬（Xanthomonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）、曲霉菌屬（Aspergillus）、漆斑菌屬（Myrothecium）、木霉菌屬（Trichoderma）等在抑病型土壤中具有較高的相對豐度，且其相對豐度與青枯病的發(fā)病率具有負(fù)相關(guān)關(guān)系。這也說明了對煙草青枯病起主要防控作用的是拮抗菌類微生物［11］。

綜合分析得出，煙草抑病型土壤中存在多種青枯菌的拮抗菌，可以顯著降低青枯菌的豐度，減少青枯病的爆發(fā)。因此在土傳病害的生物防治中，通過分析抑病型土壤中優(yōu)勢微生物的種類，篩選并應(yīng)用抑病型土壤中的拮抗菌，既可達(dá)到防治土傳病害的目的，也可實(shí)現(xiàn)土壤資源的合理利用。

4 結(jié)論

煙草青枯病導(dǎo)病型土壤與抑病型土壤中微生物群落差異顯著，在門水平上，細(xì)菌門類無明顯差異，真菌門類具有顯著性差異。在屬水平上，致病微生物勞爾氏菌屬（Ralstonia）在導(dǎo)病型土壤中具有較高的相對豐度，而有益微生物中慢生根瘤菌屬（Mesorhizobium）、亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）及青枯菌拮抗微生物假單胞菌屬（Pseudomonas）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、根瘤菌屬（Rhizobium）、黃單胞菌屬（Xanthomonas）、嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas）等的相對豐度在抑病型土壤中顯著高于導(dǎo)病型土壤，且這些拮抗微生物與青枯病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。