王思淇，張克強(qiáng)，孔德望，高文萱，韋紅，梁軍鋒，李佳佳，杜連柱*

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所，天津 300191；2.杭州能源環(huán)境工程有限公司，杭州 310020；3.華標(biāo)（天津）科技有限責(zé)任公司，天津 300392）

厭氧干發(fā)酵具有節(jié)水、低能耗、低污染負(fù)荷、反應(yīng)器體積小以及產(chǎn)氣效率高等優(yōu)勢，是有機(jī)固體廢棄物轉(zhuǎn)化為生物能源的重要手段。2010—2015年，歐洲厭氧干發(fā)酵處理能力增長了50%，處理量占厭氧發(fā)酵總量的35%。在我國，厭氧干發(fā)酵逐漸引起重視，有望成為畜禽養(yǎng)殖糞便、作物秸稈等有機(jī)廢棄物處理和資源化利用的主流工藝。厭氧干發(fā)酵按照發(fā)酵溫度可分為中溫（30~40℃）、嗜熱（50~60℃）發(fā)酵，按照發(fā)酵過程可分為一階段、兩階段或多階段消化。LIAO等在厭氧消化反應(yīng)器中采用改進(jìn)的攪拌方式，與傳統(tǒng)的低固厭氧消化（總固體含量為4.2%±0.4%）相比，高固厭氧消化（總固體含量為15.7%±0.4%）沼氣產(chǎn)量提高了1.85倍。VOELKEIN等的研究結(jié)果表明，55℃、高有機(jī)負(fù)荷率[揮發(fā)性固體（VS）含量3~4 kg·L·d]下，單位質(zhì)量VS的日甲烷產(chǎn)率高達(dá)405 L·kg。ZHANG等評估餐廚垃圾與園藝廢物的三階段高溫厭氧共消化產(chǎn)氣性能，結(jié)果表明三級(jí)嗜熱反應(yīng)器中的平均甲烷產(chǎn)率分別比一級(jí)、二級(jí)高約45%和31%。

然而，厭氧干發(fā)酵由于有機(jī)負(fù)荷高、傳質(zhì)效率低，常常導(dǎo)致啟動(dòng)慢、效率低、周期長等問題，其中，揮發(fā)性脂肪酸（Volatile fatty acid，VFA）的積累引起的對產(chǎn)甲烷菌的抑制是主要原因之一。如何解除酸抑制是國內(nèi)外研究的重點(diǎn)，目前已開發(fā)出了添加外源物質(zhì)（如堿性試劑、微量元素等）、生物強(qiáng)化（添加或富集某種特定的菌）和消化液循環(huán)等多種技術(shù)。如WEI等的研究結(jié)果表明，加入微量元素可以緩解酸抑制作用，產(chǎn)甲烷量從0.13 L·g增加至0.44 L·g。ZHANG等的研究表明，添加NaOH調(diào)節(jié)初始pH至7.5，足以抵消厭氧消化系統(tǒng)pH值的下降，確保微生物的最適生長范圍，從而有效緩解酸抑制效應(yīng)。李丹妮等研究了蛭石、海泡石和生物炭對混合厭氧發(fā)酵過程中酸抑制的緩解效應(yīng)，結(jié)果顯示添加劑比例達(dá)到20%時(shí)可獲得最大累積甲烷產(chǎn)量，并且生物炭的效果最優(yōu)。LU等在接種物中添加乙酸溶液以富集耐酸性產(chǎn)甲烷菌，試驗(yàn)結(jié)果表明，在適應(yīng)酸40 d后，接種抗酸接種物使得啟動(dòng)階段產(chǎn)甲烷量顯著提升。XUE等在玉米秸稈的厭氧消化中將50%的消化液再循環(huán)，該反應(yīng)器產(chǎn)沼氣量比對照組高33.3%，平均沼氣產(chǎn)量和甲烷產(chǎn)量分別比對照組高58.4%和61.5%。同時(shí)，已有大量文獻(xiàn)報(bào)道微生物群落在厭氧共消化過程中的作用，如WANG等在對比玉米秸稈和豬糞共消化與單獨(dú)消化微生物群落動(dòng)態(tài)變化的實(shí)驗(yàn)中，采用16SrRNA測序技術(shù)，闡明共消化系統(tǒng)獲得高甲烷產(chǎn)量的內(nèi)在原因。本課題組前期研究結(jié)果表明，分層接種能促進(jìn)系統(tǒng)內(nèi)乙酸和丁酸的分解轉(zhuǎn)化，即使在較低接種比下，仍能縮短厭氧干發(fā)酵遲滯期，提高甲烷產(chǎn)率，體系中較好的產(chǎn)甲烷性能是由于氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑占主導(dǎo)地位。上述研究為緩解酸抑制、提高厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能提供了有益借鑒。由于對酸抑制發(fā)生過程及與酸抑制密切相關(guān)的細(xì)菌、古菌的結(jié)構(gòu)及功能缺乏深入研究，導(dǎo)致酸抑制解除技術(shù)措施缺乏足夠的理論依據(jù)，效果尚有待進(jìn)一步提升。

本研究以豬糞為主要原料，開展批式厭氧干發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，對比酸抑制下豬糞秸稈混合發(fā)酵、豬糞單獨(dú)發(fā)酵產(chǎn)氣性能。采用MiSeq高通量測序技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)，分析酸抑制下細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌群落多樣性，闡明群落結(jié)構(gòu)組成和變化特征，明晰引起細(xì)菌和產(chǎn)甲烷古菌群落變化的主控環(huán)境因子，揭示酸抑制對厭氧干發(fā)酵體系中微觀結(jié)構(gòu)的影響，以期為揭示厭氧干發(fā)酵酸抑制機(jī)理、開發(fā)酸抑制防控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)裝置與樣品采集

本實(shí)驗(yàn)裝置和所取樣品與文獻(xiàn)[14]一致。實(shí)驗(yàn)裝置為有機(jī)玻璃材質(zhì)的自制立式厭氧反應(yīng)器，其有效高度為750 mm，有效內(nèi)徑為20 mm。裝置側(cè)面于垂直方向上設(shè)多個(gè)直徑為15 mm的取樣口，并用橡膠塞密封。裝置頂部設(shè)有閥門控制的排氣口并接鋁制集氣袋。豬糞和玉米秸稈均取自天津市西青區(qū)某規(guī)模化養(yǎng)殖場，新鮮豬糞當(dāng)日采集后置于冰箱冷藏[（4±1）℃]存放，玉米秸稈自然風(fēng)干后粉碎至1 mm，置于通風(fēng)處干燥；接種物取自實(shí)驗(yàn)室上一批次實(shí)驗(yàn)剩余物。相關(guān)理化性質(zhì)見表1。

表1 底物和接種物的理化指標(biāo)Table 1 Characteristics of substrates and inoculum

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)以豬糞為主要原料，以酸抑制下的厭氧干發(fā)酵系統(tǒng)為研究對象。設(shè)置豬糞單獨(dú)發(fā)酵（P）、豬糞秸稈混合發(fā)酵（M）兩組發(fā)酵系統(tǒng)。每組發(fā)酵原料的總進(jìn)料量均為10.22 kg，總固體（TS）為20.3%，接種比為25%（以VS計(jì)），其中M發(fā)酵組中糞稈比為1∶1（以VS計(jì)）。每組發(fā)酵方式設(shè)3組平行。裝料后檢測氣密性，向各反應(yīng)器中通入氮?dú)庖詣?chuàng)造厭氧環(huán)境，室溫[（25~35）℃]下進(jìn)行發(fā)酵。

1.3 理化參數(shù)測定

采用集氣袋法收集氣體，每1~2 d測定沼氣產(chǎn)量和甲烷百分含量；每2~3 d從反應(yīng)器側(cè)面取樣冷藏以供理化指標(biāo)測定；并根據(jù)產(chǎn)氣情況及理化指標(biāo)變化，在發(fā)酵過程中的0 d（初始階段）、13 d（Ⅰ階段）、33 d（Ⅱ階段）、45 d（Ⅲ階段）和78 d（Ⅳ階段）從反應(yīng)器側(cè)面取發(fā)酵樣品冷凍保存以供微生物分析。TS和VS含量、沼氣產(chǎn)量、沼氣組分和發(fā)酵體系VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析測量方法見文獻(xiàn)[14]，將取回的固體樣品稀釋10倍，振蕩混勻后用pH計(jì)測定pH值。

1.4 DNA提取與PCR擴(kuò)增

采用E.Z.N.AMag-Bind Soil DNA Kit（OMEGA bio-tek,USA）試劑盒提取樣品DNA，利用瓊脂糖凝膠檢測DNA完整性，并用Nanodrop 2000分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific，美國）測定DNA含量。

針對細(xì)菌和古菌16Sr RNA基因的V3~V4高變區(qū)序列，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。細(xì)菌第一輪擴(kuò)增引物為341F（CCCTA?CACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTAC?GGGNGGCWGCAG）和805R（GACTGGAGTTCCTTG?GCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC），第二輪擴(kuò)增引入Illumina橋式PCR兼容引物。古菌引用槽式PCR擴(kuò)增三輪，第一輪使用擴(kuò)增引物M-340F（CCCTAYGGGGYGCASCAG）和GU1ST-1000R（GGCCATGCACYWCYTCTC）；第二輪使用第一輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增引物為349F（CCCTA?CACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GYGCASCAG?KCGMGAAW）和806R（GACTGGAGTTCCTTG?GCACCCGAGAATTCCAGGACTACVSGGGTATCT?AAT）；第三輪擴(kuò)增中引入Illumina橋式PCR兼容引物。對于細(xì)菌和古菌擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物和正常擴(kuò)增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）進(jìn)行DNA純化回收。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，按照1∶1的等量混合后測序，測序平臺(tái)為MiSeq 2×300。

1.5 數(shù)據(jù)分析

使用Excel 2020和Origin 8.5進(jìn)行理化指標(biāo)統(tǒng)計(jì)并繪制圖表。在QIIME中調(diào)用Uclust（1.1.579）軟件，設(shè)置97%相似性，對有效DNA序列數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU分類，并對測序序列隨機(jī)抽樣，將抽到的序列數(shù)與其代表的OTU數(shù)目構(gòu)建稀釋曲線。采用Mothur軟件進(jìn)行Alpha多樣性分析，計(jì)算Chao、ACE、Shannon、Simpson和Coverage指數(shù)。利用RDP軟件比對Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種分類，在門和屬水平上統(tǒng)計(jì)樣本中物種的相對豐度。選取屬水平OTU豐度前50的代表性序列與數(shù)據(jù)庫中與其種屬信息一致的序列，使用MUSCLE進(jìn)行多序列比對后，采用FastTree根據(jù)最大似然法（Approximately-maximum-likelihood phylogenetic trees）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，推測未被分類菌屬在發(fā)酵體系中的作用。利用Canoco 5.0軟件進(jìn)行冗余分析（Redundancy analysis，RDA），評價(jià)發(fā)酵系統(tǒng)中環(huán)境因子對主要微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 酸抑制下厭氧干發(fā)酵的產(chǎn)氣性能

圖1為日甲烷產(chǎn)量（以VS計(jì)，下同）和沼氣中甲烷含量隨發(fā)酵時(shí)間的變化圖。P組的產(chǎn)甲烷性能在70 d前要優(yōu)于M組。由圖可知，P組的啟動(dòng)時(shí)間長，前28 d日甲烷產(chǎn)量低于0.59 mL·g，之后明顯升高，47 d時(shí)達(dá)到3.32 mL·g，但峰值出現(xiàn)時(shí)間短，峰谷差較大，產(chǎn)氣性能不穩(wěn)定。與P組相比，10~70 d內(nèi)M組的日甲烷產(chǎn)量相近，但在28~70 d內(nèi)明顯低于P組。與日甲烷產(chǎn)量相對應(yīng)，P組的甲烷含量在28~48 d內(nèi)逐漸升高至66.80%，M組甲烷含量56 d前低于30%，之后明顯上升，70 d時(shí)高于50%。這表明P組和M組發(fā)酵產(chǎn)氣受到明顯抑制，M組抑制作用更強(qiáng)。KAIN?THOLA等的研究結(jié)果表明，厭氧共消化可以減小甲烷產(chǎn)生速率的峰谷差，從而確保穩(wěn)定的甲烷產(chǎn)量。但本實(shí)驗(yàn)中M組產(chǎn)甲烷性能明顯較P組差，日甲烷產(chǎn)量一直處于低水平狀態(tài)，這可能是由于M組體系中酸化作用顯著，產(chǎn)氣效率受到影響。56 d后M組甲烷含量明顯升高，表明共消化體系中的產(chǎn)甲烷作用得到恢復(fù)，與JIANG等研究結(jié)果相似。

圖1 P組和M組產(chǎn)甲烷性能比較Figure 1 Comparison of methane production performance between Pand Msystems

2.2 厭氧干發(fā)酵酸抑制過程中pH與VFA的變化

兩組發(fā)酵體系過程中pH變化如圖2所示。反應(yīng)初期，有機(jī)物被水解型細(xì)菌水解為VFA，而產(chǎn)甲烷古菌對有機(jī)固廢有一定的適應(yīng)期，推測此時(shí)水解型細(xì)菌生長速率大于產(chǎn)甲烷古菌，出現(xiàn)酸積累，pH值相應(yīng)降低。隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行，產(chǎn)甲烷古菌能及時(shí)將體系內(nèi)VFA轉(zhuǎn)變?yōu)榧淄椋琍組的pH值于30 d后開始升高，結(jié)合圖1，此時(shí)P組產(chǎn)甲烷速率和甲烷產(chǎn)量均呈上升趨勢。而M組的pH值總體上無明顯升高趨勢，并且體系中產(chǎn)氣性能較差。雖然稀釋固態(tài)樣品測得的pH值會(huì)有一定偏差，但總體變化趨勢仍能反映體系中總揮發(fā)性有機(jī)酸（TVFAs）的大致情況，以便后續(xù)對體系中VFA的變化進(jìn)行深入分析。

圖2 厭氧干發(fā)酵過程中pH變化Figure 2 Variations of pH during the experiment

兩組發(fā)酵體系過程中VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化如圖3所示。第8 d起，M組VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始高于P組，之后兩組間的VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)差呈現(xiàn)遞增趨勢，并至61 d質(zhì)量分?jǐn)?shù)差最大，達(dá)17.23 mg·g。8~78 d M組與P組的VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)差主要來源于丁酸，丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)差介于2.14~11.97 mg·g。DEMIREL等得出結(jié)論，當(dāng)丙酸質(zhì)量濃度超過951 mg·L時(shí)會(huì)抑制產(chǎn)甲烷菌的生長，而此時(shí)加入丁酸可在一定程度上改善其抑制作用。WANG等的研究中，丁酸質(zhì)量濃度最高至1 800 mg·L時(shí)對產(chǎn)甲烷菌的活性沒有明顯抑制。本實(shí)驗(yàn)中P組丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)自第45 d起開始下降，并至54 d消耗完全；M組丁酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)自第15 d起直至發(fā)酵結(jié)束一直保持在9.49~12.68 mg·g，結(jié)合圖1可知，本實(shí)驗(yàn)中丁酸可能不是引起酸抑制效應(yīng)的原因。

圖3 厭氧干發(fā)酵過程中VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化Figure 3 Variations of concentration of VFA during the experiment

由于高質(zhì)量濃度的丙酸積累意味著消化失衡，在P組消化過程的后期（48 d后），丙酸作為體系中VFA的主要組成成分，會(huì)破壞厭氧消化的性能，使得產(chǎn)氣性能大幅度下降。前期研究表明，厭氧發(fā)酵體系中最適的丙酸質(zhì)量濃度范圍在800~3 000 mg·L，超過此范圍不利于產(chǎn)甲烷菌降解利用。本實(shí)驗(yàn)中，P組的丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10~78 d超出抑制質(zhì)量濃度（3 000 mg·L），且P組丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在第61 d時(shí)迅速增加至9.89 mg·g，發(fā)酵結(jié)束時(shí)到達(dá)峰值10.58 mg·g。而在45 d后，P組乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)從5.01 mg·g驟降至0.58 mg·g，結(jié)合圖1，說明本實(shí)驗(yàn)中P組酸抑制的主體可能是高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的丙酸。M組的丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)雖然在8~78 d超出抑制質(zhì)量濃度，但在15 d至發(fā)酵結(jié)束時(shí)丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)在5.18~7.33 mg·g范圍內(nèi)波動(dòng)，而乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)卻在第48 d時(shí)下降了28.88%，結(jié)合圖1，說明本實(shí)驗(yàn)中M組酸抑制的主體可能是高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的乙酸。M組前期酸化嚴(yán)重，阻礙了產(chǎn)甲烷菌的生長，而水解產(chǎn)酸菌對pH的耐受范圍更廣，對VFA耐受能力更強(qiáng)，因此M組前期水解過程未受到明顯抑制，從而加重了混合發(fā)酵體系中的酸抑制效應(yīng)。有研究報(bào)道，相比于單獨(dú)消化，共消化具有多種優(yōu)勢，可以改善C/N并豐富微生物群落，但本研究中M組酸抑制效應(yīng)更強(qiáng)?？赡苁窍到y(tǒng)有機(jī)負(fù)荷過高，水解產(chǎn)酸菌會(huì)產(chǎn)生大量VFA，而產(chǎn)甲烷古菌代謝速率較為緩慢，無法在短時(shí)間內(nèi)快速利用產(chǎn)生的VFA，從而造成酸抑制現(xiàn)象，因此仍需從微生物角度分析本實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生酸抑制效應(yīng)的原因。結(jié)合前期的研究，分層接種的發(fā)酵方式可以促進(jìn)體系內(nèi)乙酸和丁酸的分解轉(zhuǎn)化，縮短發(fā)酵遲滯期，進(jìn)一步證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中M組發(fā)酵啟動(dòng)困難與體系中VFA的積累有關(guān)。

2.3 古菌和細(xì)菌多樣性分析

在OTU為97%的相似性水平下，對2組發(fā)酵體系中古菌群落的多樣性進(jìn)行分析。由表2可見，所有樣本均有99%的覆蓋率，Shannon指數(shù)稀釋曲線（圖4a）隨著序列數(shù)的增加迅速趨于平緩，表明每個(gè)樣品中的主要微生物種群均具有可靠的測序深度。Chao指數(shù)和ACE指數(shù)與微生物群落的豐富度呈正相關(guān)，第Ⅰ階段兩組發(fā)酵體系的菌群豐富度都有一定的下降，可能是由于體系中VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)突然增加使得物種仍處在適應(yīng)期。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，P組的物種豐富度基本呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，而M組末期（第Ⅳ階段）群落豐富度顯著下降。Shannon指數(shù)與Simpson指數(shù)體現(xiàn)了局域均勻環(huán)境下的微生物群落的多樣性，Shannon指數(shù)與多樣性呈正相關(guān)，Simpson指數(shù)與之相反；前者強(qiáng)調(diào)豐富性，后者側(cè)重于均勻性?？傮w上，M組的物種多樣性不如P組，且發(fā)酵中后期（Ⅲ~Ⅳ階段）OTU分布的均勻度顯著降低。上述結(jié)果表明，混合發(fā)酵體系中古菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，物種多樣性和分布均勻度都明顯下降。表明VFA積累抑制了產(chǎn)甲烷過程，使古菌多樣性下降。

表2 古菌群落多樣性指數(shù)Table 2 Richnessand diversity of archaeal communities

圖4 古菌和細(xì)菌的Shannon指數(shù)稀釋曲線圖Figure 4 Shannon rarefraction plot of archaeal and bacterial communities

P組與M組發(fā)酵體系中古菌群落在門、屬水平上的分布結(jié)果如圖5所示。在門水平上主要有2種優(yōu)勢菌門，其中廣古菌門（Euryarchaeota）占絕對優(yōu)勢，相對豐度在95.41%~99.66%，泉古菌門（Crenarchaeota）約占0.23%~4.08%。目前已知的產(chǎn)甲烷古菌主要屬于Euryarchaeota，能將厭氧消化過程中分解大分子有機(jī)物產(chǎn)生的乙酸、H、CO和甲基類小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)變成甲烷。在屬水平上，專性乙酸營養(yǎng)型的甲烷絲菌屬（）與氫營養(yǎng)型的甲烷微菌屬（）、甲烷球形菌屬（）以及甲烷短桿菌屬（）是2個(gè)體系中的優(yōu)勢菌屬。其中，在PⅠ中升高至45.48%后保持相對穩(wěn)定，而在M組中從M0的43.04%降低至MⅠ、MⅡ中的28.23%和21.49%。HINSBY等的研究表明，當(dāng)相對豐度增加時(shí)，能夠促進(jìn)厭氧干發(fā)酵產(chǎn)甲烷過程，結(jié)合圖1，M組中期甲烷含量較低，且該菌的相對豐度與日甲烷產(chǎn)量呈正相關(guān)，這與前期的研究結(jié)果一致。相對豐度在2個(gè)發(fā)酵組中隨著時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，結(jié)合圖2可知，階段Ⅰ~Ⅱ中VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)處于較高水平（P組：22.35~26.34 mg·g；M組：24.58~32.17 mg·g），此時(shí)對應(yīng)的該菌相對豐度較大（P組：21.96%~22.97%；M組：37.06%~38.32%），可見相對豐度與VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。只能專性利用H/甲醇產(chǎn)甲烷，無法利用乙酸和H/CO等物質(zhì)，因此隨著發(fā)酵過程中VFA的積累，2個(gè)體系中該菌的相對豐度均呈現(xiàn)降低趨勢。對酸性不敏感且代謝類型多樣，因此在2個(gè)體系的發(fā)酵后期均逐漸富集，其在厭氧發(fā)酵過程中相對豐度的變化沒有特定的規(guī)律可循，仍需進(jìn)一步的研究。此外，隨著消化過程的進(jìn)行，M組群落中氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌（、、、和）總體相對豐度范圍在57.09%~77.19%，這表明M組發(fā)酵體系中以氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑為主。有研究表明，氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌比乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌有更高的活性，且在高VFA環(huán)境壓力下大多數(shù)產(chǎn)甲烷菌會(huì)經(jīng)歷氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑，推測在酸抑制環(huán)境下氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌的占比與厭氧干發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣性能密不可分。

圖5 古菌在門水平和屬水平上群落結(jié)構(gòu)多樣性分析Figure 5 Analysis of archaeal diversities at the phylumand genus level

同古菌分析方法一致，細(xì)菌群落多樣性指數(shù)見表3，Shannon指數(shù)稀釋曲線（圖4b）表明測序深度可靠。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，M組中細(xì)菌豐富度逐漸增加并高于P組，可見混合原料發(fā)酵可以改善發(fā)酵系統(tǒng)中C/N，平衡營養(yǎng)，給予微生物充足的微量元素?？傮w上來說，較低的Simpson指數(shù)表明單獨(dú)發(fā)酵的OTU分布更均勻。在厭氧發(fā)酵體系中，微生物群落多樣性越高，產(chǎn)氣性能越好。M0~Ⅱ階段Shannon指數(shù)均分別低于P0~Ⅱ，可見M組前期的水解酸化階段加重了體系內(nèi)酸抑制效應(yīng)。對比表2和表3，無論是單獨(dú)發(fā)酵還是混合發(fā)酵體系，細(xì)菌群落多樣性和豐富度均明顯高于古菌。

表3 細(xì)菌群落多樣性指數(shù)Table 3 Richness and diversity of bacterial communities

P組與M組發(fā)酵體系中細(xì)菌群落在門、屬水平上的分布結(jié)果如圖6所示。厚壁菌門（Firmicutes）是主要的優(yōu)勢菌門，相對豐度均在73%以上，最高達(dá)92%。其次是擬桿菌門（Bacteroidetes），占0.99%~16.51%，變形菌門（Proteobacteria）最高也有6.76%的占比。Firmicutes門多為水解型細(xì)菌，主要功能是將纖維素、木質(zhì)素以及脂肪和蛋白質(zhì)水解成為小分子酸；Bacteroidetes則可以將蛋白質(zhì)等水解酸化為小分子有機(jī)酸。Firmicutes在M0~Ⅱ的相對豐度逐漸增加，說明玉米秸稈、糞便被較好地分解利用，秸稈的加入增加了接種物中潛在的電子供體含量，極大地刺激了微生物活性。此外，有研究報(bào)道Firmicutes能夠形成內(nèi)生孢子以抵御不良環(huán)境，因此即使在酸化嚴(yán)重的環(huán)境下該菌門的相對豐度依然很高。兩個(gè)體系中，發(fā)酵末期（第Ⅳ階段）Firmicutes相對豐度最低，而Bacteroidetes明顯升高，這可能與大分子底物被分解消耗、小分子有機(jī)酸逐漸積累有關(guān)。Proteobacteria和綠彎菌門（Chloroflexi）常見于厭氧發(fā)酵體系，能夠水解一定的有機(jī)大分子化合物，2菌門相對豐度在M組的發(fā)酵前期（Ⅰ~Ⅱ階段）均呈現(xiàn)下降趨勢（前者較初始階段減少約588%，后者減少約113%），而在第Ⅲ階段有一定程度回升（前者較第Ⅱ階段增加2.50倍，后者增加4.20倍）。螺旋體門（Spirochaetes）能夠水解利用半纖維素，M組末期（第Ⅳ階段）該菌門相對豐度較前期（第Ⅰ階段）增加約18.78倍?；ヰB(yǎng)菌門（Syn?ergistetes）在厭氧發(fā)酵中也起到促進(jìn)有機(jī)物的水解和酸化作用。有研究表明，在產(chǎn)酸階段Synergistetes門的許多菌屬可以與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)，將含4~8個(gè)C的直鏈脂肪酸降解為丙酸酯、乙酸鹽和甲烷，同時(shí)可以通過與產(chǎn)甲烷菌的協(xié)同作用，將蛋白質(zhì)降解成所需底物。而本研究中M組前期（Ⅰ~Ⅱ階段）Syner?gistetes的相對豐度與M0時(shí)基本一致，僅占0.13%左右，而PⅡ階段該菌相對豐度比P0時(shí)增加約1.56倍。在AKYOL等的研究中，對照厭氧消化池中前20 d VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)比經(jīng)真菌預(yù)處理組高，此時(shí)對照組中Synergistetes相對豐度僅占0.1%，而在預(yù)處理組中占6.4%~7.5%。因此推測高VFA環(huán)境不利于Syner?gistetes生長代謝，阻礙了與產(chǎn)甲烷菌的協(xié)同作用，造成產(chǎn)氣困難。

圖6 細(xì)菌在門水平和屬水平上群落結(jié)構(gòu)多樣性分析Figure 6 Analysis of bacterial diversities at the phylumand genuslevel

在2個(gè)發(fā)酵體系中，狹義梭菌屬是絕對優(yōu)勢菌屬，占32.74%~51.98%。該屬不僅能夠水解多糖促進(jìn)產(chǎn)酸，還可以分泌降解復(fù)雜碳水化合物所需的酶。在2個(gè)體系中隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，的相對豐度均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。這是因?yàn)殡S著時(shí)間延長，該屬生長代謝所利用的多糖被大量消耗，導(dǎo)致PⅢ階段菌群減少，水解速率降低，而乙酸又被產(chǎn)甲烷古菌大量利用，結(jié)合圖3，可以解釋48 d乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。由于M組底物中添加了玉米秸稈，增加了纖維素含量，所以M組各時(shí)期該菌的相對豐度均高于P組?？梢岳冒l(fā)酵體系中的葡萄糖產(chǎn)生氫，主要的代謝產(chǎn)物包括乙酸鹽、甲酸鹽和乳酸鹽。在M組中，隨著纖維素等多糖類被水解為葡萄糖，使得該菌在第Ⅳ階段相對豐度最高，達(dá)12.68%。隨著P組發(fā)酵后期丙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高，相對豐度明顯降低；同樣，M組中也能觀察到類似的現(xiàn)象，推測高質(zhì)量分?jǐn)?shù)丙酸對的生長代謝起抑制作用。因其參與初期的蛋白質(zhì)水解代謝，在2個(gè)體系中發(fā)酵初期豐富度最高，占11.34%~13.69%，而PⅠ階段下該菌相對豐度為6.68%，是MⅠ階段下的1.87倍，可見高VFA環(huán)境會(huì)加速其失活。值得注意的是，unclassified菌屬相對豐度最高可達(dá)12.11%（PⅢ樣本中），因此仍需通過系統(tǒng)進(jìn)化進(jìn)一步分析其在發(fā)酵過程中的作用。

2.4 微生物系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖7為前50個(gè)OTU代表性序列與數(shù)據(jù)庫序列系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹環(huán)狀圖。根據(jù)分支情況和樹枝長短情況來看，圖a中，OTU為4、12、13的unclassified菌屬與亞硝化球菌屬（）親緣關(guān)系較近，對發(fā)酵體系的產(chǎn)甲烷性能沒有明顯的貢獻(xiàn)。圖b中，OTU45的unclassified菌屬與可利用糖類產(chǎn)酸的、可分泌脲酶降解尿素的以及可參與初期蛋白質(zhì)水解代謝的等菌同屬一個(gè)分支，可見細(xì)菌屬中檢測出的這些未被分類的菌可能具有分解底物中有機(jī)物、加速水解酸化的作用。值得注意的是，被證實(shí)在厭氧消化中積極參與產(chǎn)酸過程，并轉(zhuǎn)移電子給產(chǎn)甲烷古菌，可以增加甲烷產(chǎn)量；OTU38的unclassified菌屬與同屬一個(gè)分支，表明它可能具有增加甲烷產(chǎn)量的作用。

圖7 古菌與細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹環(huán)狀圖Figure 7 Ring diagramof phylogenetic tree of archaea and bacteria

2.5 冗余分析

采用冗余分析對P組和M組的微觀群落結(jié)構(gòu)和宏觀環(huán)境因子進(jìn)行相關(guān)性研究，選取pH、SCOD、總酸、丙酸和乙酸5個(gè)理化指標(biāo)（總酸、丙酸和乙酸均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其中總酸指TVFA）。剔除不顯著因素后，RDA模型結(jié)果見圖8。對于P組，軸1和軸2分別解釋了66.45%和25.97%的變異性，總體上微生物群落演變解釋度為丙酸>SCOD>pH>總酸，因此影響P組微觀生態(tài)的主要環(huán)境因子為丙酸。從樣方分布來看，穩(wěn)定產(chǎn)氣階段分布在二、三象限，且發(fā)酵第45 d與第78 d群落結(jié)構(gòu)相似度較高。環(huán)境因子間的相關(guān)性表明，丙酸與pH的相關(guān)度較高，這與P組后期丙酸積累過多有關(guān)。物種與環(huán)境因子的相關(guān)性表明，和與TVFA和乙酸均呈極顯著正相關(guān)，說明它們的存在促進(jìn)體系中乙酸的增加，是分解纖維素產(chǎn)酸的主要貢獻(xiàn)者。與丙酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，說明P組環(huán)境中逐漸積累的丙酸會(huì)抑制該菌的生長，進(jìn)而影響體系的產(chǎn)氣性能。丙酸的積累同樣對和產(chǎn)生負(fù)面作用。對于M組，軸1和軸2分別解釋了77.81%和18.86%的變異性。環(huán)境因子對M組微生物群落演變的解釋度為pH>SCOD>總酸>乙酸，并且隨著發(fā)酵的進(jìn)行，樣品從橫軸的正端向負(fù)端移動(dòng)，pH為該體系微生物結(jié)構(gòu)變化的主要驅(qū)動(dòng)因子，其解釋度為45.3%。在軸2方向上，總酸、SCOD和乙酸對微生物群落結(jié)構(gòu)的影響均較大，證明M組酸抑制作用明顯，且體系中酸抑制主體為乙酸。對比P組，M組中和與乙酸呈負(fù)相關(guān)，說明酸抑制環(huán)境下乙酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高會(huì)對氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑產(chǎn)生抑制作用。在軸1方向上，pH更多地解釋了厭氧發(fā)酵過程中主要微生物菌群的變化。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，M組中古菌主要優(yōu)勢菌屬發(fā)生了演替，由轉(zhuǎn)變?yōu)楹?。體系中的產(chǎn)甲烷途徑從以乙酸營養(yǎng)型為主轉(zhuǎn)變?yōu)闅錉I養(yǎng)型與乙酸營養(yǎng)型相結(jié)合的方式。結(jié)合圖8a與圖8b可知，厭氧干發(fā)酵過程中酸抑制的主體總是與體系中初始階段的優(yōu)勢菌群呈負(fù)相關(guān)，因此酸抑制的發(fā)生對菌群結(jié)構(gòu)的演替有很大影響。

圖8 單獨(dú)發(fā)酵與混合發(fā)酵系統(tǒng)的冗余分析Figure 8 Redundancy analysis of mono-fermentation and co-fermentation systems

3 結(jié)論

（1）混合發(fā)酵體系中酸抑制效應(yīng)嚴(yán)重，M組（豬糞秸稈混合發(fā)酵）前期產(chǎn)氣性能明顯較差，甲烷含量在56 d后呈明顯上升趨勢，表明體系中產(chǎn)甲烷菌可能在高VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)下逐漸恢復(fù)活力。

（2）可以促進(jìn)厭氧干發(fā)酵體系產(chǎn)生甲烷，其相對豐度與日甲烷產(chǎn)量呈正相關(guān)；而相對豐度與VFA質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)。M組發(fā)酵體系中以氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷途徑為主。

（3）古菌中OTU為4、12、13的unclassified菌屬，對發(fā)酵體系的產(chǎn)甲烷性能沒有明顯的貢獻(xiàn)。而細(xì)菌中未被分類的OTU45和OTU38菌屬應(yīng)引起重視。

（4）影響2組發(fā)酵體系的主要酸抑制種類不同，逐漸積累的丙酸會(huì)影響P組（豬糞單獨(dú)發(fā)酵）的產(chǎn)氣性能，M組中酸抑制的主體為乙酸。酸抑制的發(fā)生對菌群結(jié)構(gòu)的演替有很大影響，可見如何避免酸抑制是提高厭氧干發(fā)酵產(chǎn)氣性能的關(guān)鍵。