孫萌，劉偉，劉海霞，于波

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的臨床診斷一直備受關(guān)注。目前冠狀動(dòng)脈造影是其診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”[1]，但操作有創(chuàng)傷性、成本高，并伴有副作用的產(chǎn)生，嚴(yán)重限制了其應(yīng)用規(guī)模?，F(xiàn)有的一些傳統(tǒng)生物標(biāo)志物（如超敏C 反應(yīng)蛋白等）又不能很好地判定疾病的發(fā)生，時(shí)常導(dǎo)致漏診或誤診。因此，迫切需要一種能夠發(fā)現(xiàn)特異性生物標(biāo)志物的方法，為疾病的早期診斷提供更有價(jià)值的參考指標(biāo)。

代謝組學(xué)的研究對(duì)象是處于代謝途徑末端的內(nèi)源性小分子化合物，可以更直接、準(zhǔn)確地反映機(jī)體狀態(tài)，故代謝組學(xué)為發(fā)現(xiàn)潛在生物標(biāo)志物提供了新方法。目前代謝組學(xué)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于心血管疾病的臨床診斷與發(fā)病機(jī)制研究[2-5]，但對(duì)于早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中生物標(biāo)志物的研究卻鮮有報(bào)道。呂曉鵬等[6]、張冬偉等[7]利用代謝組學(xué)技術(shù)探討早期動(dòng)脈粥樣硬化患者的血液生物標(biāo)志物。然而，這些研究均以健康志愿者作為對(duì)照者，對(duì)照組缺乏血管狹窄程度的客觀證據(jù)，并且試驗(yàn)樣本量均較小，使得篩選出的生物標(biāo)志物存在假陽(yáng)性或非特異性的可能。

本研究采用液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry，LC-QTOF/MS）聯(lián)用的代謝組學(xué)方法分析早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者和對(duì)照者血漿代謝物差異，結(jié)合模式識(shí)別方法，尋找與早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變密切相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 對(duì)象及分組

選取2012 年8 月至2014 年7 月在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科住院并行冠狀動(dòng)脈造影術(shù)且定量分析（QCA）測(cè)定狹窄度<50%的患者。排除心肌梗死患者；曾做過(guò)經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療或冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)的患者；合并重度心力衰竭伴超聲心動(dòng)圖左心室射血分?jǐn)?shù)<30%的患者；明確診斷有糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)等代謝性疾病的患者；伴有嚴(yán)重肝腎功能不全的患者；患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統(tǒng)疾病、嚴(yán)重感染性疾病或多器官功能衰竭的患者；妊娠期或哺乳期女性。進(jìn)一步根據(jù)冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果將符合上述要求的120例研究對(duì)象分為：對(duì)照組（冠狀動(dòng)脈造影未發(fā)現(xiàn)任何可辨認(rèn)的斑塊或狹窄）60 例和早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組（QCA 測(cè)定冠狀動(dòng)脈狹窄<50%）60 例。本研究經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有血液樣本的采集和臨床資料的收集均獲得受試者本人知情同意。

1.2 樣品采集與制備

所有研究對(duì)象于入院后第2 日清晨空腹采集肘靜脈血3 ml，加入乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采血管中，以3 000 r/min 離心10 min，吸取上清液（血漿）分裝后，立即放入-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)樣前，將血漿樣品從-80 ℃冰箱中取出，于4 ℃條件下解凍。取100 μl 置于2 ml 離心管中，加入500 μl 乙腈溶液，充分渦旋2 min 后，于4 ℃下以14 000 r/min 離心15 min，取上清液于真空離心濃縮儀中抽干。殘留物以100 μl 75%乙腈溶液復(fù)溶，渦旋混勻1 min 后，于4℃，14 000 r/min 離心15 min，吸取上清液至進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.3 液相色譜分離條件

血漿樣本中代謝物的分離是在1260 型液相色譜儀（Agilent 公司，美國(guó)）上采用二元溶劑梯度洗脫方式完成。色譜柱為ZORBAX SB-C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A 為含0.1%甲酸的水溶液，流動(dòng)相B 為含0.1%甲酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下：0～18.0 min，5%～98%流動(dòng)相B；18.0～21.0 min，98%流 動(dòng) 相B；21.0～21.1 min，98%～5%流 動(dòng) 相B；21.1～28.0 min，5%流動(dòng)相B；流動(dòng)相流速為0.5 ml/min；柱溫維持在40℃；進(jìn)樣量為10 μl。

1.4 QTOF/MS 質(zhì)譜分析條件

樣品經(jīng)LC 分離后不分流直接注入Agilent 6530四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀中，分別在電噴霧離子源的正離子模式（ESI+）和負(fù)離子模式（ESI-）下進(jìn)行代謝輪廓分析。相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：脫溶劑氣溫度為350 ℃；脫溶劑氣流量為10 L/min；碎裂電壓為110 V；毛細(xì)管電壓分別為+4 000 V/-3 500 V；以一級(jí)質(zhì)譜全掃描（MS）模式對(duì)質(zhì)荷比（m/z）范圍50～1 000 內(nèi)的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行采集，掃描頻率為0.5 s。為了對(duì)代謝物進(jìn)行鑒定，采用二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）掃描方式獲得質(zhì)譜碎片信息，高純氮?dú)庾鳛榕鲎矚怏w，碰撞能量分別設(shè)為10 V、20 V、40 V。

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理

將檢測(cè)得到的原始數(shù)據(jù)通過(guò)Agilent 自帶的MassHunter Qualitative Analysis 軟件轉(zhuǎn)換為mzdata 格式，然后導(dǎo)入到R 語(yǔ)言XCMS 程序包中進(jìn)行保留時(shí)間校正、峰識(shí)別、峰匹配、峰對(duì)齊和濾噪等過(guò)程，其中相關(guān)參數(shù)設(shè)置如下：method=“centWave”，peakwidth=c（10，50），其余參數(shù)采用默認(rèn)值，最終得到一個(gè)包含質(zhì)荷比、保留時(shí)間與峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)矩陣。進(jìn)一步對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，即將每個(gè)離子的峰強(qiáng)度除以該樣品中所有離子峰強(qiáng)度之和。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與差異代謝物的篩選

將上述歸一化后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 11.5 軟件中進(jìn)行偏最小二乘判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA），獲得變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）值，用于尋找與疾病相關(guān)的差異代謝物。進(jìn)一步采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行單變量統(tǒng)計(jì)分析（Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)），得到組間有差異的代謝物（P<0.05）。將同時(shí)滿足VIP>1 和P<0.05 的變量篩選為最終的差異代謝物。為了排除PLS-DA 模型存在過(guò)擬合的危險(xiǎn)，本研究采用隨機(jī)置換檢驗(yàn)（經(jīng)100 次置換）考察建立模型的有效性。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的基本情況比較（表1）

表1 兩組患者的基本情況（±s）

表1 兩組患者的基本情況（±s）

注：-：無(wú)

早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組的男性為37 例，女性為23 例，平均年齡為（58.43 ± 9.69）歲；而對(duì)照組的男性為29例，女性為31例，平均年齡則為（55.88 ± 9.50）歲。經(jīng)比較分析可得，兩組患者在年齡、性別上的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，除了載脂蛋白A在兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其它各項(xiàng)指標(biāo)在組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于選擇試驗(yàn)對(duì)象的條件限制，所有早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組患者為冠狀動(dòng)脈造影顯示至少一支主支冠狀動(dòng)脈管腔直徑狹窄<50%者，其平均狹窄程度為（36.53 ± 12.82）%，而對(duì)照組全部患者為經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影確認(rèn)冠狀動(dòng)脈管腔未發(fā)現(xiàn)任何可辨認(rèn)斑塊或狹窄者。

2.2 血漿樣品代謝輪廓分析

通過(guò)LC-QTOF/MS 平臺(tái)獲得早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組及對(duì)照組的血漿樣品總離子流色譜圖，如圖1 所示。早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組和對(duì)照組的總離子流圖中的譜峰大體上是一致的，無(wú)法直接從譜圖上觀察出兩組的差異，說(shuō)明兩組間可能存在復(fù)雜、微弱的變化，因此需要采用統(tǒng)計(jì)分析和模式識(shí)別方法進(jìn)一步挖掘出組間的差異和其中潛在的生物標(biāo)志物。經(jīng)XCMS 軟件對(duì)圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理后，正、負(fù)離子模式下分別得到3 892 個(gè)和2 936 個(gè)變量。

圖1 兩組患者血漿樣本的總離子流色譜圖

為了探討早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者和對(duì)照者之間的血漿代謝差異，找到與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)的生物標(biāo)志物，本研究對(duì)早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組和對(duì)照組樣本進(jìn)行PLS-DA 分析，結(jié)果如圖2A 和2B 所示，在正、負(fù)離子模式下，早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組和對(duì)照組血漿樣本幾乎完全分開(kāi)，說(shuō)明兩組患者體內(nèi)的代謝模式明顯不同。ESI+和ESI-對(duì)應(yīng)的模型質(zhì)量參數(shù)分別為：R2X=0.178，R2Y=0.933，Q2=0.540 和R2X=0.168，R2Y=0.943，Q2=0.356。從上述參數(shù)可以看出本研究建立的模型具有較高的可靠性。置換檢驗(yàn)結(jié)果（圖2C，2D）亦證實(shí)了PLS-DA 模型的有效性。

圖2 早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組和對(duì)照組血漿代謝輪廓的PLS-DA 得分圖和置換驗(yàn)證圖

2.3 潛在生物標(biāo)志物的篩選與鑒定

依據(jù)1.6 所述方法進(jìn)行早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化潛在生物標(biāo)志物的篩選，最終在正、負(fù)離子模式下分別篩選鑒定出20 個(gè)和22 個(gè)潛在生物標(biāo)志物，結(jié)果詳見(jiàn)表2。兩組間差異代謝物的變化情況采用變異倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）表示，F(xiàn)C 值為歸一化的數(shù)據(jù)在兩組之間的比值（早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組/對(duì)照組）的對(duì)數(shù)（以2 為底數(shù)），正值代表代謝物相對(duì)含量升高；負(fù)值代表代謝物相對(duì)含量降低。與對(duì)照組相比，早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組患者血漿樣本中磷脂酰膽堿（PC）（14:0/14:0）、植物鞘氨醇、鞘氨醇、甘油單酯（MG）（18:2）、MG（18:3）、MG（18:1）、二十二碳六烯酸、7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸、二十碳三烯酸、亞油酸、亞麻酸、十五烷酸、反油酸、肉豆蔻酸、Δ2-反式-十六碳烯酸、棕櫚酸、二十碳二烯酸、3-羥基癸酸、3-（3-羥基苯基）丙酸、對(duì)甲苯基硫酸、吲哚酚硫酸、月桂?；宜帷⑹级┧岷凸秕Ｒ宜徇@24 種代謝物含量顯著升高，而溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）（18:1）、LysoPC[18:4（6Z，9Z，12Z，15Z）]、LysoPC（20:4）、LysoPC（16:0）、LysoPC（15:0）、LysoPC[22:4（7Z，10Z，13Z，16Z）]、LysoPC[18:2（9Z，12Z）]、LysoPC（18:1）、LysoPC[22:6（4Z，7Z，10Z，13Z，16Z，19Z）]、溶血磷脂酰乙醇胺（LysoPE）（18:2）、磷脂酰乙醇胺（PE）（16:0/0:0）、PE（P-16:0/0:0）、PE（42:8）、磷脂酰甘油（PG）（18:0/0:0）、甘油二酯（DG）（36:3）、DG（38:5）、硫酸普拉睪酮和L-巖藻糖 18 種物質(zhì)含量明顯降低。

表2 潛在生物標(biāo)志物信息

3 討論

本研究共篩選鑒定出42 個(gè)潛在生物標(biāo)志物，其中包括了一些磷脂類物質(zhì)，如LysoPC 和LysoPE等。它們?cè)谠缙诠跔顒?dòng)脈粥樣硬化患者血漿中的含量相比于對(duì)照者發(fā)生了明顯的變化，且大部分物質(zhì)呈下降趨勢(shì)。磷脂不僅種類繁多，而且彼此之間可以相互轉(zhuǎn)化。其中，PC 和PE 可通過(guò)胞二磷-膽堿（CDP-膽堿）途徑合成，兩者之間還可以相互轉(zhuǎn)化，并且兩類物質(zhì)在磷酸酶A2 的水解作用下，分別生成LysoPCs 和LysoPEs。有研究表明，LysoPC和LysoPE 類物質(zhì)有助于抑制巨噬細(xì)胞的合成，阻止巨噬細(xì)胞的泡沫化，從而減少膽固醇的積累和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生[8]。此外，近期一項(xiàng)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，LysoPC 可降低冠心病的風(fēng)險(xiǎn)性[9]。而我們的研究結(jié)果亦證實(shí)了這些發(fā)現(xiàn)。

本代謝組學(xué)研究顯示，MG（18:2）、MG（18:3）和MG（18:1）三種甘油單酯在早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者血漿中的含量顯著上調(diào)，而DG（36:3）和DG（38:5）兩種甘油二酯類物質(zhì)在早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組中呈明顯下降趨勢(shì)。甘油單酯和甘油二酯均參與了甘油糖脂代謝，這說(shuō)明早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化患者體內(nèi)發(fā)生了甘油糖脂代謝的紊亂。人體內(nèi)DGs 的生成主要通過(guò)以下3 種途徑：（1）從頭合成途徑：主要是由磷脂酸在磷酸酶的作用下脫磷酸形成的；（2）由甘油三酯降解生成，該途徑主要受甘油三酯酯酶（ATGL）和激素敏感性脂肪酶（HSL）的作用；（3）通過(guò)甘油單酯途徑合成，該過(guò)程主要由MG酰基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控。而存在的DGs 一方面可以在DG?；D(zhuǎn)移酶的催化下轉(zhuǎn)化為甘油三酯；另一方面，可以降解生成甘油單酯和游離脂肪酸。由此可見(jiàn)，DGs 和MGs 在甘油三酯的合成和分解中起著核心作用。近期一項(xiàng)大規(guī)模隨機(jī)臨床研究證明，DGs 和MGs 是冠心病的致病因素[10]。而MGs 在甘油二酯酯酶和HSL 的催化作用下，由DGs 分解生成。進(jìn)一步可在甘油單酯酯酶的作用下，降解生成甘油和游離脂肪酸。因此，DGs 和MGs 代謝紊亂可能導(dǎo)致游離脂肪酸數(shù)量的增加。過(guò)多的游離脂肪酸可以活化JNK 通路和p38 MAP-kinase 信號(hào)通路分別引起巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移[11]。多項(xiàng)研究表明，巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)和遷移在動(dòng)脈粥樣硬化的形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。因此，異常的DGs 和MGs，尤其是MG（18:2）和MG（18:3），應(yīng)該與早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。

正常情況下，心臟活動(dòng)需要的能量主要來(lái)源于脂肪酸氧化過(guò)程。本研究早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化組患者血漿中的一些長(zhǎng)鏈脂肪酸（例如亞油酸和亞麻酸等）水平顯著高于對(duì)照組，這可能由于在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的條件下，心臟對(duì)氧氣的需求量超過(guò)了供氧量，機(jī)體為了彌補(bǔ)能量供給的不足，增強(qiáng)了患者體內(nèi)長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，這與Zha 等[13]開(kāi)展的代謝組學(xué)研究得到的結(jié)果一致，提示長(zhǎng)鏈脂肪酸的代謝異常可能是觸發(fā)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化產(chǎn)生的關(guān)鍵致病作用。

本研究發(fā)現(xiàn)的潛在生物標(biāo)志物參與了磷脂代謝、糖脂代謝、鞘脂代謝及脂肪酸代謝，這為更加深入了解早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的代謝機(jī)制提供了新的信息。后續(xù)對(duì)這些代謝物及其所在代謝途徑進(jìn)行深入的生物學(xué)研究，有望揭示早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制，同時(shí)也可能為早期冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的治療或干預(yù)提供新方向。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突