陳思琪,孟 晗,衡 蒙,金雪花,孔祥瑩
(昆明理工大學(xué) 建筑與城市規(guī)劃學(xué)院,昆明 650504)
鐵筷子(HelleborusthibetanusFranch.)別名黑嚏根草、九牛七、小桃兒七,作為觀賞植物又稱之為圣誕玫瑰,為毛茛科鐵筷子屬多年生常綠草本[1-2],因其在冬季開(kāi)花、花期長(zhǎng),且花型葉型頗具觀賞價(jià)值,近年來(lái)逐漸成為深受人們喜愛(ài)的觀賞植物,但因該植物多為國(guó)外引種栽培,市價(jià)普遍居高,國(guó)內(nèi)對(duì)于鐵筷子觀賞價(jià)值的研究鮮有報(bào)道,因此開(kāi)展鐵筷子觀賞性狀方面的研究工作迫在眉睫。
目前有關(guān)于毛茛科植物花色的研究已有不少記載,但對(duì)于毛茛科鐵筷子屬植物花色的研究還未見(jiàn)詳細(xì)報(bào)道,前人對(duì)鐵筷子的研究多以其種子培育[3]、藥用價(jià)值[4]、葉[5]及根莖化學(xué)成分[6-8]方面為主,其觀賞性狀方面的研究甚少,花色呈色機(jī)理尚未清楚。植物花色的呈色與其色素有關(guān)[9-11],這些色素包括三大類:類黃酮、類胡蘿卜素和生物堿,花青素苷是類黃酮中最重要的一類水溶性色素[12-13]能夠使植物呈現(xiàn)從紅到藍(lán)的不同顏色,主要包含了矢車菊素、飛燕草素、矮牽牛素、錦葵素、天竺葵素和芍藥素等6類;此外花色的呈色還受金屬離子的螯合[14]、液泡pH等[15]多方面因素的影響。本研究選用7個(gè)不同花色的鐵筷子作為試驗(yàn)材料,對(duì)不同品種花瓣中色素成分及含量進(jìn)行分析,以期解析鐵筷子花色呈色機(jī)理,為該物種花色改良、新品種培育提供理論基礎(chǔ)。
供試植物材料均于2020年12月下旬至2021年1月上旬期間收集并栽培在昆明理工大學(xué)園林植物溫室中直至花朵開(kāi)放,選擇處于盛花期的不同單株且著色均勻的花瓣作為研究材料。按照顏色將7個(gè)品種鐵筷子分為紅色系(A、B)、紫色系(C)、粉色系(D、E)和黃色系(F、G)(圖1)。
圖1 鐵筷子各色系品種及編號(hào)Fig.1 The different varieties and numbers of H. thibetanus
每個(gè)品種選擇3個(gè)長(zhǎng)勢(shì)相近的不同單株采集花瓣,利用英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)比色卡(RHSCC)進(jìn)行比色和色差儀進(jìn)行測(cè)色,測(cè)量環(huán)境選擇于室內(nèi)避免陽(yáng)光直射的區(qū)域。使用RHSCC比色卡測(cè)色時(shí)將花瓣中間部分與比色卡進(jìn)行比色,以3人在相同的角度和距離條件下觀察到的結(jié)果為依據(jù)記錄色系范圍。
使用色差儀(CR-400Konica Minolta China investment Ltd.)以光源C/2°為條件測(cè)量花色,測(cè)量時(shí)將花瓣正面平置于干凈的白紙上,將激光口對(duì)準(zhǔn)花瓣中間部位進(jìn)行測(cè)量,每個(gè)單株測(cè)量3次取平均值。記錄測(cè)量出的明度(L*)、紅度(a*)和黃度(b*),并利用公式C*=[(a*)2+(b*)2]1/2;h°=arctan(b*/a*)計(jì)算出彩度C*和色相角的值h°。
1.3.1 花青素苷提取將存于-80 ℃條件下的鐵筷子樣品取出,放入研缽內(nèi)用液氮迅速研磨至細(xì)粉末狀,待液氮揮發(fā)后加入配制好的花青素苷提取液(V甲醇∶V水∶V甲酸∶V三氟醋酸=70∶27∶2∶1)提取花青素苷[16]。每250 mg樣品加入1 mL提取液,將樣品和提取液放入離心管混合,并置于震蕩器上充分震蕩后放置于4 ℃冰箱內(nèi)浸提,期間每隔12 h震蕩一次,待浸提24 h后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾上清液得到樣品,保存于-80 ℃環(huán)境下以待檢測(cè)。
1.3.2 花青素苷成分及含量測(cè)定花青素苷含量的測(cè)定采用高效液相色譜法-光電二極管陣列檢測(cè)方法(HPLC-DAD),檢測(cè)儀器為Agilent Q-TOF 6540液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀,泵為P680型,自動(dòng)進(jìn)樣器(UltiMate 3000),紫外可見(jiàn)光檢測(cè)器(DAD-100),柱溫箱(TCC-100),色譜柱為Agilent公司的ZORBAX型SB-C18(4.6 mm×250 mm),濾鏡為5 μm。HPLC測(cè)定條件為:設(shè)置流動(dòng)相A、B兩項(xiàng),A相為水∶甲酸∶三氟醋酸=97.9∶2∶0.1;流動(dòng)相B相為水∶乙腈∶甲酸∶三氟醋酸=62.9∶35∶2∶0.1。進(jìn)樣前先進(jìn)行超聲脫氣和0.2 μm超微過(guò)濾,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫25 ℃,流速0.8 mL/min。流動(dòng)相B的洗脫梯度為:0~3 min,10%~10%;3~30 min,10%~20%;30~40 min,20%~45%;40~45 min,45%~80%;45~56 min,80%~10%;56~65 min,10%~10%;在波長(zhǎng)為525 nm處檢測(cè)花瓣中花青素苷吸收的峰面積[17-18]。采用半定量法計(jì)算花青素苷含量,根據(jù)HPLC-DAD分析結(jié)果,對(duì)氯化矢車菊素(Cyanidin chloride)進(jìn)行線性回歸分析,繪制其濃度與峰面積之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線,利用待測(cè)樣品的峰面積計(jì)算花青素苷濃度及鐵筷子花瓣中花青素苷的含量。所用標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于成都普思生物科技股份有限公司。
花青素苷成分的定性分析采用高效液相色譜-電噴霧離子化-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-ESI-MS)選取具有典型特征的樣本進(jìn)行測(cè)定,再根據(jù)特征離子進(jìn)行花青素苷結(jié)構(gòu)的推定。液相色譜分析條件及程序同上,質(zhì)譜檢測(cè)條件為:電噴霧離子化(ESI),離子阱分析器,全質(zhì)量掃描范圍(m/z):100~1 700 u;正離子檢測(cè)模式,毛細(xì)管電壓為3 500 V,噴霧器壓力200 kPa,毛細(xì)管出口電壓100 V,保護(hù)蓋出口電壓117 V,干燥溫度350 ℃,干燥氣體流速為8.0 L/min[19]。
采用Excel 2019軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì),用SPSS 22軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析和逐步多元回歸分析。
通過(guò)分析7個(gè)品種鐵筷子花瓣的明度(L*)、紅度(a*)和黃度 (b*)值發(fā)現(xiàn)不同品種的鐵筷子花色越深則L*值越低(表1),其中黃色(G)、黃紅色(F)及桃粉色(E)的品種L*值相比于深紅色(A)、紫紅色(B)及紫色(C)品種的L*值較高,且顏色最深的B品種L*值為7個(gè)品種中最低的。紫色(C)品種的a*值最高,其次是深紅色(A)品種,而兩個(gè)黃色系品種紅度值(a*)是最低的。反觀b*值,黃色品種(G)的b*值最高,紫色品種(C)的b*值最低。由于彩度值(C*)是通過(guò)a*值和b*計(jì)算得到的,因而紅度和黃度值對(duì)C*值影響比較大,在所測(cè)品種中黃色品種的彩度值較高,而紫紅色品種的彩度值最低。
表1 鐵筷子各品種花瓣花色表型
對(duì)7個(gè)品種的鐵筷子所測(cè)的L*、a*、b*值和C*值進(jìn)行擬合曲線分析,經(jīng)過(guò)相關(guān)性檢驗(yàn)及分析得出L*值與a*值呈顯著的負(fù)相關(guān)(R2=0.8142),(圖2,A);L*值與b*值呈顯著的正相關(guān)(R2=0.7042),(圖2,B);L*值與C*值呈顯著的正相關(guān)(R2=0.5522),(圖2,C),由此說(shuō)明鐵筷子花瓣的b*、C*值均為其花色的明暗程度變化的影響因素。
A為L(zhǎng)*值與a*值的相關(guān)性分析;B為L(zhǎng)*值與b*值的相關(guān)性分析;C為L(zhǎng)*值與C*值的相關(guān)性分析圖2 鐵筷子花瓣L*與a*、b*和C*的關(guān)系Fig.A is the correlation analysis between L* value and a* value; Fig.B shows the correlation analysis between L* value and b* value. Fig.C shows correlation analysis between L* value and C* valueFig.2 The relationship between L* and a*, b*,C* of H. thibetanus flowers
采用高效液相色譜法在波長(zhǎng)525 nm處對(duì)鐵筷子樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果(表2)顯示在供試的7個(gè)品種中有2個(gè)品種未檢測(cè)出花青素苷的成分,為桃粉色(E)和純黃色(G),其余的5個(gè)品種共檢測(cè)出11種不同類型的花青素苷成分,將它們按保留時(shí)間由短到長(zhǎng)依次編號(hào)為:S1~S11。
表2 鐵筷子花瓣中花青素苷HPLC-ESI-MS分析及結(jié)構(gòu)推定
利用HPLC-ESI-MC技術(shù)輔助獲得樣品的特征峰,根據(jù)不同保留時(shí)間的出峰情況和特征離子的質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行推算花青素苷的種類和結(jié)構(gòu);參照紫外可見(jiàn)光譜440 nm波長(zhǎng)下吸收峰與最大波長(zhǎng)下吸收峰的比值(A440/Avis-max)判斷花青素苷是否發(fā)生5位取代,若比值小于20%則5位被糖苷化,比值大于30%時(shí)花青素苷的結(jié)構(gòu)為3-O-糖苷類型且5位處未發(fā)生糖苷化[20];根據(jù)290~340 nm處是否有肩峰的出現(xiàn)判斷化合物是否被芳香酸?;痆21],以往的研究表明同科植物具有相似的代謝途徑,在毛茛科植物中發(fā)現(xiàn)含有槐糖修飾的花青素苷[22],推測(cè)在鐵筷子花瓣色素成分中可能含有槐糖基團(tuán)的修飾。
自然條件下的花青素極不穩(wěn)定,需要與糖類結(jié)合形成穩(wěn)定的花青素苷,再進(jìn)一步甲基化、?;揎椥纬刹煌N類的花青素苷[28],從而影響植物花色的呈色?;ㄇ嗨氐奶腔揎検紫仍贑-3位[20],有時(shí)進(jìn)一步C-5、C-7位糖基化[24],花青素苷經(jīng)過(guò)?;揎椏尚纬筛叻€(wěn)定性和顯色性的花青素苷,?;幕鶊F(tuán)分為脂肪酰基(主要有乙二?;?、丙二?;?、丁二?;⒁阴;?與芳香酰基(主要有肉桂?;?、香豆?;?、咖啡?;?[29-30]。
本研究檢測(cè)出的11種花青素苷中有6種矢車菊素苷(S1、S3、S4、S7、S10、S11);4種飛燕草素苷(S2、S5、S8、S9)以及一種矮牽牛素苷(S6),它們分別使植物呈紅色、藍(lán)色和紫色。通過(guò)紫外可見(jiàn)光分析發(fā)現(xiàn)供試的鐵筷子品種中所含花青素均只在C-3位置上發(fā)生了糖苷化,?;揎椂嘁苑枷沲;鶠橹鳎觉;鶠檩o。深紅色品種的色素成分中有5種花青素苷被芳香酰基修飾,紫紅色和紫色品種中均含有4種?;揎椀幕ㄇ嗨剀眨郯咨贩N中含有3種?;揎椀幕ㄇ嗨剀?,黃紅色品種中僅含2種?;揎椀幕ㄇ嗨剀?。不同糖基、?;男揎検菍?dǎo)致鐵筷子花色差異的一個(gè)原因,本研究在鐵筷子花瓣中發(fā)現(xiàn)含有芳香酰基化修飾的品種花瓣藍(lán)移進(jìn)而使花色加深。
采用標(biāo)準(zhǔn)品半定量法計(jì)算7種鐵筷子花瓣中總花青素苷含量(TA),結(jié)果顯示(表3)品種A(深紅色花瓣)中總花青素苷含量最高,品種B(紫紅色花瓣)次之,然后依次是品種C(紫色花瓣)、品種D(粉白色花瓣)、品種F(黃紅色花瓣),但在G(黃色花瓣)、E(桃粉色花瓣)中未檢測(cè)出花青素苷成分。所檢測(cè)出含有花青素苷的5個(gè)品種均含有矢車菊素和飛燕草素,在品種C(紫色花瓣)中除了飛燕草素和矢車菊素之外,還檢測(cè)到矮牽牛素成分。其中品種A(深紅色花瓣)矢車菊素的含量占總花青素苷含量的84.96%,植物呈現(xiàn)出深紅色;品種B(紫紅色花瓣)中,飛燕草素的含量占總花青素苷含量的75.91%,花瓣呈現(xiàn)出紫紅色;品種C(紫色花瓣)中矢車菊素含量占總花青素苷含量的56.79%,矮牽牛素含量占總花青素苷含量的25.10%,飛燕草素含量?jī)H占總花青素苷含量的18.11%;品種D(粉白色花瓣)中,矢車菊素和飛燕草素含量分別占總花青素苷含量的53.11%和46.89%,品種F(黃紅色花瓣)中分別為54.54%和45.46%。綜上,矢車菊素苷和飛燕草素苷為鐵筷子總花青素苷含量的主要貢獻(xiàn)者。
表3 不同品種鐵筷子的總花青素苷含量和主要花青素苷含量
進(jìn)一步通過(guò)制作擬合曲線來(lái)分析花青素苷含量與不同花色之間的關(guān)系,將總花青素苷的含量(TA)作為自變量,以所測(cè)的L*、a*、b*、C*值作為因變量形成擬合曲線(圖3,A~D)。圖3顯示,總花青素苷含量與紅度值(a*)呈正相關(guān),與L*、b*、C*值呈負(fù)相關(guān)關(guān)系,其中與L*值之間的相關(guān)性顯著(回歸系數(shù)為0.8671)與a*、b*、C*值之間的相關(guān)性不顯著。當(dāng)總花青素苷含量的累積,則a*值增加,花瓣的顏色越趨向紅色。
A為總花青素苷含量與L*值的相關(guān)性分析;B為總花青素苷含量與a*值的相關(guān)性分析;C為總花青素苷含量與b*值的相關(guān)性分析;D為總花青素苷含量與C*值的相關(guān)性分析圖3 鐵筷子花瓣TA與L*、a*、b*和C*的關(guān)系A(chǔ) shows the correlation analysis between total anthocyanin content and L* value; B shows the correlation analysis between total anthocyanin content and a* value; C shows the correlation analysis between total anthocyanin content and b* value. Fig.D shows correlation analysis between total anthocyanin content and C* valueFig.3 The relationship between TA and L*, a*, b*, C* of H. thibetanus Franch. flowers
將矢車菊素苷、飛燕草素苷含量分別與L*、a*、b*、C*值進(jìn)行相關(guān)性分析,以矢車菊素苷和飛燕草素苷作自變量,L*、a*、b*、C*值作因變量繪制擬合曲線,以此推導(dǎo)數(shù)量關(guān)系發(fā)現(xiàn)色素含量除與紅度值(a*)呈正相關(guān)外,與L*、b*、C*均呈現(xiàn)負(fù)相關(guān),但單一種類的花青素苷含量與L*、a*、b*值之間未見(jiàn)顯著的相關(guān)性,除飛燕草素苷與L*值之間的回歸系數(shù)R2=0.511以外,其他系數(shù)均小于0.5。
植物花青素苷的累積量不同影響著植物花色明度、紅度、黃度和彩度的變化[12,31],本研究供試的7種鐵筷子花瓣的L*值由低到高分別為紫紅色、深紅色、紫色、粉白色、桃粉色、黃紅色、純黃色,且L*值與總花青素苷的含量TA值呈顯著負(fù)相關(guān),即隨著花青素苷的積累明度下降,這與前人研究的紫花含笑(Micheliacrassipes)[32]、麗格海棠(Riegerbegonia)[33]有關(guān)花青素苷含量對(duì)花色明度影響的結(jié)果一致,說(shuō)明花青素苷含量的變化是影響鐵筷子花色明暗變化的重要因素之一。從花青素苷含量與花瓣的彩度值、紅度值方面的分析來(lái)看,隨著總花青素苷含量增加鐵筷子花瓣的彩度值下降,這與王歡等[34]對(duì)雙色百合(bicolor lily)研究的結(jié)論一致;花青素苷含量的增加鐵筷子花瓣的紅度值也增加,植物花瓣所呈現(xiàn)的顏色越向紅色偏移,該結(jié)果與前人對(duì)貼梗海棠[Chaenomelesspeciosa(Sweet)Nakai][21]研究中花青素苷含量的累積有助于紅色形成的結(jié)論相符。值得注意的是品種B中總花青素苷含量不是本研究所有品種中最高,但其顏色卻是最暗,在關(guān)于深色花的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)致使花色變深的原因不僅有花青素苷的高積累,還有花瓣顯微結(jié)構(gòu)下色素的分布[35]、花瓣的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、不同花青素苷對(duì)呈色的貢獻(xiàn)[36]以及其他色素(如原花青素苷)的作用等多方面因素,因此本研究中B品種鐵筷子顏色深的原因有待進(jìn)一步研究。
花青素苷的不同成分是影響其花色變化的重要因素,不同的花青素、修飾基團(tuán)的數(shù)量和修飾方式都對(duì)植物花色呈色產(chǎn)生不同程度的影響。在檢測(cè)出花青素苷的5個(gè)品種中矢車菊素為主要的色素物質(zhì),其次為飛燕草素,在石蒜屬(LycorisHerb)植物[31]和耐寒睡蓮(Nymphaeaspp.)[13]中也發(fā)現(xiàn)矢車菊素和飛燕草素兩類花青素為影響呈色的主要物質(zhì)。矢車菊素苷和飛燕草素苷分別是使植物呈紅色和藍(lán)色的重要物質(zhì),兩者同時(shí)存在時(shí)可使植物呈現(xiàn)出紫紅色?;ò曛珪?huì)向含量更高的色素偏移,而其他色素成分則起到輔助作用[37],在供試材料B品種中檢測(cè)出2種飛燕草素衍生物和3種矢車菊素衍生物,該品種中飛燕草素衍生物的含量是矢車菊素衍生物含量的3倍多,在兩種色素的共同作用下花色呈現(xiàn)紫紅色。酰基化的作用使植物藍(lán)色加深[38-40],本研究發(fā)現(xiàn)含有多種?;揎椀娘w燕草素苷[41]的鐵筷子所呈現(xiàn)的紫色越深,即品種B、C中含有2類?;w燕草素苷,而品種A中僅含有1類,品種B、C比A的顏色越向藍(lán)色偏移呈現(xiàn)出越深的紫色。此外,脂肪族?;头枷阕艴;揎棇?duì)鐵筷子花色的呈現(xiàn)也有影響,通常情況下脂肪族?;瘜?duì)花青素苷的顏色變化影響較小[42],芳香酰基化花青素苷比脂肪?;姆€(wěn)定性更強(qiáng)[43],在鐵筷子花瓣的色素結(jié)構(gòu)分析中發(fā)現(xiàn)?;揎椂嘁苑枷沲;鶠橹?,咖啡酰、香豆酰、肉桂酰的修飾可能是鐵筷子花色產(chǎn)生差異的因素。
綜上,花青素苷的成分及含量是導(dǎo)致鐵筷子花瓣呈現(xiàn)不同顏色的主要原因,矢車菊素苷和飛燕草素苷的互作以及?;男揎検硅F筷子呈現(xiàn)不同程度的紫色,花青素苷的不同累積量影響了花瓣顏色的明暗變化,從而使鐵筷子花瓣顏色豐富。本研究的結(jié)果為鐵筷子花色呈色機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ),為進(jìn)一步挖掘花色基因、花色改良、培育花色新品種提供一定的參考。