武曉玉，段文達(dá)，夏鵬飛，王玉霞，邊惠琴，趙 磊*

? 藥理與臨床 ?

L02肝脂肪變性細(xì)胞膜快速篩選大黃調(diào)血脂活性成分

武曉玉1, 2, 3，段文達(dá)1，夏鵬飛1, 2, 3，王玉霞1，邊惠琴1，趙 磊1, 2, 3*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省道地藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究與推廣工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000

構(gòu)建L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜耦合脂肪變性模型，并將其應(yīng)用于大黃調(diào)血脂活性成分的快速篩選。利用L02肝脂肪變性細(xì)胞膜作為固定相選擇性地吸附大黃30%乙醇提取液中的活性成分，采用高效液相色譜（HPLC）測(cè)定吸附前后的化學(xué)成分；根據(jù)對(duì)照品的保留時(shí)間及紫外光譜信息，對(duì)比鑒定各親和活性成分；并將篩選出的活性成分進(jìn)一步作用于L02肝脂肪變性細(xì)胞模型，驗(yàn)證其調(diào)血脂作用。從大黃30%乙醇提取液中共篩選出11種活性成分，分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚和6種未知成分。蘆薈大黃素等蒽醌苷元能夠顯著降低L02肝脂肪變性細(xì)胞中三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量（＜0.01），且可減少L02肝脂肪變性細(xì)胞中的脂肪粒。建立的L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜耦合脂肪變性模型可用于快速篩選中藥復(fù)雜體系中的活性成分，為進(jìn)一步深入探究大黃調(diào)血脂活性成分群奠定了基礎(chǔ)。

大黃；L02肝脂肪變性細(xì)胞；細(xì)胞膜固相色譜；活性成分；蘆薈大黃素；大黃酸；大黃素；大黃酚；大黃素甲醚

大黃為甘肅道地藥材，其藥用歷史悠久、資源豐富，為臨床常用中藥之一?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載其“蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”[1]；臨床主要用于大便干結(jié)、濕熱泄瀉、濕熱黃疸、熱邪血熱、火眼充血、咽喉腫脹、牙齦炎痛、皮感疼痛、表皮燙傷、瘀血諸證[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，大黃具有瀉下、抗菌、抗腫瘤、抗炎、抗病毒、調(diào)血脂等作用[3]。目前大黃調(diào)血脂的研究主要旨在證明其調(diào)血脂能力[4-6]，其具體調(diào)血脂活性成分尚不明確。本課題組前期利用高血脂大鼠模型對(duì)大黃水提液、30%乙醇提取液、醋酸乙酯提取液進(jìn)行篩選，通過(guò)測(cè)定血清中三酰甘油（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）含量，對(duì)大黃不同部位調(diào)血脂效果進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)大黃30%乙醇提取液是其調(diào)血脂有效部位[7]。

細(xì)胞膜固相色譜法的原理為直接用生物靶點(diǎn)富集的細(xì)胞膜，選擇性地結(jié)合中藥提取液中的活性成分，洗去未結(jié)合成分后，再用解離液將細(xì)胞膜上的成分解離下來(lái)，利用色譜技術(shù)分離鑒定效應(yīng)物質(zhì)。細(xì)胞膜固相色譜具有快速、方便等優(yōu)點(diǎn)，適用于中藥復(fù)雜成分的高通量篩選[8-13]。為深入探究大黃調(diào)血脂活性成分群，本研究利用L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜快速篩選大黃調(diào)血脂活性成分，并將其活性成分進(jìn)一步作用于L02肝脂肪變性細(xì)胞模型，以驗(yàn)證其調(diào)血脂效果，為探明大黃調(diào)血脂的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人L02肝細(xì)胞購(gòu)自普諾賽生命科技有限公司。

1.2 藥材

大黃購(gòu)自甘肅隴脈藥材有限公司，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院林麗高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為掌葉大黃L.的干燥根。

1.3 藥品與試劑

PBS溶液（批號(hào)AQ29629583）、青鏈霉素混合液（批號(hào)20201116）、胰酶（批號(hào)20210629）、RPMI 1640培養(yǎng)液（批號(hào)AG29643109）、胎牛血清（批號(hào)21040702）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)1121E0326）、Tris-HCl溶液（1 mol/L，批號(hào)20200821）、飽和油紅O（批號(hào)20210616）、蘇木素（批號(hào)21057999）、高效RIPA細(xì)胞裂解液（批號(hào)20200703）、油酸（批號(hào)SLBR187V）、Na＋, K＋-ATP酶活力測(cè)定試劑盒（批號(hào)20200629）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)20201022）、CCK-8試劑盒（批號(hào)PF724）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TG測(cè)定試劑盒（批號(hào)20201118）、TC測(cè)定試劑盒（批號(hào)20201213）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；對(duì)照品蘆薈大黃素（批號(hào)18121801）、大黃酸（批號(hào)20010901）、大黃素（批號(hào)20022605）、大黃酚（批號(hào)20011601）、大黃素甲醚（批號(hào)20110101）購(gòu)自成都克洛瑪生物科技有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；甲醇、乙腈（色譜純）購(gòu)自德國(guó)Merck公司；超純水由Milli-Q系統(tǒng)制備；其他試劑均為分析純。

1.4 儀器

Waters Allince高效液相色譜儀（HPLC，美國(guó)Waters公司）；BSA224S型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；MCO-18AIC型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本三洋株式會(huì)社）；高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）；JY92-ⅡDN型細(xì)胞破碎儀、XB-20型雪花制冰機(jī)（寧波新芝科技股份有限公司）；IMARK型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；AUTO X4全自動(dòng)細(xì)胞熒光計(jì)數(shù)分析儀（美國(guó)Cellometer公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

L02細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)所用細(xì)胞代數(shù)為15～35代，均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

2.2 L02肝脂肪變性細(xì)胞模型的建立[14]

采用不同濃度油酸刺激L02細(xì)胞，建立L02肝脂肪變性細(xì)胞模型；以細(xì)胞存活率及細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量評(píng)價(jià)造模是否成功。

2.2.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L02細(xì)胞，以1×105/cm2接種于96孔板中，每孔100 μL，貼壁生長(zhǎng)24 h。將細(xì)胞板分為加入培養(yǎng)基的正常組和加入油酸（0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L）的模型組及無(wú)細(xì)胞的空白組，培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續(xù)孵育1.5 h后終止培養(yǎng)，室溫置于搖床10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處各孔的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(模型－空白)/(正常－空白)

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量的測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期L02細(xì)胞，以2×105/cm2接種于6孔板，每孔1 mL，待貼壁后分為加入培養(yǎng)基的正常組和加入油酸（0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L）的模型組，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，PBS溶液洗滌2次，加入350 μL細(xì)胞裂解液，低溫下收集各組細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG及TC含量。

2.3 L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜的制備[15-16]

取造模后的L02細(xì)胞，用1 mL PBS溶液洗滌2次，棄去PBS溶液，加入1 mL 0.25%胰酶消化4 min，輕輕吹打，鏡下觀察細(xì)胞全部脫落，加入1 mL PBS溶液終止消化，4 ℃、160×離心10 min，棄去胰酶，保留細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀加入5 mL PBS溶液，輕輕吹打均勻，4 ℃、160×離心10 min，洗滌2次。細(xì)胞在50 mmol/L Tris-HCL溶液中4 ℃條件下溶脹30 min，在破碎功率720 W、破碎時(shí)間2 s、冷卻間隔2 s的冰浴條件下，破碎3 min。取細(xì)胞碎片混懸液，4 ℃、1000×離心10 min，保留上清液，棄去沉淀。取上清液，4 ℃、12 000×離心20 min，棄去上清液，保留細(xì)胞膜沉淀。平行制備3份，編號(hào)為B1～B3，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定細(xì)胞膜蛋白含量及Na＋, K＋-ATP酶活力。

2.4 HPLC測(cè)定方法的建立[17]

2.4.1 色譜條件 C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.05%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～20% B；10～15 min，20% B；15～30 min，20%～30% B；30～50 min，30%～50% B；50～60 min，50%～85% B；60～65 min，85%～100% B；柱溫為30 ℃；體積流量為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

2.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，分別置于10 mL量瓶中，用適量DMSO溶解，甲醇定容至刻度，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。依次稀釋成質(zhì)量濃度為1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、160.00 μg/mL的對(duì)照品溶液，0.22 μm濾膜濾過(guò)，備用。

2.4.3 供試品溶液的制備 稱取大黃粉末（過(guò)4號(hào)篩）50 g，加入30%乙醇1 L，加熱回流提取2次，減壓濃縮至稠膏，40 ℃真空干燥。使用時(shí)，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液。

2.4.4 線性關(guān)系的考察 取“2.4.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以各成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

Table 1 Results of linear relationship investigation

成分回歸方程線性范圍/(μg·mL?1)R2 蘆薈大黃素y＝20.540 x－10.0931.28～164.000.999 8 大黃酸y＝16.252 x＋15.0141.25～160.000.999 7 大黃素y＝14.679 x－17.7351.28～164.000.999 8 大黃酚y＝18.250 x－3.7031.28～162.001.000 0 大黃素甲醚y＝7.468 x＋24.8131.41～180.000.999 7

2.4.5 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗(yàn)：取供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)測(cè)定6次，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

（2）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚量分?jǐn)?shù)的RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 方法學(xué)考察結(jié)果

Table 2 Results of methodological investigation

成分RSD/% 精密度穩(wěn)定性重復(fù)性 蘆薈大黃素0.961.960.95 大黃酸0.292.910.30 大黃素1.361.361.28 大黃酚2.822.292.72 大黃素甲醚2.632.362.14

（3）重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取大黃粉末6份，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚量分?jǐn)?shù)RSD值，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知，方法學(xué)考察RSD值均小于3%，表明儀器的精密性良好，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，方法的重復(fù)性良好。

（4）加樣回收試驗(yàn)：取已測(cè)定大黃粉末9份，精密稱定，根據(jù)各指標(biāo)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%、100%、120%分別加入相應(yīng)對(duì)照品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備，“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果顯示，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均回收率分別為96.89%、97.29%、95.66%、95.94%、96.07%，RSD值分別為2.83%、1.39%、1.12%、2.17%、2.09%，表明本方法的加樣回收率符合規(guī)定。

2.5 L02肝細(xì)胞膜固相色譜對(duì)大黃活性成分吸附、解吸附

2.5.1 共孵育殘液的制備 L02肝脂肪變性細(xì)胞膜沉淀中加入1 mL大黃30%乙醇提取液，輕輕吹打，渦旋震蕩3 min，置于37 ℃恒溫水浴搖床孵育6 h。孵育結(jié)束后，孵育液于4 ℃、12 000×離心20 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，即得共孵育殘液。

2.5.2 洗滌液的制備 L02肝脂肪變性細(xì)胞膜沉淀中加入1 mL蒸餾水，輕輕吹打混合均勻，4 ℃、12 000×離心20 min，重復(fù)洗滌3次，合并上清液，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，即得洗滌液。

2.5.3 解離液的制備 L02肝脂肪變性細(xì)胞膜沉淀中加入1 mL 30%乙醇，輕輕吹打，渦旋震蕩3 min，置于37 ℃恒溫水浴搖床孵育4 h。孵育結(jié)束后，孵育液于4 ℃、12 000×離心20 min，上清液過(guò)0.22 μm濾膜，即得解離液。

按照相同條件重復(fù)上述操作，制得6份共孵育殘液、解離液。采用“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液、洗滌液及解離液。

2.6 大黃調(diào)血脂活性成分的體外驗(yàn)證

2.6.1 細(xì)胞存活率的測(cè)定 將5、10、20 μmol/L的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及阿托伐他?。?.125、0.250、0.500 μmol/L）分別作用于L02肝細(xì)胞脂肪變性模型，按“2.2.1”項(xiàng)下方法檢測(cè)細(xì)胞存活率。

2.6.2 細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量的測(cè)定 將10 μmol/L的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及阿托伐他?。?.50 μmol/L）分別作用于L02肝細(xì)胞脂肪變性模型，按“2.2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量。

2.6.3 油紅O染色 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L02細(xì)胞，以2×105/cm2接種于6孔板（已鋪玻璃爬片），每孔1 mL，待貼壁后分為正常組、模型組和蘆薈大黃素組，正常組加入培養(yǎng)基，模型組和蘆薈大黃素組加入0.50 mmol/L油酸，蘆薈大黃素組再加入10 μmol/L蘆薈大黃素，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛，固定15 min，加入1 mL油紅O工作液，室溫避光、密封染色30 min，吸出染液，用10%異丙醇沖洗，每次3～5 s，吸出洗液，加蘇木素染液復(fù)染1 min（用于染細(xì)胞核），純水洗去藍(lán)色染液，甘油明膠封片。于光鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)橘紅色脂滴情況。

3 結(jié)果

3.1 L02肝脂肪變性細(xì)胞模型的建立

油酸刺激L02肝細(xì)胞建立脂肪變性模型，本方法較為簡(jiǎn)便、快速，常用于脂代謝研究；其原理為饑餓狀態(tài)的肝細(xì)胞對(duì)油酸攝入增加，使細(xì)胞代謝發(fā)生障礙，肝細(xì)胞中的脂肪粒沉積加重及TG、TC含量增加。如圖1-A所示，與正常組相比，當(dāng)油酸濃度由0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L逐漸增加，細(xì)胞存活率逐漸下降，表明高濃度油酸對(duì)細(xì)胞有一定毒性；當(dāng)油酸濃度為0.25、0.50 mmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率大于85%。如圖1-B所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量上升，表明肝脂肪變性細(xì)胞模型造模成功；當(dāng)油酸濃度由0.25、0.50、1.00、1.50 mmol/L逐漸增加，細(xì)胞中TG、TC含量先增加后減少；TG、TC含量減少原因在于：油酸濃度為1.00、1.50 mmol/L時(shí)，造成一定數(shù)量細(xì)胞死亡，所以其TG、TC含量下降。結(jié)合細(xì)胞存活率和TG、TC含量，選擇0.5 mmol/L油酸為最佳造模濃度。

圖1 細(xì)胞存活率(A) 及TG、TC含量(B)(, n = 6)

3.2 L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜評(píng)價(jià)

對(duì)L02肝脂肪變性細(xì)胞膜進(jìn)行膜蛋白含量和Na＋, K＋-ATP酶活性測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。L02肝脂肪變性細(xì)胞膜蛋白質(zhì)量濃度為0.602 2 mg/mL，Na＋, K＋- ATP酶活力為11.38 U/mg，表明L02肝脂肪變性細(xì)胞膜沉淀具有活力。

表3 細(xì)胞膜蛋白含量和Na＋, K＋-ATP酶活力

Table 3 Membrane protein content of cells and Na＋, K＋- ATPase activity

編號(hào)細(xì)胞膜蛋白/(mg·mL?1)Na＋, K＋-ATP酶/(U·mg?1) B10.598 811.76 B20.602 811.03 B30.607 511.35 平均值0.602 211.38

3.3 HPLC吸附分析

大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液、混合對(duì)照品溶液、洗滌液、解離液色譜圖見(jiàn)圖2。

由圖2-A可知，優(yōu)化色譜條件下，多數(shù)成分色譜峰分離度良好，能夠較全面地反映相關(guān)化學(xué)成分信息；對(duì)比大黃30%乙醇提取液和共孵育殘液色譜峰的峰面積，部分共孵育殘液色譜峰峰面積顯著減小，表明部分化學(xué)成分被L02肝脂肪變性細(xì)胞膜吸附。由圖2-B可知，通過(guò)混合對(duì)照品溶液保留時(shí)間（R）及紫外光譜圖對(duì)比，初步確定7～11號(hào)色譜峰分別為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，1～6號(hào)色譜峰為未知成分。洗滌液中所含化學(xué)成分較少，表明活性成分與細(xì)胞膜結(jié)合牢固，不易洗滌下來(lái)。解離液中未檢測(cè)到色譜峰，推測(cè)活性成分通過(guò)特定的靶點(diǎn)進(jìn)入細(xì)胞膜內(nèi)部發(fā)揮調(diào)血脂作用。

將6份大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液進(jìn)樣分析，對(duì)比其色譜峰峰面積變化，計(jì)算色譜峰峰面積RSD值，結(jié)果見(jiàn)表4、5。6份大黃30%乙醇提取液、共孵育殘液色譜峰峰面積RSD均小于1%，表明在優(yōu)化色譜條件下，該測(cè)定方法穩(wěn)定可靠。

以大黃30%乙醇提取液和共孵育殘液色譜峰峰面積差值大于15%為依據(jù)，篩選L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜特異性吸附成分，結(jié)果見(jiàn)表6。大黃30%乙醇提取液中共有11種成分色譜峰峰面積的變化率大于15%；但由于對(duì)照品有限，僅初步確認(rèn)7～11號(hào)色譜峰為蒽醌苷元；5種蒽醌苷元峰面積變化率大于32%，提示其與L02肝脂肪變性細(xì)胞膜上的靶點(diǎn)有較好的結(jié)合能力。

3.4 大黃調(diào)血脂活性體外驗(yàn)證

5種大黃蒽醌苷元作用于L02肝脂肪變性細(xì)胞模型，其細(xì)胞存活率結(jié)果見(jiàn)表7。5種蒽醌苷元濃度大于10 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率小于85%，提示蒽醌苷元（20 μmol/L）對(duì)細(xì)胞具有一定的毒性作用，故選擇10 μmol/L蒽醌苷元進(jìn)行后續(xù)調(diào)血脂作用的驗(yàn)證。

A-大黃30%乙醇提取液和共孵育殘液色譜圖 B-混合對(duì)照品溶液、洗滌液和解離液色譜圖 1～6-未知成分 7-蘆薈大黃素 8-大黃酸 9-大黃素 10-大黃酚 11-大黃素甲醚

表4 大黃30%乙醇提取液色譜峰峰面積變化(n = 6)

Table 4 Peak area change of 30% ethanol extract of Rhei Radix et Rhizoma(n = 6)

峰號(hào)tR/min峰面積 S1S2S3S4S5S6RSD/% 113.125 018 8445 067 7625 081 8235 089 8215 095 3905 054 8290.56 214.243 825 3553 864 7903 824 6733 833 5833 881 6163 840 6460.60 328.373 367 1053 393 1223 378 3893 392 5973 381 5763 337 6870.61 429.675 979 1256 031 8965 985 2896 017 7126 055 6886 080 5670.65 534.58765 629755 313767 195752 116754 214766 8990.93 637.631 673 7151 672 6811 695 7631 665 9971 662 2081 699 2160.93 741.611 216 3401 215 0021 215 9361 218 8441 203 9491 219 2260.46 846.091 210 1981 216 8731 227 3011 208 4881 220 3311 215 5720.57 953.79401 388407 512409 669405 375402 895405 2140.74 1058.55435 529441 594439 307446 090443 376440 8550.82 1160.4483 01082 30181 18482 36881 87681 3830.83

表5 共孵育殘液色譜峰峰面積變化(n = 6)

Table 5 Peak area change of co-incubation residual solution (n = 6)

峰號(hào)tR/min峰面積 S1S2S3S4S5S6RSD/% 113.124 061 5794 057 8754 046 6554 034 5594 030 3684 053 9830.31 214.243 073 8623 070 5703 062 3343 057 7763 049 2133 075 4000.33 328.372 506 7052 491 1932 492 2752 479 5342 471 9412 467 9560.58 429.674 219 6154 206 1134 202 2614 196 5194 180 7554 175 8490.39 534.58558 850557 234555 456552 487552 043550 5370.59 637.631 377 2571 373 9351 369 2211 363 6511 359 6571 356 7850.59 741.61548 516546 598544 134544 273540 734540 6560.57 846.09838 137833 508830 540829 140823 955825 3800.63 953.7978 01978 39477 93278 93578 30078 0410.47 1058.55114 621114 865114 499116 250115 118114 6800.56 1160.4410 71910 85610 83710 78410 79510 6000.87

表6 L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜吸附差異結(jié)果

Table 6 Results of adsorption difference of L02 hepatic steatosis membrane solid phase chromatography

峰號(hào)tR/min30%乙醇提取液色譜峰峰面積共孵育殘液色譜峰峰面積峰面積變化/%成分 113.125 081 8234 057 87520.15未知 214.243 824 6733 070 57019.72未知 328.373 378 3892 491 19326.26未知 429.675 985 2894 206 11329.73未知 534.58767 195557 23427.37未知 637.631 695 7631 373 93518.98未知 741.611 215 936546 59855.05蘆薈大黃素 846.091 227 301833 50832.09大黃酸 953.79409 66978 39480.86大黃素 1058.55439 307114 86573.85大黃酚 1160.4481 18410 85686.63大黃素甲醚

表7 大黃蒽醌苷元對(duì)L02肝脂肪變性細(xì)胞存活率的影響(n = 6)

Table 7 Effect of anthraquinone aglycone on survival rate of L02 hepatic steatosis cells (n = 6)

組別濃度/(μmol·L?1)細(xì)胞存活率/%組別濃度/(μmol·L?1)細(xì)胞存活率/% 蘆薈大黃素590.2大黃酚591.5 1088.7 1089.3 2081.5 2081.0 大黃酸593.1大黃素甲醚591.8 1088.6 1088.6 2079.3 2080.4 大黃素595.4阿托伐他汀0.12592.5 1087.8 0.25090.7 2075.6 0.50090.1

將5種蒽醌苷元（10 μmol/L）和阿托伐他?。?.5 μmol/L）作用于L02肝脂肪變性細(xì)胞模型，TG、TC含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3。與正常組比較，模型組細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量顯著升高（＜0.01），表明油酸誘導(dǎo)造模成功；與模型組比較，各給藥組細(xì)胞內(nèi)TG、TC含量均顯著降低（＜0.01），表明5種蒽醌苷元可以通過(guò)降低TG、TC含量而達(dá)到調(diào)血脂作用，其中大黃素甲醚下調(diào)TG效果最強(qiáng)，而蘆薈大黃素下調(diào)TC效果最強(qiáng)。

油紅O/蘇木素染色L02肝脂肪變性細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)脂肪滴情況見(jiàn)圖4。油紅O染色后，正常組細(xì)胞中藍(lán)色為細(xì)胞核，細(xì)胞核周?chē)鸁o(wú)紅色脂肪粒。模型組細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變大，部分細(xì)胞膜不完整和破損；細(xì)胞核周?chē)写罅考t色脂肪粒。蘆薈大黃素作用于L02細(xì)胞肝脂肪變性模型，細(xì)胞核周?chē)闹玖Ｃ黠@減少，細(xì)胞形態(tài)有所改善，表明蒽醌苷元通過(guò)清除肝細(xì)胞脂質(zhì)堆積，改善肝臟內(nèi)脂質(zhì)代謝，并保護(hù)肝細(xì)胞功能達(dá)到調(diào)血脂作用。

A-正常組 B-模型組 C-蘆薈大黃素組 D-大黃酸組 E-大黃素組 F-大黃酚組 G-大黃素甲醚組 H-阿托伐他汀組 與正常組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01

圖4 油紅O染色圖片 (×400)

4 討論

本研究構(gòu)建L02肝脂肪變性細(xì)胞膜固相色譜耦合脂肪變性模型，利用L02肝脂肪變性細(xì)胞膜表面靶點(diǎn)選擇性吸附大黃調(diào)血脂活性成分，以吸附前后化學(xué)成分色譜峰峰面積變化率大于15%為依據(jù)，從大黃30%乙醇提取液中共篩選出11種活性成分；將5種大黃蒽醌苷元作用于L02肝脂肪變性細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)蘆薈大黃素等蒽醌苷元能夠顯著降低L02肝脂肪變性細(xì)胞中TG、TC含量，并可顯著減少細(xì)胞核周?chē)闹玖?。本模型具有快速、方便的?yōu)勢(shì)，可用于大黃調(diào)血脂活性成分的快速篩選，也可適用于其他中藥調(diào)血脂活性成分的快速篩選及活性成分群關(guān)系的研究。

本方法將活性細(xì)胞膜作為固定相，具有細(xì)胞膜完整、膜受體立體結(jié)構(gòu)、周?chē)h(huán)境和靶點(diǎn)得以保持的優(yōu)勢(shì)，能夠排除大量非作用雜質(zhì)成分的干擾，是中藥效應(yīng)成分的有效篩選手段；但同時(shí)也存在細(xì)胞膜吸附1～2次后，細(xì)胞膜活性顯著降低，使用壽命短及吸附成分不一定是入血成分等缺陷。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Rapid screening of active components frometfor hypolipidemia by L02 hepatic steatosis cell membrane

WU Xiao-yu1, 2, 3,DUAN Wen-da1, XIA Peng-fei1, 2, 3, WANG Yu-xia1, BIAN Hui-qin1,ZHAO Lei1, 2, 3

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicine of Colleges of Gansu Province, Lanzhou 730000, China 3. Gansu Province Engineering Laboratory for Traditional Chinese Medicine Standardization Technology and Popularization, Lanzhou 730000, China

To rapid screening the active components from Dahuang (et) for hypolipidemia through L02 liver steatosis cell membrane solid phase chromatography coupled with steatosis model.The active compounds of 30% ethanol extracts frometwere combined with L02 cell membrane solid phase chromatography. The solution was detected before and after treating with L02 cell membrane by HPLC. The active compounds from 30% ethanol extracts ofetwere identified based on retention time and ultraviolet spectrum information of each chemical composition. The selected active ingredients were further applied to L02 hepatic steatosis cell model to verify the effect of hypolipidemia.A total of 11 compounds were detected from 30% ethanol extract ofet, and identified as aloe emodin, rhein, rheum emodin, chrysophanol, physcion and six unknown ingredients. Aloe emodin and other anthraquinone aglycones significantly reduced the contents of triglyceride (TG) and total cholesterol (TC) in L02 hepatic steatosis cell (< 0.01), and reduced the lipid granules in L02 hepatic steatosis cell.The established L02 liver steatosis cell membrane solid phase chromatography coupled with steatosis model can be used for rapid screening of active components in the complex system of traditional Chinese medicine, as well as to lay the foundation for further study of the active components in hypolipidemia ofet.

et; L02 hepatic steatosis cells; cell membrane solid phase chromatography; active components; aloe emodin; rhein; rheum emodin; chrysophanol; physcion

R285.5

A

0253 - 2670(2022)03 - 0735 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.012

2021-09-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82160457）；甘肅省教育廳：青年博士基金項(xiàng)目（2021QB-079）；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)引進(jìn)人才科研啟動(dòng)基金（2018YJRC-02）；甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研發(fā)展基金項(xiàng)目（81660577）

武曉玉（1983—），女，副教授，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究。E-mail: wxypzw@163.com

趙 磊，女，教授，博士生導(dǎo)師，從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制研究。Tel: (0931)8762539 E-mail: zzyhx@gszy.edu.cn

[責(zé)任編輯 李亞楠]