李 萌，候?qū)帉?，?鵬，王旭東，宋嘉寶，孫九喆，馬 林*

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號 450001

2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，鄭州市經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)第三大街8 號 450000

煙葉是卷煙工業(yè)企業(yè)不可或缺的原料，其質(zhì)量的好壞直接影響卷煙產(chǎn)品的吸食品質(zhì)［1］。煙葉質(zhì)量指標包括外觀質(zhì)量、化學(xué)成分和物理特性等方面［2］，受自身生物學(xué)特性及栽培、氣候等條件的影響，不同煙葉品種在感官和理化特性上存在較大差異，其在各配方中的應(yīng)用也有所不同。在煙葉收購過程中，由于不同品種煙葉收購價存在差異，混種、混區(qū)、混級等現(xiàn)象時有發(fā)生，從而導(dǎo)致煙葉質(zhì)量波動、卷煙配方失真，給工業(yè)企業(yè)控制卷煙產(chǎn)品質(zhì)量帶來影響［3］。目前煙葉原料的品種鑒定主要以感官評吸和理化檢測為主，感官評吸主觀性較強而煙葉理化指標受產(chǎn)地、氣候及栽培條件的影響較大［4-5］，尚缺乏生產(chǎn)中能夠使用的快速、客觀且準確的品種鑒定方法。

分子生物學(xué)檢測方法以物種基因組DNA 序列為檢測對象，具有干擾因素少、靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可彌補外觀和感官檢測的不足。RAPD、SCAR 和SSR 等分子標記技術(shù)是煙草上研究較多的分子檢測技術(shù)，可以對煙葉品種進行有效區(qū)分［6-9］。如肖炳光等［6］利用18條RAPD引物成功將29個烤煙品種進行區(qū)分；馬林等［7］采用組合標記策略，利用6個SCAR 引物準確地區(qū)分了12 個煙葉品種；孫九喆等［8］篩選出5對SSR引物，實現(xiàn)了11個煙葉品種的快速區(qū)分。然而，以上研究雖能對煙葉品種進行有效區(qū)分，但無法實現(xiàn)煙葉品種的定量檢測。

熒光定量PCR可對檢測成分進行相對定量甚至絕對定量的測定，已經(jīng)普遍用于食品、飼料及藥品等特定生物成分的定性、定量檢測［10-13］，而在煙草行業(yè)中，尤其在煙葉品種的定性、定量檢測方面鮮有熒光定量PCR 應(yīng)用的相關(guān)報道。為此，應(yīng)用TaqMan MGB 探針熒光定量PCR 檢測混合煙葉中紅花大金元的含量，建立基于熒光定量PCR 的特定煙葉品種定量檢測方法，以期為煙葉收購和配方均一性檢測等生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的煙葉品種識別、定量檢測提供新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

以鄭州輕工業(yè)大學(xué)煙草生物技術(shù)研究室保存的卷煙企業(yè)常用的4個烤后煙葉品種（2017年）為試驗材料，品種信息見表1。

表1 4個烤后煙葉品種及編號Tab.1 Cultivars and numbers of four cured tobacco leaf samples

1.1.2 試劑

以實驗室前期篩選的SCAR6序列為模板［14］，應(yīng)用軟件 Primer Premier 5.0 設(shè)計 5 對 SCAR 引物（表2），由生工生物工程（上海）有限公司合成；利用上海生工在線引物設(shè)計網(wǎng)站（https://www.sangon.com/new Primer Design）設(shè)計 TaqMan MGB 熒光探針H1-T（表3），并由生工生物工程（上海）有限公司進行合成，該探針5′端標記熒光染料FAM，3′端標記MGB 基團；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ和 2×AceQ Universal U+Probe Master Mix V2 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

表2 5對SCAR引物序列Tab.2 Sequences of 5 SCAR primer pairs

表3 熒光探針H1-TTab.3 Sequence of fluorescence probe H1-T

1.1.3 儀器

JXSF TPRP-2 組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；NanoDrop 2000 超微量紫外分光光度計（美國Thermo Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Vetiti型梯度PCR儀（美國ABI公司）；Mini Bis Pro 型凝膠成像分析系統(tǒng)（以色列DNR 凝膠成像系統(tǒng)有限公司）；StepOnePlus 型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems 公司）。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

紅花大金元、云煙85、云煙87 與K326 4 個品種煙葉樣品各取0.1 g至1.5 mL離心管中，應(yīng)用組織研磨儀磨成粉末（2 min，65 Hz），然后參照改良后的CTAB 法［15］操作步驟提取DNA，利用超微量紫外分光光度計和1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的濃度及質(zhì)量。最后將 DNA 稀釋至55 ng·μL-1，-20 ℃保存。

1.2.2 紅花大金元特異性引物篩選

SCAR-PCR 擴增反應(yīng)體系（20 μL）：DNA 模板，55 ng·μL-1、0.5 μL；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ，10μL；上下游引物，10 μmol/L 濃度各0.5 μL；ddH2O 加至20 μL；反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性6 min；94 ℃變性50 s，引物的退火溫度根據(jù)表2 結(jié)果退火20 s，72 ℃延伸25 s，從變性到延伸反應(yīng)30 個循環(huán)；最后在72 ℃延伸6 min；PCR 產(chǎn)物在4 ℃條件下保存。PCR擴增產(chǎn)物在80 V穩(wěn)定電壓下，以1×TAE作為電泳緩沖液，將質(zhì)量分數(shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠置于緩沖液中，上樣后電泳40 min，經(jīng)由紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照后，建立凝膠電泳圖進行分析。根據(jù)電泳結(jié)果最終選出特異性強且能產(chǎn)生特異性條帶的SCAR引物用于紅花大金元品種鑒定。

1.2.3 引物與探針特異性測試

利用篩選好的特異性引物與探針H1-T組合，分別以紅花大金元、云煙85、云煙87 和K326 基因組DNA 為模板進行引物與探針特異性測試。熒光定量PCR反應(yīng)體系如表4所示，反應(yīng)程序為：37 ℃污染消化2 min；95 ℃預(yù)變性5 min；在 95 ℃變性10 s、49 ℃退火 30 s、72 ℃延伸 30 s 條件下循環(huán) 40 次，在此過程收集數(shù)據(jù)。以ddH2O 為空白對照，根據(jù)引物探針組合的擴增曲線形態(tài)（S）、Ct 值確定引物的特異性。

1.2.4 熒光定量PCR擴增體系及程序優(yōu)化

根據(jù)引物、探針組合的擴增曲線形態(tài)（S）、Ct 值確定最佳引物，設(shè)置4 個模板DNA 含量梯度（1、2、3和4 μL），以紅花大金元DNA 為模板按照1.2.3 程序進行擴增。

1.2.5 方法靈敏度測試

將紅花大金元基因組DNA 用ddH2O 進行梯度稀釋，DNA 的濃度分別為 55、5.5、0.55、0.055 和0.005 5 ng·μL-1。利用優(yōu)化后的熒光定量PCR 擴增體系和擴增程序進行擴增。

1.2.6 標準曲線建立

將紅花大金元基因組 DNA（55 ng·μL-1）與ddH2O 混合稀釋成不同濃度，紅花大金元基因組DNA稀釋后的濃度分別為5.5、11.0、16.5、22.0、27.5、33.0、38.5、44.0、49.5 和 55.0 ng·μL-1。將 2 μL 紅花大金元基因組DNA 加入到20 μL 反應(yīng)體系后，其實際濃度分別為0.55、1.10、1.65、2.20、2.75、3.30、3.85、4.40、4.95 和5.50 ng·μL-1。利用以上的紅花大金元基因組DNA為模板，通過優(yōu)化后的熒光定量PCR擴增體系和擴增程序進行擴增。以紅花大金元基因組DNA 在20 μL 反應(yīng)體系中的實際濃度為橫坐標，Ct值均值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.7 煙葉基因組DNA預(yù)混樣品測定

將紅花大金元基因組DNA 與云煙85 基因組DNA 按照不同體積比例進行混合。實驗中混合樣品比例設(shè)計如表5 所示，紅花大金元基因組DNA 與云煙85的基因組DNA體積比分別為5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、10∶0，分別用A、B、C、D、E、F表示，以紅花大金元煙葉DNA為模板，用引物與探針組合對樣品進行熒光定量PCR擴增，每個樣品重復(fù)3次，根據(jù)熒光定量PCR擴增及標準曲線對紅花大金元進行定量分析。

1.2.8 混合煙葉樣品測定

將紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和K326進行混合并編號。1～3 號樣品為紅花大金元分別與云煙 85、云煙 87 和 K326 按照質(zhì)量比 5 ∶5 進行混合；4～6 號樣品分別為紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和 K326 按照質(zhì)量比 7 ∶3 進行混合；7～9 號樣品分別為紅花大金元分別與云煙85、云煙87 和K326 按照質(zhì)量比9∶1進行混合。將上述樣品磨成粉末，各取0.1 g 于1.5 mL 離心管中，利用改良的CTAB 法提取上述混合樣品的基因組DNA，將提取后的DNA 用ddH2O稀釋至55 ng·μL-1，并使用熒光定量PCR法進行檢測，每個樣品重復(fù)3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 烤后煙葉基因組DNA提取

由圖 1 可看出，1～4 號樣品 DNA 條帶都較為清晰單一，無雜帶，主條帶亮度高且DNA 條帶完整性較好。由表6 可知，提取的基因組DNA OD260/OD280的值在1.8～2.0 之間，純度較高。利用改良的CTAB法提取的煙葉基因組DNA 質(zhì)量及純度達到后續(xù)PCR 對DNA 模板的要求。將4 個煙葉樣品的DNA用ddH2O稀釋至55 ng·μL-1，備用。

表6 煙葉基因組DNA濃度與純度檢測結(jié)果Tab.6 Concentration and purity of tobacco genomic DNA

圖1 煙草基因組DNA凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoregram of tobacco genomic DNA

2.2 紅花大金元特異性引物篩選

以紅花大金元、云煙85、云煙87與K326基因組DNA 為模板，對所設(shè)計的5 對引物進行篩選。PCR反應(yīng)條件為1.2.2 節(jié)的SCAR-PCR 反應(yīng)體系與程序。結(jié)果（圖2）顯示，只有引物H1-R/F 以紅花大金元基因組DNA 為模板進行PCR 時可擴增出明亮的條帶，無其他雜帶產(chǎn)生，表明引物H1-R/F 對紅花大金元基因組DNA有很強的特異性，可用于紅花大金元品種的定性鑒定。

圖2 引物篩選結(jié)果Fig.2 Screening results by using primers

2.3 引物與探針特異性測試

熒光定量PCR 擴增產(chǎn)物大小在80～200 bp 較為適宜，實驗中設(shè)計篩選出的引物H1-R/F 符合該要求。利用熒光引物H1-R/F 與探針H1-T 組合，以紅花大金元、云煙85、云煙87 和K326 的基因組DNA為模板進行特異性測試。結(jié)果（圖3）顯示，紅花大金元出現(xiàn)典型的擴增曲線，其余樣品雖有擴增曲線，但Ct 值均大于32，可判定為陰性。以上結(jié)果表明該引物、探針組合具有良好的特異性，可以用于下一步試驗。

圖3 特異性測試結(jié)果Fig.3 Test results for specificity

2.4 熒光定量PCR擴增體系及程序優(yōu)化

利用引物與探針組合H1-R/F/T，設(shè)置4 個模板DNA含量梯度（1、2、3和4 μL），進行PCR擴增，確定熒光定量PCR 最佳反應(yīng)體系。結(jié)果如表7 所示，Ct值隨著模板DNA 含量的增加而減小。熒光定量PCR Ct值要求在25～30之間，故確定模板DNA的含量為2 μL。

表7 熒光定量PCR體系優(yōu)化Ct值Tab.7 Ct values of optimized fluorescent quantitative PCR system

2.5 方法靈敏度測試

將紅花大金元基因組DNA 用ddH2O 梯度稀釋，利用優(yōu)化后的熒光定量PCR擴增體系和擴增程序進行擴增以確定該方法的檢測限。結(jié)果（圖4）表明，當紅花大金元DNA初始濃度大于0.055 ng·μL-1時，擴增曲線的Ct 值≤32；當紅花大金元DNA 初始濃度在0.055 ng·μL-1以下時，擴增曲線的Ct 值＞32，模板DNA含量為2μL，可得本方法的檢測限為0.11 ng。

圖4 靈敏度測試結(jié)果Fig.4 Test results for sensitivity

2.6 標準曲線繪制

按照1.2.6節(jié)所述方法繪制標準曲線。從結(jié)果可以看出（圖5、表8），Ct值的RSD范圍在0.05%～0.38%之間，重復(fù)性較好；標準曲線方程為y =-1.575ln（x）+ 27.156，決定系數(shù)R2為0.997。

表8 紅花大金元熒光定量PCR方法標準曲線Ct值Tab.8 Ct value of standard curve of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan

圖5 標準曲線Fig.5 Standard curve

2.7 預(yù)混樣品中紅花大金元含量測定

將紅花大金元 DNA（55 ng·μL-1）與云煙 85 DNA（55 ng·μL-1）按照表5的方式進行混合，以上述DNA 預(yù)混樣品為模板進行熒光定量PCR。從結(jié)果（表9）可以看出，Ct值的RSD范圍在0.04%～0.33%之間，重復(fù)性較好，數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。通過標準曲線計算得出預(yù)混樣品A～F 中紅花大金元DNA 含量檢測值分別為51.36%、61.95%、72.17%、81.18%、87.95%和97.29%，檢測值與理論值相對誤差分別是2.72%、3.25%、3.10%、1.48%、-2.28%和-2.71%。相對誤差均在3.5%以下，表明標準曲線可以對混樣中紅花大金元含量進行定量分析。

表9 預(yù)混樣品中紅花大金元熒光定量PCR法檢測結(jié)果Tab.9 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in premixed samples

2.8 混合煙葉樣品中紅花大金元含量測定

從表 10 可以看出，1～9 號混合煙葉樣品 Ct 值重復(fù)性較好。應(yīng)用標準曲線計算得出煙葉混合樣品中紅花大金元的DNA 濃度，通過紅花大金元的DNA濃度和混合煙葉樣品DNA濃度之比得出1～9號樣品中紅花大金元的含量（表10）。紅花大金元的檢測值均值與理論值的差值在2.5%～3.5%之間，且每個樣品3次重復(fù)計算得出紅花大金元檢測值的變異系數(shù)小于2%，屬于弱變異，結(jié)果波動較小。

表10 混合煙葉樣品中紅花大金元熒光定量PCR檢測結(jié)果Tab.10 Detection results of fluorescent quantitative PCR for Honghuadajinyuan in mixed tobacco leaf samples

基于熒光定量PCR的煙葉品種定量檢測技術(shù)的核心在于引物的特異性。本研究中以紅花大金元品種特異性序列為基礎(chǔ)建立了該品種的定量檢測方法，當鑒定靶標品種改變時，需要根據(jù)靶標品種的特異性序列重新設(shè)計、篩選引物，參照本研究中的流程建立其檢測方法。本研究中所用混合樣品包含了4個煙葉品種，當品種范圍擴大時，需要以新加入品種為模板對引物的特異性進行驗證以避免出現(xiàn)假陽性。此外，由于熒光探針法靈敏度較高，對DNA 模板質(zhì)量和操作精度要求較高，檢測過程各個環(huán)節(jié)均需嚴格、規(guī)范操作以確保實驗結(jié)果的準確性。

3 結(jié)論

通過特異性引物設(shè)計、篩選、探針引物組合特異性測試和熒光定量PCR 擴增條件的優(yōu)化，利用TaqMan MGB 探針法實現(xiàn)了混合煙葉中紅花大金元品種的定量檢測。以紅花大金元品種特異性SCAR序列為基礎(chǔ)設(shè)計了熒光定量引物和探針，從中篩選出了特異性強、靈敏性高、重復(fù)性好的引物和探針組合，在此基礎(chǔ)上繪制了標準曲線，最終建立了紅花大金元在混合煙葉樣品中的定量檢測方法。該方法的檢測限為0.11 ng，誤差范圍在2.5%～3.5%之間，精確度高、檢測周期短、安全性好，可應(yīng)用于特定混合樣品中紅花大金元煙葉的定量檢測，為煙葉品種的定量檢測提供了新的技術(shù)手段。