賈婷婷，雷蕾，吳歆媛，蔡順有，陳藝璇，薛鈺

二甲雙胍對(duì)斑馬魚骨骼發(fā)育及損傷修復(fù)的機(jī)制研究

賈婷婷1，雷蕾1，吳歆媛1，蔡順有2，陳藝璇1，薛鈺1

1. 閩南師范大學(xué)，福建省菌類活性物質(zhì)工程技術(shù)研究中心，漳州 363000 2. 閩南師范大學(xué)，化學(xué)化工與環(huán)境學(xué)院，福建省現(xiàn)代分離分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，漳州 363000

二甲雙胍(metformin, MET)是治療糖尿病的一線藥物，對(duì)骨骼疾病也有一定的治療效果，但具體作用機(jī)制尚不明確。本研究利用斑馬魚()構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，通過(guò)熒光觀察、骨骼染色、半定量PCR、原位雜交及ELISA等技術(shù)方法，探究MET對(duì)斑馬魚骨骼發(fā)育及損傷修復(fù)的作用機(jī)制。首先通過(guò)胚胎致死率、骨骼礦化及鈣化程度確定了MET的工作濃度是0.1%，該濃度MET對(duì)斑馬魚胚胎和幼魚的骨骼發(fā)育均有顯著的促進(jìn)作用，可通過(guò)增強(qiáng)骨骼調(diào)控基因的mRNA水平和蛋白質(zhì)水平實(shí)現(xiàn)。進(jìn)一步利用枸櫞酸鐵銨(ferric ammo-nium citrate, FAC)和硝基還原酶/甲硝唑(nitroreductase/metronidazole, NTR/MTZ)系統(tǒng)構(gòu)建斑馬魚體外和體內(nèi)骨質(zhì)疏松模型，并利用MET進(jìn)行恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明MET能顯著修復(fù)FAC或MTZ誘導(dǎo)引起的骨骼礦化面積減小、脊椎鈣化減少、成骨分化減弱等骨質(zhì)疏松表型，通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞再生、增強(qiáng)成骨細(xì)胞標(biāo)記物(ALP)表達(dá)和抑制破骨細(xì)胞標(biāo)記物(、TRAP)的活性發(fā)揮修復(fù)作用。最后，通過(guò)檢測(cè)Bmp信號(hào)成員的表達(dá)水平變化，初步證明MET不僅可以增強(qiáng)Bmp的mRNA和蛋白表達(dá)，還可通過(guò)激活Bmp下游信號(hào)通路促進(jìn)斑馬魚骨骼發(fā)育和損傷修復(fù)。綜合本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，MET作為治療糖尿病專用藥的同時(shí)，對(duì)斑馬魚骨骼發(fā)育也有促進(jìn)作用，且對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有顯著的修復(fù)功效，為老藥新用提供了新的研究方向和實(shí)驗(yàn)支撐。

二甲雙胍；斑馬魚；骨質(zhì)疏松；損傷修復(fù)；Bmp

最近的研究已經(jīng)證實(shí)MET可以減少巨噬細(xì)胞促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis, MS)治療中表現(xiàn)出理想的免疫調(diào)節(jié)活性[12]。此外，最近的一項(xiàng)蛋白組學(xué)研究表明，由于MET的抗病毒活性以及在動(dòng)物模型中具有減輕急性肺損傷的效果，因此認(rèn)為MET可以通過(guò)增強(qiáng)人體蛋白ACE2磷酸化水平，從而改變其構(gòu)象來(lái)破壞病毒蛋白與ACE2受體之間的相互作用直接抑制SARS-CoV-2感染，可被用作SARS-CoV-2感染和其他病毒感染的潛在治療藥物[13]。研究表明，MET可以促進(jìn)體外骨細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞外基質(zhì)礦化，逆轉(zhuǎn)高濃度葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞功能的損傷，抑制破骨細(xì)胞的形成，保護(hù)2型糖尿病(adult-onset diabetes mellitus, DM)患者的骨質(zhì)[14]。

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis)是由于骨組織中完成骨吸收功能的破骨細(xì)胞，與主導(dǎo)骨形成功能的成骨細(xì)胞，二者之間的平衡被打破從而引起的骨代謝性疾病[15]，主要表現(xiàn)為骨折風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重威脅患者生命安全。目前全球已超過(guò)2億人患有骨質(zhì)疏松病，我國(guó)約有1.4億骨質(zhì)疏松癥患者，其中40歲以上人群的患病率為24.6%，位列全球慢性病第3位。隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥已成為全球性健康問(wèn)題[16]。

骨組織的發(fā)育、重建是一個(gè)完整的動(dòng)態(tài)過(guò)程。目前已在小鼠()、兔()、猴()等動(dòng)物中成功構(gòu)建了骨質(zhì)疏松模型[17]，但存在造模用藥周期長(zhǎng)、工作量大且成本高等限制因素，上述模型本身無(wú)法動(dòng)態(tài)追蹤骨骼損傷及重建過(guò)程。斑馬魚()由于軀體透明度高、便于觀察，在20

世紀(jì)80～90年代初就被確立為一種新的模式動(dòng)物。由于其基因與人類基因的相似度較高，尤其是骨骼發(fā)育過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制與哺乳動(dòng)物具有高度的同源性。目前已經(jīng)發(fā)展出多種成熟的研究骨骼發(fā)育的技術(shù)手段，包括不同的骨骼染色技術(shù)及對(duì)特異標(biāo)記骨骼的轉(zhuǎn)基因品系的熒光追蹤，為建立骨疾病模型的構(gòu)建以及藥物篩選提供了有力支撐[18]。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中，利用高鐵脅迫成功構(gòu)建了斑馬魚骨質(zhì)疏松疾病模型，該模型可用于抗骨質(zhì)疏松藥物的篩選及機(jī)理研究，且對(duì)臨床知名抗骨質(zhì)疏松藥物阿倫磷酸鈉具有同樣適用性[19]。本研究進(jìn)一步利用斑馬魚骨質(zhì)疏松模型探究了MET促進(jìn)成骨再生的活性及損傷修復(fù)的作用機(jī)制，為其用于骨疾病臨床治療提供思路和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

MET緩釋片為中美上海施貴寶制藥有限公司生產(chǎn)。

本研究所使用的斑馬魚品系包括：TU、成骨細(xì)胞特異表達(dá)的()表征Bmp信號(hào)活性的()。()品系由清華大學(xué)孟安明課題組構(gòu)建和篩選；()品系由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所王強(qiáng)課題組贈(zèng)予。所有斑馬魚品系均飼養(yǎng)于28±0.5℃淡水循環(huán)系統(tǒng)中，光照周期14 h光照/10 h黑暗，水循環(huán)系統(tǒng)pH恒定為7.0～7.4，每日定時(shí)定量喂食豐年蝦3次[20]。

實(shí)驗(yàn)前一晚，挑選達(dá)到性成熟、交配成功率高的斑馬魚于配魚缸中，隔板將雌雄魚隔開，于次日上午8:00換水后抽出中間隔板，30 min后收集受精卵于含有Holfreter水(3.5 g/L NaCl、0.1 g/L CaCl2、0.05 g/L KCl、0.025 g/L NaHCO3)的培養(yǎng)皿中，28℃恒溫培養(yǎng)。

2018年8月6日起北京一輪雨勢(shì)來(lái)臨的幾天里，我們當(dāng)年黑龍江建設(shè)兵團(tuán)老九連的一幫“老職工”又出遠(yuǎn)門了，去距京六七百公里的內(nèi)蒙古東蒙克什克騰旗一帶旅行。

1.2 給藥濃度的確定

用Holfreter水配制不同濃度MET溶液(濃度分別為0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL)，以6孔板為實(shí)驗(yàn)容器，每孔加入30枚胚胎，同一濃度設(shè)兩組平行，于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每12 h換藥；同時(shí)記錄挑走的死亡胚胎數(shù)和存活胚胎的發(fā)育狀況，72 h后統(tǒng)計(jì)并計(jì)算致死率，選擇致死率較低的為給藥濃度。

1.3 MET對(duì)骨骼發(fā)育的影響

TU品系自交，收集受精后0.75 h的胚胎，分于6孔板中，每孔30枚；Holfreter水設(shè)為空白對(duì)照組，給藥組為實(shí)驗(yàn)組，每12 h換藥，保持藥物濃度不變，28℃恒溫培養(yǎng)至8 d。用雙蒸水清洗幼魚，收集樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 MET對(duì)體外骨質(zhì)疏松斑馬魚模型的修復(fù)

本實(shí)驗(yàn)室在前期的研究工作中通過(guò)摸索確定500 g/mL枸櫞酸鐵銨(ferric ammonium citrate, FAC)可成功構(gòu)建斑馬魚骨質(zhì)疏松模型。本研究中，將受精后的胚胎于Holfreter水培養(yǎng)4 d后分為：空白對(duì)照即CTR組(Holfreter水繼續(xù)培養(yǎng)至第8 d)、FAC持續(xù)造模組(500 g/mL FAC培養(yǎng)至第8 d)、Holfreter水陰性對(duì)照組(FAC培養(yǎng)2 d后，換為Holfreter水培養(yǎng)2 d)、依替膦酸二鈉(etidronate, ED)陽(yáng)性對(duì)照組(FAC培養(yǎng)2 d后，換為1 mg/mL ED培養(yǎng)2 d)和MET實(shí)驗(yàn)組(FAC培養(yǎng)2 d后，換為1 mg/mL MET培養(yǎng)2 d)，共5組，對(duì)培養(yǎng)至8 d的幼魚進(jìn)行染色或其他實(shí)驗(yàn)。

1.5 MET對(duì)體內(nèi)骨質(zhì)疏松模型的損傷修復(fù)

NTR/MTZ細(xì)胞消融體系中，當(dāng)加入硝基還原酶(nitroreductase, NTR)底物甲硝唑(metronidazole, MTZ)時(shí)，MTZ與NTR反應(yīng)，可特異性殺死被熒光標(biāo)記的細(xì)胞，熒光表達(dá)消失。本研究利用成骨細(xì)胞特異表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品系()，在該品系中通過(guò)MTZ誘導(dǎo)可特異破壞殺死成骨細(xì)胞，從體內(nèi)模擬骨質(zhì)疏松癥。對(duì)發(fā)育至48 hpf的胚胎，將其分為：空白對(duì)照即CTR組(Holfreter水繼續(xù)培養(yǎng)至第5 d)、MTZ持續(xù)造模組(8 mmol/L MTZ培養(yǎng)至第5 d)、ED組(MTZ培養(yǎng)1 d后，換為1 mg/mL ED培養(yǎng)2 d)和MET實(shí)驗(yàn)組(MTZ培養(yǎng)1 d后，換為1 mg/mL MET培養(yǎng)2 d)，共4組，收集5 d的幼魚進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.6 茜素紅和鈣黃綠素染色

茜素紅(alizarin red)染色骨鈣化基質(zhì)，與骨骼中的鈣離子螯合發(fā)生顯色反應(yīng)，產(chǎn)生深紅色的有色化合物，以此來(lái)判斷干細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的程度，可用于檢測(cè)斑馬魚成骨的發(fā)育程度[21,22]。鈣黃綠素(calcein)在進(jìn)入斑馬魚體內(nèi)后可與骨骼中鈣化的骨基質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生強(qiáng)烈的綠色熒光。因此鈣黃綠素可用于標(biāo)記斑馬魚成骨骨結(jié)構(gòu)，是活體斑馬魚骨染色最好的染色劑[23]。茜素紅和鈣黃綠素染色方法參考文獻(xiàn)[24]。染色完成后，拍照記錄染色情況。

1.7 整胚原位雜交及半定量PCR

利用整胚原位雜交及半定量PCR技術(shù)在mRNA水平上檢測(cè)骨骼相關(guān)基因和的表達(dá)。Runx2家族作為調(diào)控成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，是間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的重要標(biāo)志。研究表明，成骨細(xì)胞分化初期，、起始骨基質(zhì)蛋白的生成，從而使成骨細(xì)胞向骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化[25]。是一種重要的早期胚胎發(fā)育相關(guān)因子，在軟骨形成中起著極其重要的作用[26]。鋅指轉(zhuǎn)錄因子s(也稱)是成骨細(xì)胞分化和骨骼形成的標(biāo)記基因，是成骨細(xì)胞特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子[27]。組織蛋白酶K ()和基質(zhì)金屬蛋白酶-9 ()是破骨細(xì)胞標(biāo)志基因，破骨細(xì)胞吸附到舊骨質(zhì)上分泌Ctsk和Mmp9等蛋白酶消化骨基質(zhì)，形成吸收窩陷，導(dǎo)致骨吸收[27]。Bmp(bone morphogenetic proteins)是TGF-β超家族中的一個(gè)亞家族，該蛋白家族在不同的組織中具有廣泛的生物活性，參與骨組織、血液、心臟、腎臟、肝臟以及肺等的發(fā)育。Bmp通過(guò)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)控骨骼發(fā)育，包括軟骨和硬骨形成、顱面骨和肢體骨骼發(fā)育，并且這種調(diào)控作用在不同脊椎動(dòng)物模型中是高度保守的[28]。

總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[24]。

1.8 ELISA檢測(cè)蛋白表達(dá)量

本研究采用特異檢測(cè)斑馬魚骨骼發(fā)育調(diào)控因子的ELISA試劑盒(中國(guó)臺(tái)灣Zgenebio公司)檢測(cè)堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(anti-tartrase acid phosphatase, TRAP)、Sox9、Bmp2b及Bmp4的蛋白表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)步驟根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 二甲雙胍能顯著促進(jìn)斑馬魚硬骨礦化和鈣化

本研究通過(guò)不同濃度梯度的MET溶液培養(yǎng)斑馬魚胚胎，對(duì)胚胎發(fā)育毒性進(jìn)行測(cè)試，通過(guò)致死率、發(fā)育延緩程度確定合適的MET工作濃度。如圖1所示，與對(duì)照組(0 mg/mL)相比，0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL濃度處理組的致死率均小于15%，這幾個(gè)濃度下的胚胎發(fā)育速度均正常；5 mg/mL濃度組死亡率超過(guò)23.33%，MET濃度為10 mg/mL時(shí)致死率最高，高達(dá)90%，存活的胚胎發(fā)育遲緩嚴(yán)重(圖1：A，B)。選擇0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL濃度MET處理受精后0.75 h的胚胎，收集8 dpf幼魚進(jìn)行不同的硬骨染色觀察MET對(duì)幼魚骨骼發(fā)育的影響。茜素紅染色能觀察到對(duì)照組在孔蓋(operculum, op)、脊索(notochord, nc)、匙骨(cleithrum, cl)、副蝶骨(parasphenoid, ps)等部位有清晰的染色信號(hào)，當(dāng)不同濃度的MET處理后，能引起斑馬魚在nc、cl部位的染色信號(hào)出現(xiàn)不同程度加深，在op、nc、cl、ps部位的染色區(qū)域擴(kuò)大(圖1C)；從鈣黃綠素染色結(jié)果分析可見：對(duì)照組有6節(jié)脊出現(xiàn)鈣化，其中5節(jié)較為完整，不同濃度MET處理后，脊椎的鈣化數(shù)量增至7到8節(jié)，鈣化完整的脊椎進(jìn)一步增多(圖1D)。通過(guò)對(duì)上述染色區(qū)域及光密度值(IOD)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，1 mg/mL MET對(duì)骨骼礦化及鈣化的促進(jìn)作用最明顯(圖1E)。故在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，本研究以1 mg/mL即0.1% MET為主要工作濃度。

2.2 MET促進(jìn)骨骼發(fā)育調(diào)控關(guān)鍵因子的表達(dá)

MET對(duì)斑馬魚幼魚的硬骨發(fā)育有明顯促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步探究MET對(duì)骨骼發(fā)育調(diào)控基因表達(dá)的影響，本研究首先通過(guò)原位雜交檢測(cè)了0.1% MET處理24 hpf后基因家族的時(shí)空表達(dá)情況。在胚胎發(fā)育早期主要在前上頜骨及齒骨表達(dá)，本研究結(jié)果表明，MET能促進(jìn)在前上頜骨的表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖2A)；MET對(duì)和在頭部表達(dá)也有相同的促進(jìn)作用(圖2：B，C)，預(yù)示著MET對(duì)斑馬魚骨骼發(fā)育的影響在胚胎發(fā)育早期開始發(fā)揮作用。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了MET處理8 dpf的幼魚，通過(guò)ELISA檢測(cè)Sox9、ALP和TRAP的蛋白水平變化。其中，在MET誘導(dǎo)下Sox9、ALP的蛋白表達(dá)明顯增加，表明MET可以明顯增強(qiáng)成骨細(xì)胞的活性(圖2：D，E)；與此相反，MET能顯著下調(diào)TRAP的表達(dá)水平，表明MET對(duì)破骨細(xì)胞形成具有抑制作用(圖2F)。

圖1 胚胎致死率及骨骼染色結(jié)果

A：二甲雙胍（MET）分子結(jié)構(gòu)示意圖；B：不同濃度下胚胎致死率；C：茜素紅染色腹部觀；D：鈣黃綠素染色側(cè)面觀；E：統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果。ps：副蝶骨；nc：脊索；cl：匙骨；op：孔蓋。與空白對(duì)照（CTR）組比較，*表示<0.05，**表示<0.01。圖右下角的數(shù)字例如13/17表示17枚胚胎中有13枚胚胎著色如圖所示，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 MET處理對(duì)成骨相關(guān)表達(dá)基因在mRNA水平及蛋白質(zhì)水平的影響

A～C：二甲雙胍（MET）處理后檢測(cè)24 hpf成骨相關(guān)基因的mRNA表達(dá)(A：胚胎背面觀；B、C：胚胎側(cè)面觀)；D～F：骨骼相關(guān)蛋白標(biāo)識(shí)物的表達(dá)。與空白對(duì)照（CTR）組比較，*表示<0.05。

2.3 MET對(duì)斑馬魚體外骨質(zhì)疏松模型的損傷修復(fù)作用

MET在不同水平上均可促進(jìn)斑馬魚骨骼發(fā)育。本實(shí)驗(yàn)室在前期工作中成功構(gòu)建了體外高鐵FAC誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型[19,27]，基于此，為了探究MET對(duì)骨骼損傷是否也具有治療作用，本研究進(jìn)一步探索了MET是否能修復(fù)高鐵誘導(dǎo)的骨骼損傷。采用1.4所述的給藥方式(圖3A)，收集發(fā)育至8 dpf的幼魚進(jìn)行茜素紅染色。結(jié)果表明，與CTR組相比，F(xiàn)AC組即模型組在孔蓋(op)和脊索(nc)的染色信號(hào)完全消失，僅剩極少的染色信號(hào)在匙骨(cl)可見；MET恢復(fù)組中op、nc染色面積均有明顯恢復(fù)，且cl染色面積及染色深度明顯增加(圖3B)。鈣黃綠素染色結(jié)果表明，F(xiàn)AC組脊椎鈣化數(shù)量減少至兩節(jié)，明顯少于CTR組，MET組加藥后可使脊椎節(jié)數(shù)恢復(fù)為4節(jié)(圖3C)。對(duì)兩種染色結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MET可以有效修復(fù)由FAC誘導(dǎo)的斑馬魚體外硬骨及脊柱鈣化損傷(圖3：D～F)。

經(jīng)1.4所述給藥方式處理后，收集不同組別樣品提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增獲得骨骼標(biāo)記基因的特異擴(kuò)增片段表征mRNA表達(dá)水平，通過(guò)對(duì)電泳條帶及條帶灰度進(jìn)行分析，可以看到FAC組的表達(dá)量明顯低于CTR組，約為對(duì)照組的70%左右，MET組與FAC組相比有顯著升高。而對(duì)于和，結(jié)果則相反，其中FAC誘導(dǎo)組中這兩個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量均增加了3倍以上，表明破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的平衡被明顯破壞，MET能將這種異常升高顯著下調(diào)(圖3：G，H)。上述結(jié)果表明，MET可以通過(guò)調(diào)控骨骼標(biāo)記基因在mRNA水平上的表達(dá)促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞活性，有效恢復(fù)FAC誘導(dǎo)的斑馬魚骨骼損傷。

圖3 MET對(duì)FAC誘導(dǎo)的體外骨質(zhì)疏松模型的修復(fù)作用

A：給藥示意圖；B：茜素紅染色腹部觀；C：鈣黃綠素染色側(cè)面觀；D～F：染色統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果；G：、、基因PCR擴(kuò)增電泳圖；H：對(duì)G圖中電泳條帶的灰度分析；I：ALP蛋白相對(duì)表達(dá)量；J：TRAP蛋白相對(duì)表達(dá)量。CTR：空白對(duì)照組；FAC：枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)組；Holf：Holfreter水陰性恢復(fù)組；ED：依替膦酸二鈉陽(yáng)性藥物組；MET：二甲雙胍處理組。cl：匙骨；nc：脊索；op：孔蓋。與CTR組比較，#表示<0.05，##表示<0.01，###表示<0.001；與FAC組比較，*表示<0.05，**表示<0.01，***表示<0.001。

此外，本研究通過(guò)ELISA對(duì)成骨細(xì)胞標(biāo)記因子ALP及破骨細(xì)胞標(biāo)記因子TRAP進(jìn)行蛋白水平的檢測(cè)，結(jié)果與mRNA變化趨勢(shì)相似，MET可以促進(jìn)由FAC引起的ALP表達(dá)降低，降低由FAC引起的TRAP的表達(dá)升高(圖3：I，J)。證明MET可以在蛋白質(zhì)水平上修復(fù)由FAC誘導(dǎo)的斑馬魚體外骨質(zhì)疏松。

2.4 MET對(duì)成骨細(xì)胞再生具有明顯促進(jìn)作用

本研究還利用轉(zhuǎn)基因品系()[29]誘導(dǎo)模擬斑馬魚體內(nèi)骨質(zhì)疏松模型。該品系中正常胚胎可在成骨細(xì)胞特異表達(dá)紅色熒光蛋白，當(dāng)加入NTR底物MTZ時(shí)，MTZ與NTR反應(yīng)特異性殺死成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞減少，破骨細(xì)胞相對(duì)增加，骨平衡被打破，進(jìn)一步誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥。采用1.5所述的處理方式(圖4A)，收集發(fā)育至5 dpf的幼魚，觀察不同組別的紅色熒光蛋白表達(dá)情況并進(jìn)行茜素紅染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：相比于對(duì)照組，MTZ模型組的紅色熒光的表達(dá)在匙骨(cl)、孔蓋(op)、副蝶骨(ps)、鰓條骨(branchiostegal, bs)、麥柯耳軟骨(Meckel’s car-tilage, mk)及軟骨內(nèi)成骨(entochondrostosis, en)等區(qū)域整體明顯減弱且呈點(diǎn)狀分布(圖4B)；骨骼染色顯示硬骨脊索(nc)、匙骨(cl)、孔蓋(op)幾乎完全消失(圖4D)，表明成骨細(xì)胞大部分被殺死、硬骨被破壞。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，MTZ組的熒光表達(dá)區(qū)域及染色面積均顯著減少，約為對(duì)照組的1/10甚至更低水平。加入MET后，紅色熒光恢復(fù)完整、硬骨染色明顯恢復(fù)接近于對(duì)照組，甚至超過(guò)陽(yáng)性藥物ED組(圖4：C，E)。結(jié)果表明，MET可以有效修復(fù)MTZ誘導(dǎo)引起的成骨細(xì)胞損傷，且這一修復(fù)作用是通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞再生實(shí)現(xiàn)的。

圖4 MET對(duì)轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(osx: mCherry-Ntr)成骨細(xì)胞再生具有明顯促進(jìn)作用

A：給藥示意圖；B：熒光表達(dá)腹部觀；C：相對(duì)熒光面積統(tǒng)計(jì)分析；D：茜素紅染色腹部觀；E：相對(duì)礦化面積統(tǒng)計(jì)分析；F：ALP、TRAP蛋白相對(duì)表達(dá)量。CTR：空白對(duì)照組；MTZ：甲硝唑誘導(dǎo)組；ED：依替膦酸二鈉恢復(fù)組；MET：二甲雙胍恢復(fù)組。cl：匙骨；op：孔蓋；bs：鰓條骨；ps：副蝶骨；mk：麥柯耳軟骨；en：軟骨內(nèi)成骨；nc：脊索。與CTR組比較，#表示<0.05，##表示<0.01，###表示<0.001；與MTZ組比較，*表示<0.05，**表示<0.01，***表示<0.001。

進(jìn)一步檢測(cè)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞標(biāo)記因子的蛋白質(zhì)水平變化，得到相似的結(jié)果，MTZ誘導(dǎo)引起ALP蛋白水平下降至對(duì)照組的30%，MET處理能將其恢復(fù)至60%左右，MET能顯著修復(fù)由MTZ引起的TRAP表達(dá)增高，降低至與對(duì)照組相當(dāng)?shù)乃?圖4F)。上述結(jié)果表明MTZ誘導(dǎo)的體內(nèi)骨質(zhì)疏松模型中，MET能通過(guò)促進(jìn)成骨細(xì)胞再生，增強(qiáng)成骨標(biāo)記因子的蛋白表達(dá)水平，抑制破骨細(xì)胞活性發(fā)揮修復(fù)功效。

2.5 MET對(duì)斑馬魚成骨的促進(jìn)及損傷修復(fù)的作用機(jī)制

為了探索MET對(duì)斑馬魚成骨的促進(jìn)及損傷修復(fù)的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了Bmp信號(hào)通路基因和的表達(dá)情況。收集用0.1% MET處理24 hpf的胚胎進(jìn)行整胚原位雜交，結(jié)果表明：MET能促進(jìn)和在頭部、軀干和尾部的表達(dá)有明顯增加(圖5A)。用MET持續(xù)處理至8 dpf，通過(guò)ELISA檢測(cè)Bmp相關(guān)蛋白，結(jié)果同樣表明，與CTR組相比，MET可以顯著增加Bmp2b、Bmp4相關(guān)蛋白標(biāo)識(shí)物的表達(dá)量(圖5B)，這表明MET對(duì)Bmp信號(hào)通路的促進(jìn)作用不僅可以發(fā)生在胚胎的早期發(fā)育階段，還可以持續(xù)到晚期。

本研究還進(jìn)一步檢測(cè)了骨質(zhì)疏松模型中Bmp信號(hào)成員的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)水平變化。在FAC誘導(dǎo)的體外骨質(zhì)疏松模型中，對(duì)不同組別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR擴(kuò)增、特異片段，通過(guò)對(duì)電泳條帶及條帶灰度進(jìn)行分析(圖5：C，D)，發(fā)現(xiàn)FAC組表達(dá)量顯著下降，約為對(duì)照組的10%，MET組與FAC組相比有顯著升高，修復(fù)效果接近對(duì)照組水平，且明顯高于陽(yáng)性對(duì)照組。不僅如此，在MTZ誘導(dǎo)的斑馬魚體內(nèi)骨質(zhì)疏松模型中，Bmp2b和Bmp4的蛋白表達(dá)水平變化與體外誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松模型mRNA變化趨勢(shì)相似，MET可以促進(jìn)由MTZ引起的Bmp2b、Bmp4表達(dá)降低(圖5E)。上述結(jié)果表明，不論是體外或是體內(nèi)誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松模型，MET通過(guò)調(diào)控Bmp家族成員的轉(zhuǎn)錄及蛋白水平變化，進(jìn)而促進(jìn)骨骼損傷修復(fù)。

BRE (Bmp response element)是Bmp信號(hào)的下游響應(yīng)元件，品系可表征Bmp的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性。為了探究MET在mRNA水平對(duì)骨骼發(fā)育信號(hào)通路的作用，本研究通過(guò)原位雜交檢測(cè)0.1% MET處理24 hpf后的轉(zhuǎn)基因胚胎。結(jié)果可見，MET對(duì)在鰓弓(branchial arch, ba)、腹鰭原基(ventral fin primordium, fb)的表達(dá)有明顯促進(jìn)作用(圖5F)，初步表明MET不僅可以增強(qiáng)Bmp的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)，還可以通過(guò)激活Bmp下游信號(hào)通路促進(jìn)斑馬魚骨骼發(fā)育和損傷修復(fù)。

3 討論

斑馬魚骨質(zhì)疏松模型廣泛應(yīng)用于藥物抗骨質(zhì)疏松有效成分的篩選[17]，MET作為治療2型糖尿病一線藥物的同時(shí)，對(duì)癌癥、腫瘤以及某些慢性疾病等具有一定的預(yù)防作用[2]。本研究結(jié)果表明，二甲雙胍對(duì)斑馬魚的硬骨、脊椎骨均有明顯促進(jìn)作用，同時(shí)，對(duì)由FAC誘導(dǎo)的體外骨質(zhì)疏松及MTZ誘導(dǎo)的體內(nèi)骨質(zhì)疏松模型均有顯著的修復(fù)作用，二甲雙胍可能通過(guò)激活Bmp信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞再生從而修復(fù)骨骼損傷。

目前，二甲雙胍對(duì)骨骼影響的作用機(jī)制尚未完全明確，本研究?jī)H對(duì)骨骼發(fā)育相關(guān)信號(hào)通路進(jìn)行了初步探索，對(duì)于該信號(hào)通路的下游轉(zhuǎn)錄因子p-Smad1/5/8是否能在MET作用下被磷酸化入核是本課題組今后需要進(jìn)一步研究的內(nèi)容。其次，還可利用成魚尾鰭再生模型和骨質(zhì)疏松模型探究MET是否對(duì)斑馬魚成魚的骨骼發(fā)育及損傷修復(fù)也具有相同的作用機(jī)制，進(jìn)一步完善MET對(duì)斑馬魚不同魚齡階段的骨骼發(fā)育的影響。此外，由于骨質(zhì)疏松癥為糖尿病慢性并發(fā)癥之一，兩者之間的關(guān)系可能并非簡(jiǎn)單的單向影響[30,31]，其相互作用關(guān)系也有待今后繼續(xù)探究，后續(xù)的工作中我們將通過(guò)糖尿病誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松模型研究MET對(duì)糖尿病引發(fā)的骨損傷修復(fù)作用及機(jī)理。本研究以治療糖尿病的常用藥物為研究對(duì)象，用斑馬魚構(gòu)建骨質(zhì)疏松模型，探究二甲雙胍在骨骼發(fā)育及損傷修復(fù)的作用及機(jī)制，研究結(jié)果可為二甲雙胍老藥新用提出了新的研究方向和思路。

圖5 MET對(duì)斑馬魚成骨的促進(jìn)及損傷修復(fù)的作用機(jī)制

A：24 hpf骨骼相關(guān)信號(hào)通路基因的mRNA水平表達(dá)；B：Bmp2b、Bmp4蛋白相對(duì)表達(dá)量；C：、基因擴(kuò)增電泳圖；D：對(duì)C中電泳條帶的灰度分析；E：Bmp2b、Bmp4蛋白相對(duì)表達(dá)量；F：表達(dá)胚胎背面觀。CTR：空白對(duì)照組；FAC：枸櫞酸鐵銨誘導(dǎo)組；Holf：Holfreter水陰性對(duì)照組；MTZ：甲硝唑誘導(dǎo)組；ED：依替膦酸二鈉恢復(fù)組；MET：二甲雙胍處理組。ba：鰓弓；fb：腹鰭原基。與CTR組比較，#表示<0.05，##表示<0.01，###表示<0.001；與CTR組(B圖)或FAC組(D圖)或MTZ組(E圖)比較，*表示<0.05，**表示<0.01，***表示<0.001。

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Study on the mechanism of me tformin on zebrafish skeletal development and damage repair

Tingting Jia1, Lei Lei1, Xinyuan Wu1, Shunyou Cai2, Yixuan Chen1, Yu Xue1

Metformin (MET) is a well-known first-line drug used to treat diabetes. However, its therapeutic effect and the underlying mechanism in treatment of skeletal diseases are still unclear. In this study, we used the zebrafish osteoporosis model to explore the function and mechanism of metformin in zebrafish bone development and damage repair through fluorescence observation, bone staining, semi-quantitative PCR,hybridizationand ELISA assays. Firstly, the working concentration of MET was determined to be 0.1% through embryonic lethality, bone mineralization and calcification. At this concentration, MET enhanced the bone development of zebrafish embryos and juveniles through up-regulation of bone regulatory factors at the mRNA and protein levels. Furthermore, we used ferric ammonium citrate (FAC) and NTR/MTZ system to build zebrafish osteoporosis modelsand, followed by MET treatment, and the experimental results showed that MET can restore the osteoporotic phenotypes, such as the decreased bone mineralization area, reduced spine calcification, and weakened osteogenic differentiation induced by FAC or MTZ, and it functioned through promoting osteoblast regeneration, enhancing the expression of osteoblast markers (, ALP), and inhibiting the activities of osteoclast markers (,,TRAP). Finally, we detected the expression levels of Bmp signaling components, and our preliminary data showed that MET can not only enhance the transcriptional and protein expression levels of Bmp, but also promote zebrafish bone development and damage repair by activating Bmp downstream signaling. Taken together, our results show that in addition to treating diabetes, MET can also promote zebrafish bone development and has a significant repair effect on osteoporosis, which will provide new research directions and experimental support for the new applications of old drugs.

metformin (MET); zebrafish; osteoporosis; damage rapair; Bmp

2021-07-13;

2021-09-13;

2021-12-03

福建省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：2020J01823，2019J01744)，閩南師范大學(xué)培育項(xiàng)目(編號(hào)：MSPY202101)和福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目(編號(hào)：JAT190357)資助[Supported by the Natural Science Foundation of Fujian Province (Nos. 2020J01823, 2019J01744), Minnan Normal University Cultivation Project (No. MSPY202101) and Educational Research Project for Young and Middle-aged Teachers of Fujian Provincial Department of Education (No. JAT190357)]

賈婷婷，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：化學(xué)生物學(xué)。E-mail: 948450471@qq.com

薛鈺，博士，副教授，研究方向：細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)。E-mail: xueyu0614@163.com

10.16288/j.yczz.21-250

(責(zé)任編委: 劉峰)