趙 萍，唐 紅*，劉興宇，何麗霞

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學 林學院，蘭州 730070；2 甘肅農(nóng)業(yè)大學 信息科學技術學院，蘭州 730070；3 甘肅省牡丹工程研究中心，蘭州 730046)

紫斑牡丹(Paeoniarockii)為芍藥科芍藥屬落葉小灌木，是中國重要的觀賞植物與油料作物之一，同時還具有抗寒、抗旱、耐瘠薄等特性[1]。紫斑牡丹花香，花瓣基部具紫斑，長勢強盛，抗旱、抗寒、抗病、耐土壤瘠薄，具有很高的觀賞及育種價值[2]。在甘肅主要分布于甘肅南部、定西、蘭州等地。‘象牙白’花淡黃白色，長勢強，花香，結實品質(zhì)良好，是臨夏、臨洮等地傳統(tǒng)品種[1]。

花粉粒的體積很小，具有很強的耐干燥性，特別適合儲存，是種質(zhì)資源保存的重要材料之一；雜交是牡丹培育新優(yōu)品種的主要途徑，特別是遠距離雜交和遠緣雜交，需要解決時空不遇和延長花粉壽命等問題，以便與合適的母體進行雜交[3-5]。牡丹花粉的儲存和萌發(fā)率的測定有助于制定適宜的雜交方案，蓋偉玲等[6]通過研究4個牡丹品種的花粉在固體培養(yǎng)基萌發(fā)的情況，認為培養(yǎng)6 h左右是計算牡丹花粉萌發(fā)率的適宜時期。紫斑牡丹單朵花壽命極短，有研究表明，單朵花從開放到衰老僅有7～10 d，因其開花時間的短暫性，花粉壽命也極為短暫，對雜交育種極為不利[7-9]。篩選適合‘象牙白’花粉儲存的適宜方案是延長花粉壽命，解決遠距離雜交的唯一途徑。此外，重瓣牡丹的結實性能更為低下，對其育種和油用價值產(chǎn)生了很大的影響，制約了牡丹產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展[6]。近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，由于溫度和水分的脅迫，花粉萌發(fā)率及壽命與花粉貯存期間活性氧的清除機制及膜脂過氧化水平有關，花粉保護酶活性、丙二醛和蛋白質(zhì)含量保持穩(wěn)定是花粉保持高活力的生理特征[10]。保護酶活性、MDA和蛋白質(zhì)含量的高低可以反映花粉的健康程度，與花粉壽命及生活力具有密切關系，是花粉萌發(fā)力的直接表現(xiàn)[5,11]。目前，有關紫斑牡丹的研究主要集中在引種栽培[12]、遺傳學[7]、油用性能[13]等方面。關于其單瓣與重瓣花花粉結構、萌發(fā)特性和儲存生理機制方面的系統(tǒng)研究尚未見報道。因此，本研究以甘肅省蘭州市榆中縣官灘溝紫斑牡丹培育基地紫斑牡丹‘象牙白’花粉為材料，觀測了單瓣和重瓣紫斑牡丹花粉的形態(tài)結構、不同儲存條件下的壽命，及其儲存期間3種保護酶活性、MDA和蛋白質(zhì)的含量，以期確定‘象牙白’花粉經(jīng)濟、最佳的儲存溫度，探討單瓣和重瓣‘象牙白’花粉壽命與花粉保護酶活性、MDA以及蛋白質(zhì)含量的相關性，解析其花粉壽命在不同儲存環(huán)境下降低的生理機制，為紫斑牡丹重瓣不育性和雜交育種提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 花粉采集

紫斑牡丹‘象牙白’花粉采自甘肅省蘭州市榆中縣官灘溝紫斑牡丹培育基地，于 2021年6月中上旬9:00-11:00，采集同一株牡丹植株上同時具有單瓣與重瓣的將開未開的紫斑牡丹花朵，按單重瓣分別標號，迅速放入冰盒，帶回實驗室。在實驗室中將采回花朵的花萼與外輪花瓣剝?nèi)?，倒扣在硫酸紙上，置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)散粉，24 h后取出，一只手用鑷子夾住倒置的花朵，另一只手輕彈花朵，收集散落的花粉。將收集好的花粉每個編號各分成兩份，一份用于花粉萌發(fā)的測定；另一份 30 ℃ 鼓風干燥箱干燥 24 h 后，分裝至 10 mL 帶蓋離心管中儲存，寫好標簽，備用。

1.2 花粉儲存

將1.1中所得干燥花粉分成7份，每份分裝于2 mL帶蓋離心管中，加入1～2粒硅膠干燥劑后封口，分別存放于室溫(25 ℃)、4 ℃、-20 ℃、-80 ℃下儲存。從儲存之日算起，分別于7、21、60、120、190 d后，分別從4個儲存溫度處理中取單瓣和重瓣花粉各1份(-20、-80 ℃下取出的花粉于35 ℃水浴5～10 min解凍)，取出一部分花粉采用前期實驗所得最適培養(yǎng)基[14]測定花粉萌發(fā)率，統(tǒng)計花粉儲存壽命，另一部分用于測定生理生化指標。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 花粉超微結構將完全干燥的花粉均勻撒在貼有雙面膠的樣品臺上，在掃描電鏡下觀察拍照，記錄花粉粒極軸長(P)、赤道長(E)、萌發(fā)溝長、萌發(fā)溝寬、脊寬度和網(wǎng)眼直徑，每個樣品隨機測量10個以上，并計算平均值。

1.3.2 花粉萌發(fā)率和花粉壽命花粉萌發(fā)培養(yǎng)基由蔗糖、硼酸和瓊脂配制而成。用移液管吸取所需用量加入容量瓶中，加蒸餾水定容后加熱至沸騰，冷卻至 30 ℃。用吸管吸取培養(yǎng)液，滴在載玻片上，待其凝固后，蘸取花粉均勻播種在液滴上，將播種有花粉的載玻片放在鋪有吸水紙的培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在(25±1) ℃ 、全光照下培養(yǎng) 6 h 后于顯微鏡下觀察。取 4 個視野，數(shù)取花粉總數(shù)及萌發(fā)數(shù)，計算萌發(fā)率。統(tǒng)計時，以花粉管長度等于或大于花粉直徑者為萌發(fā)。每個儲存處理設 3 個重復。

花粉萌發(fā)率=萌發(fā)花粉數(shù)/觀察花粉數(shù)×100%。

1.3.3 花粉可溶性蛋白質(zhì)、丙二醛含量及保護酶活性準確稱取0.100 g‘象牙白’花粉，放入4 ℃預冷研缽中，加入 2 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液(pH 7.0)，勻速研磨 30～40 s，之后將研磨液轉移至10 mL離心管中，定容至刻度線。將提取液于10 000 r/min、4 ℃離心 20 min，取出上清液作為提取粗酶液，保存至4 ℃冰箱備用待測。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍法、過氧化氫酶(CAT)活性采用可見光分光光度法、丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法、超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑法、過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法，通過天津市光復科技發(fā)展有限公司提供的試劑盒測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010、SPSS 24和Origin 2021進行作圖與方差分析。

2 結果與分析

2.1 單瓣和重瓣花形態(tài)與花粉表觀特征比較

紫斑牡丹‘象牙白’花粉粒為長橢圓形，兩端逐漸收縮呈截形；花粉粒的3個萌發(fā)溝基本到達兩端，極面觀為近圓形或三角形，網(wǎng)眼直徑大小不等，多為橢圓形、近圓形或不規(guī)則形。其中，單瓣‘象牙白’花瓣白色，花粉數(shù)多(圖 1，A、B)；花粉粒有3個萌發(fā)溝，是孢粉學研究的原始類型；花粉粒平均極軸長為50.98 μm(47.07～57.34 μm)，平均赤道軸長為23.51 μm(21.73～26.69 μm)，極軸長(P)/赤道軸長(E)≈2.18，萌發(fā)溝長44.60 μm(40.10～ 50.16 μm)，萌發(fā)溝寬1.24 μm(0.71～2.19 μm)，網(wǎng)眼直徑1.39 μm(0.99～2.04 μm)，脊寬度0.68 μm(0.45～0.81 μm)(圖 1，C-F)。重瓣‘象牙白’花瓣為白色，花粉較少，部分雄蕊瓣化為花瓣(圖 1，G、H)?；ǚ哿Ｓ?個萌發(fā)溝，萌發(fā)溝幾乎達到兩級，是孢粉學研究的原始類型；花粉粒平均極軸長為43.79 μm(39.63～48.00 μm)，平均赤道軸長為23.42 μm(19.31～24.83 μm)，P/E≈1.88，萌發(fā)溝長為44.60 μm(31.80～45.45 μm)，萌發(fā)溝寬1.24 μm(0.87～3.10 μm)，網(wǎng)眼直徑1.39 μm(0.96～1.71 μm)，脊寬度0.68 μm(0.51～0.92 μm)(圖 1，I-L)。另外，‘象牙白’畸形花粉長在 10～40 μm 之間，總體觀不飽滿、空癟，多為勺狀、三棱狀、不規(guī)則狀等，單瓣和重瓣‘象牙白’畸形花粉分別約占觀察花粉總數(shù)的 20.50%和 35.40%。

A-F.單瓣花；G-L.重瓣花；A、G花形態(tài)；B、H.花粉群體；C、I.赤道面觀；D、J.萌發(fā)溝；E、K.極面觀；F、L.萌發(fā)溝細部圖1 單瓣和重瓣‘象牙白’花形態(tài)與花粉表觀特征A-F. Single flower; G-L. Double flower; A,G. The flower morphology; B,H. Pollen grain; C,I. Polar morphology; D,J. Germinal furrow; E,K. Equatorial morphology; F,L. Fine parts of germinating furrowFig.1 Flower characteristics and pollen grain morphology of single-petal and double-petal ‘Xiangyabai’

2.2 儲存溫度對單、重瓣花花粉壽命的影響

圖2顯示，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’花粉萌發(fā)率表現(xiàn)為單瓣花高于重瓣花，單瓣和重瓣新鮮花粉萌發(fā)率分別為83.62%和72.06%。隨著儲存時間的延長，單瓣和重瓣花花粉萌發(fā)率均逐漸下降，且總體呈現(xiàn)先快后慢的趨勢。隨著儲存溫度的降低，單瓣和重瓣花花粉萌發(fā)率均逐漸增加，且單瓣花在溫度處理間的差異更大。其中，在室溫條件下，花粉萌發(fā)率下降最快，這可能是較高溫度下呼吸作用較強，消耗了較多的營養(yǎng)，導致花粉很快喪失了萌發(fā)力。在儲存第21天前，花粉萌發(fā)率下降極為迅速，之后下降速度減緩；在第120天，單瓣和重瓣花花粉萌發(fā)率均降為0。即室溫條件下單瓣和重瓣花花粉壽命為120 d。在4 ℃儲存條件下，花粉萌發(fā)率下降呈現(xiàn)先快后慢的趨勢，第60天為轉折點，單瓣花和重瓣花花粉的半衰期分別為40和60 d，半衰期前花粉活力下降較為迅速，之后逐漸減緩。在 -20 ℃儲存條件下，花粉萌發(fā)率下降呈現(xiàn)先緩后快的趨勢，第21天為分界點；單瓣和重瓣花花粉半衰期均為120 d。在-80 ℃儲存條件下，花粉萌發(fā)率下降速度最慢，單瓣花和重瓣花花粉萌發(fā)率在儲存190 d后分別為76.39%和65.17%，分別降低為最開始的96.17%和90.44%?？梢姡瑑Υ鏈囟葮O大地影響著紫斑牡丹花粉萌發(fā)率，低溫有助于延長花粉的儲存壽命，4種儲存溫度中-80 ℃最適合花粉的中長期儲存,單瓣花花粉對低溫的適應性高于重瓣。

不同小寫字母表示同一溫度不同儲存時間0.05水平差異顯著性，下同圖2 不同儲存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉萌發(fā)率的變化The different normal letters mean significant difference at 0.05 level among different storage time at the same temperature, the same as belowFig.2 Pollen germination rate of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.3 儲存溫度對單、重瓣花花粉可溶性蛋白含量的影響

從圖 3 可以看出，新鮮單瓣花花粉可溶性蛋白含量高于相應的重瓣花花粉。各溫度處理下單瓣和重瓣花花粉可溶性蛋白含量均先下降后增加，并多在第21天達到最低值，之后隨著儲存時間的延長，花粉可溶性蛋白含量逐漸增加。在儲存190 d時，單瓣和重瓣花花粉可溶性蛋白含量均隨著儲存溫度的降低而下降。其中，單瓣和重瓣花花粉蛋白質(zhì)含量在-80 ℃儲存條件下均較為穩(wěn)定，相較于其他溫度條件波動幅度較?。辉谑覝貤l件下，花粉可溶性蛋白含量變化幅度最大。單瓣花花粉可溶性蛋白含量增速在室溫條件下最快，在4 ℃條件下較快，在第190天時分別已增加為初始值的3.59和1.75倍；而在-20 ℃和-80 ℃條件下增速較慢，第190天時仍低于初始值。重瓣花花粉可溶性蛋白含量在室溫條件下增速最快，在4 ℃條件下增速較快，于第190天時達到最高值，分別增加為初始值的3.31和2.60倍；在-20 ℃條件下，花粉可溶性蛋白含量于第60天時最高，為初始值的3.13倍；-80 ℃條件下，可溶性蛋白含量增速最慢，第190天時為初始值的1.63倍。由此可見，單瓣花花粉可溶性蛋白含量變化在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃條件下趨勢較重瓣花更為穩(wěn)定，說明單瓣花花粉受低溫脅迫影響的程度更??；但在常溫條件下，重瓣花花粉可溶性蛋白含量變化趨勢比單瓣花花粉更為穩(wěn)定。

圖3 不同儲存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉可溶性蛋白含量的變化Fig.3 Soluble protein contents in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.4 不同儲存條件對單重瓣花花粉 MDA 含量的影響

從圖 4 可知，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉MDA含量低于重瓣花花粉；低溫儲存條件下，單瓣和重瓣花花粉MDA含量均隨儲存時間先增加后減少，但重瓣花花粉受低溫脅迫的影響較單瓣花花粉更小。其中，單瓣和重瓣花花粉MDA含量在室溫條件、-20 ℃和-80 ℃下均于儲存第21天達到最高峰，此時分別為初始值5.36倍和5.18倍、4倍和3.89倍、3倍和3.27倍。單瓣和重瓣花花粉MDA含量在4 ℃條件下均于第60天時達到最大，此時分別為初始值的4倍和5.06倍。單瓣和重瓣花花粉MDA含量在室溫條件下變化最為顯著，相較而言均在-80 ℃條件下較為穩(wěn)定。

圖4 不同儲存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉MDA含量的變化Fig.4 Malondial delyde content in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.5 儲存溫度對單、重瓣花花粉3種保護酶活性的影響

2.5.1 SOD 活性圖 5 顯示，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉SOD活性低于重瓣花花粉。在室溫條件下，單瓣和重瓣‘象牙白’花粉SOD活性隨著儲存時間均呈現(xiàn)逐漸快速下降的趨勢，在第120天(花粉萌發(fā)率為0)時分別降為最高值的19.80%和16.39%；相較之下，重瓣花花粉SOD活性下降較單瓣花花粉更為迅速，單瓣花和重瓣花花粉SOD活性在190 d時分別為初始值的4.9%和2.1%。在4 ℃和-20 ℃條件下，單瓣花和重瓣花花粉SOD活性均先增加后減少，在第21天時達到最高峰，這可能與花粉萌發(fā)率的急速下降有關。在-80 ℃條件下，單瓣與重瓣花花粉SOD活性均呈現(xiàn)先緩慢增加后逐漸下降的趨勢，總體變化趨勢相較平穩(wěn)，在190 d后均保持在較高水平，而此時的花粉萌發(fā)率也相對較高?？傮w來看，重瓣花花粉SOD活性受低溫脅迫的影響大于單瓣花花粉。

圖5 不同儲存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉SOD活性的變化Fig.5 Superoxide dismutase activity in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.5.2 POD活性從圖 6可知，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉POD活性低于重瓣花花粉。單瓣和重瓣‘象牙白’花粉POD活性在不同儲存溫度下隨著時間的變化趨勢不同，并在室溫條件下變化趨勢最顯著，在-80 ℃條件下變化趨勢最為平緩；花粉POD活性在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下均表現(xiàn)為先增加后降低，均在第21天達到最高值，在-80 ℃條件下先降低后增加，在第60天達到最低值。其中，第190天時，單瓣和重瓣花花粉POD活性在室溫、4 ℃和-20 ℃條件下分別為最高值的13.62%和17.99%、23.91%和33.30%、40.43%和54.98%；單瓣和重瓣花花粉POD活性在-80 ℃儲存第60天時達到最低值，此時分別降為最高值的38.13%和62.30%。可見，各溫度條件下重瓣花花粉POD活性隨著儲存時間的變化較單瓣花花粉更為平緩，其受低溫脅迫的影響較單瓣花花粉更小。

圖6 不同儲存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉POD活性的變化Fig.6 Peroxidase activity in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

2.5.3 CAT活性從圖 7 來看，新鮮紫斑牡丹‘象牙白’單瓣花花粉CAT活性低于重瓣花花粉。各溫度下單瓣和重瓣花花粉CAT活性隨著儲存時間的變化趨勢總體相近，但不同溫度下的CAT活性存在顯著性差異。其中，單瓣和重瓣花花粉CAT活性均在-80 ℃條件下變化幅度最小，在第60天時分別降為最高值的60.24%和70.51%；均在室溫條件下變化幅度最大，單瓣和重瓣花花粉最高值分別為最低值的5.09和4.14倍。重瓣花花粉CAT活性在低溫儲存過程中相較于單瓣花花粉更為穩(wěn)定。單瓣花花粉CAT活性在室溫、-20 ℃和-80 ℃條件下均先降低后增加，均在第60天達到最低值，而4 ℃條件下呈現(xiàn)增加-降低-增加的趨勢。重瓣花花粉CAT活性在室溫、4 ℃、-20 ℃條件下均呈現(xiàn)先下降后增加的趨勢，在-80 ℃條件下為持續(xù)下降趨勢?？梢?，在4種溫度儲存條件下，兩種花粉CAT活性變化幅度均在室溫條件下最大，均在-80 ℃條件下更為穩(wěn)定，且單瓣花花粉CAT活性受低溫脅迫的影響較重瓣更為明顯。

圖7 不同儲存溫度下單瓣(A)和重瓣(B)‘象牙白’花粉CAT活性的變化Fig.7 Pollen catalase activity in pollen of single-petal (A) and double-petal (B) ‘Xiangyabai’ under different storage temperatures

3 討 論

3.1 單瓣和重瓣花粉萌發(fā)率與儲存溫度的關系

室溫條件下的環(huán)境溫度較高且濕度較大，花粉的呼吸作用以及生理代謝活動較強，導致花粉細胞失水嚴重，從而使花粉的生活力降低，最終使花粉的儲藏壽命縮短。而低溫干燥環(huán)境條件能夠抑制花粉的代謝活動，降低酶活性和呼吸作用，從而減緩花粉生活力下降的速度。也有研究認為低溫、低濕以及低氧的環(huán)境能夠延長花粉的儲藏壽命[15]。低溫儲存是生物材料長期保存最有前途的方法，已經(jīng)廣泛應用于作物、水果、蔬菜和觀賞植物[16]?；ǚ垡蝮w積很小而比較適用于儲存，單瓣花花粉與重瓣花花粉的儲存時間也不盡相同，且花粉壽命在自然條件下僅有9 d左右，適宜的儲存條件可以有效延長花粉壽命，為日常雜交育種提供較高活力的花粉，滿足育種工作的各種需求，因此篩選適宜的花粉儲存條件具有重要的意義。研究表明，芍藥屬植物花粉壽命的長短受多方面因素的制約，一是基因型的控制，基因型的差異嚴重影響花粉的壽命；二是花粉含水量，低含水量是延長花粉壽命的有效措施[17-18]。除此之外，儲存環(huán)境對于花粉的壽命也尤為重要，低溫、干燥和低氧的環(huán)境可有效延長花粉壽命。本實驗結果表明，經(jīng)過不同儲存溫度處理的紫斑牡丹花粉萌發(fā)率較新鮮花粉均有不同程度的降低，室溫儲存的花粉壽命僅有120 d，4 ℃和-20 ℃只適用于花粉的短期保存，而-80 ℃條件下儲存190 d的花粉仍有較高活性和萌發(fā)率，適用于花粉的長期保存。而單瓣與重瓣花花粉的壽命也不同，單瓣花花粉對低溫的適應性高于重瓣花花粉。

3.2 花粉萌發(fā)率與其可溶性蛋白質(zhì)含量的關系

蛋白質(zhì)是花藥發(fā)育過程中積累的營養(yǎng)物質(zhì)，其作為細胞組成中重要的代謝物質(zhì)和能源物質(zhì)，對于花藥和小孢子的正常發(fā)育都極為重要[19]。曾乃燕等[20]對水稻研究的結果認為低溫下可溶性蛋白含量的增加，可能是由于降解速率下降或合成的加強。可溶性蛋白含量是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，一定量的可溶性蛋白能提高細胞的保水能力，從而起到保護細胞膜的作用。本研究中紫斑牡丹單瓣和重瓣花花粉在儲存第21天可溶性蛋白含量達到最低，這可能與花粉前期的活力快速下降有關，儲存21 d后可溶性蛋白含量逐漸增加，溫度越高增加越快，這可能與花粉對不同溫度脅迫下產(chǎn)生了抗逆蛋白有關，抗逆蛋白一旦在植物體內(nèi)形成，植物體就會盡快適應外界環(huán)境，表現(xiàn)出很強的抗逆性[21]。紫斑牡丹單瓣花花粉在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃條件下受低溫脅迫的程度比重瓣花更小,重瓣花花粉在常溫條件下受到的脅迫程度比單瓣花更小，這可能與兩類花粉本身的遺傳基因有關。

3.3 花粉萌發(fā)率與丙二醛含量和抗氧化酶活性的關系

MDA是膜脂過氧化的一個重要指標，在花粉發(fā)育時期的大量積累會使細胞膜結構遭到破壞或損傷, 從而引起細胞內(nèi)生理生化代謝的紊亂。MDA含量的高低代表細胞質(zhì)膜透性的強度，與其是否受到傷害具有密切的相關性[22]。本研究中紫斑牡丹單瓣和重瓣花花粉MDA含量均在各溫度下儲存第21天之前快速上升，在第21天達到高峰，而花粉活力也在同一時間段快速下降，這說明花粉細胞膜受到嚴重的破壞或損傷，膜脂過氧化程度較高[23]?；ǚ跰DA含量在室溫條件下變化程度最為顯著，說明在高溫高濕條件下細胞受到破壞程度更大，而花粉MDA含量變化在-80 ℃儲存時較為平和，花粉萌發(fā)率下降速度極慢，可能是花粉細胞內(nèi)保護酶的協(xié)同作用有效地清除了多余的活性氧，重新達到氧化平衡。同時，植物花粉在利用氧的過程中會形成活性氧，這些活性氧會對植物本身產(chǎn)生毒害作用，從而會發(fā)生體內(nèi)相關組織的生理生化代謝紊亂的現(xiàn)象，SOD、POD、CAT等抗氧化酶可以幫助清除植物體內(nèi)積累的過剩有氧自由基，防止活性氧過度積累而造成膜質(zhì)受損。研究表明，保護酶活性一定程度上是生物體機能維持的重要指標[24-25]。生物材料貯存過程中形成的活性氧引起的氧化應激是造成細胞損傷，甚至誘導細胞凋亡的主要原因之一，也可能是不同貯存環(huán)境花粉壽命差異明顯的原因之一[26]。保護酶活性的穩(wěn)定與花粉保存質(zhì)量具有相關性，保護酶活性的大幅增加或降低可能預示著植物材料萌發(fā)率的下降[27]，在本研究花粉萌發(fā)率下降最快期間，花粉細胞膜質(zhì)過氧化加劇，活性氧、自由基增多，但隨著時間延長、脅迫加劇，3 種保護酶不足以消除細胞內(nèi)積累的活性氧，導致有害物質(zhì)積累，花粉細胞死亡，花粉萌發(fā)率隨之下降。-80 ℃儲存條件下，紫斑牡丹花粉3種保護酶活性在不同時間階段均保持較為平穩(wěn)，花粉萌發(fā)率接近新鮮花粉萌發(fā)率，這說明-80 ℃儲存環(huán)境使花粉基本處于代謝平衡狀態(tài)，健康程度高，因此花粉仍然具有較高的萌發(fā)力。

4 結 論

紫斑牡丹‘象牙白’重瓣花花粉平均極軸長、平均赤道軸長、極軸長/赤道軸長均小于單瓣花花粉，其萌發(fā)溝長和寬、脊寬度和網(wǎng)眼直徑與單瓣花花粉區(qū)別不大。紫斑牡丹花粉小粒、癟粒和畸形是導致其萌發(fā)率較低的主要原因，不同生存環(huán)境下花粉遺傳特性存在差異，僅花粉表觀不足以揭示其系統(tǒng)演化規(guī)律。儲存溫度直接影響紫斑牡丹‘象牙白’花粉壽命，室溫適合單瓣和重瓣花花粉1～120 d的短期儲存，4 ℃、-20 ℃適合花粉較長時間的儲存，-80 ℃適合花粉的長期儲存。在室溫、4 ℃和-20 ℃儲存期間，單瓣和重瓣花粉可溶性蛋白含量顯著降低后再增高，抗逆蛋白的形成是花粉萌發(fā)率下降速率減緩的主要原因；花粉MDA含量和3種抗氧化酶SOD、POD、CAT活性隨著儲存時間顯著變化，清除活性氧自由基能力下降，細胞膜脂過氧化程度加劇，細胞損傷加重是花粉萌發(fā)率在儲存期間下降的主要原因。花粉在-80 ℃儲存條件下基本處于代謝平衡狀態(tài)，健康程度較高，在長期儲存后仍然具有較高的萌發(fā)力。重瓣花花粉受到低溫脅迫的影響程度高于單瓣花花粉，在相同儲存條件下相較于單瓣花花粉，重瓣花花粉細胞受損程度更高、萌發(fā)率下降速率更快。