隋 怡，滕明剛，柴慧芳，於 祥，龍 毅，羅國勇，楊武德

有柄石韋中壩巴酸的通淋作用研究

隋 怡，滕明剛，柴慧芳，於 祥，龍 毅，羅國勇，楊武德*

貴州中醫(yī)藥大學，貴州 貴陽 550025

研究黔產有柄石韋中壩巴酸的通淋作用。犬腎小管上皮細胞（MDCK）給予100 μmol/L壩巴酸孵育24 h，MTT法檢測壩巴酸對MDCK細胞活力以及脂多糖誘導的MDCK炎癥模型細胞活力的影響。雄性昆明種小鼠隨機分為正常組、模型組及壩巴酸低、高劑量（10、20 mg/kg）組和腎石通（4.5 g/kg）組，除正常組外，其余各組每日ig 1%乙二醇和1% NH4Cl連續(xù)造模30 d，造模同時ig藥物，末次給藥后取小鼠尿液和腎臟，采用蘇木素-伊紅（HE）染色法檢測腎組織病理變化；采用鈣離子檢測試劑盒檢測尿鈣、腎鈣含量。利用Auto Dock軟件對壩巴酸和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARG）、WNK賴氨酸缺乏蛋白激酶1（WNK lysine deficient protein kinase 1，WNK1）、鈣感應受體（calcium sensing receptor，CASR）、細胞色素P450家族24亞家族A成員1（cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1，CYP24A1）蛋白進行分子對接并分析對接結果。體外實驗結果顯示，與正常組相比，100 μmol/L壩巴酸對MDCK細胞活力無明顯影響；在30 mg/mL脂多糖誘導的炎癥細胞模型中，壩巴酸可以顯著提高MDCK細胞活力（＜0.05）。體內實驗結果顯示，各給藥組小鼠腎組織炎性細胞浸潤得到改善，腎組織損傷評分顯著降低（＜0.05）；壩巴酸低劑量組和腎石通組小鼠腎鈣含量較模型組顯著降低（＜0.05），尿鈣含量顯著升高（＜0.05）。分子對接結果顯示，PPARG、WNK1、CASR、CYP24A1蛋白與壩巴酸的分子對接能均小于?21 kJ/mol，對接效果均較好。黔產有柄石韋中壩巴酸具有較好的抗炎、抑制腎鈣蓄積的作用，其通淋活性機制與PPARG、WNK1、CASR、CYP24A1蛋白的結合活性有關。

通淋；黔產有柄石韋；壩巴酸；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；WNK賴氨酸缺乏蛋白激酶1；鈣感應受體；細胞色素P450家族24亞家族A成員1

石韋為水龍骨科植物廬山石韋(Bak.) Ching、石韋(Thunb.) Farwell或有柄石韋(Christ) Ching的干燥葉，具有利尿通淋、清肺止咳、涼血止血的功效[1]，主要成分為綠原酸、里白烯、β-谷甾醇等[2]。本課題組前期從黔產有柄石韋提取的21種化合物中篩選出了一批利尿活性較好的化合物，其中壩巴酸的利尿活性較優(yōu)，且在細胞和動物實驗上得到了驗證[3]。

中醫(yī)中的淋證包含熱淋和石淋等，是中醫(yī)常見病癥?！吨T病源侯論》謂：“熱淋者三焦有熱，氣搏于腎，流入于胞而成淋也，其狀小便赤澀。”現(xiàn)代醫(yī)學認為熱淋為尿路系統(tǒng)感染，包括急慢性腎盂腎炎、膀胱炎、尿道炎等。而石淋則為現(xiàn)代醫(yī)學中的腎結石范疇，在治療上以控制感染、碎石排石為主[4]。本研究圍繞中醫(yī)對于淋證的理解，從抗炎和腎鈣排泄2個方面，探究黔產有柄石韋的活性成分壩巴酸的通淋活性及機制，為黔產有柄石韋的開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞

犬腎小管上皮細胞（MDCK）購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 動物

清潔級雄性昆明種小鼠，7～8周齡，體質量18～22 g，購自重慶騰鑫有限公司，動物許可證號SCXK（遼）2015-0001。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境通風良好，溫度22～25 ℃，相對濕度50%～60%，自由進食飲水。動物實驗遵循貴州中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.3 藥品與試劑

黔產有柄石韋由龍里縣灣灘河鎮(zhèn)彎寨石頭村李紅提供，由貴州中醫(yī)藥大學生藥教研室周漢華教授鑒定水龍骨科植物有柄石韋(Christ) Ching的干燥葉；腎石通顆粒（批號20160625，國藥準字Z43020338）購自華潤三九制藥有限公司；壩巴酸（HPLC≥98%，批號2018132）購自四川省維克奇生物科技有限公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS，批號063M4039V）、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（批號190815）購自北京索萊寶科技有限公司；鈣離子檢測試劑盒（批號20191123）購自南京建成生物工程研究所有限公司；胎牛血清（批號20196452）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號20181562）購自美國Gibco公司；PBS（批號20191152）購自以色列BI公司。

1.4 儀器與軟件

雙人超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；TD4M型低速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）；自動酶標讀儀（美國Bio-Tek公司）；EG1150型石蠟包埋機、RM2235型切片機（德國Leica公司）；倒置相差顯微鏡、DS-Ri2型顯微鏡成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；AutoDockTools 1.5.6軟件。

2 方法

2.1 藥物的制備

本課題組前期從黔產有柄石韋中提取了21個化合物，經鑒定化合物5為壩巴酸[2]。將壩巴酸用雙蒸水低溫研磨配制成母液，將母液分別以DMEM高糖培養(yǎng)基和雙蒸水稀釋成100 μmol/L、0.5 mg/mL的溶液，各用于細胞實驗和動物實驗，于4 ℃冰箱保存，備用。

2.2 壩巴酸對MDCK細胞活力的影響

MDCK細胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于毒性和細胞保護實驗。將MDCK細胞以1×105/mL均勻接種于96孔板中，設置對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)）、給藥組（給予100 μmol/L壩巴酸），每組設5個復孔。各組孵育24 h，采用MTT法檢測各組490 nm處的吸光度（）值。

2.3 壩巴酸對LPS誘導的MDCK細胞活力的影響

取處于對數(shù)生長期的MDCK細胞，以1×105/mL均勻接種于96孔板，培養(yǎng)過夜。設置對照組、模型組和壩巴酸（100 μmol/L）組。給藥組加入壩巴酸預處理24 h后，模型組和各給藥分別加入LPS（30、50 mg/mL），對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，MTT法檢測各組490 nm處的值。

2.4 壩巴酸對腎結石小鼠腎組織病理及腎鈣、尿鈣含量的影響

35只昆明種小鼠隨機分為對照組、模型組及壩巴酸低、高劑量（10、20 mg/kg）組和腎石通（4.5 g/kg）組，每組7只。除對照組外，其余各組每日ig含1%乙二醇和1% NH4Cl的雙蒸水進行造模，以腎臟草酸鈣蓄積為造模成功標志。自造模第1天起，各給藥組ig相應藥物（20 μL/g），對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，每日上午給藥、下午造模，1次/d，連續(xù)30 d。給藥結束后，取各組小鼠尿液，小鼠脫頸椎處死，取腎臟，按照鈣離子檢測試劑盒說明書檢測小鼠腎組織及尿液中鈣離子濃度。采用HE染色法檢測小鼠腎組織病理損傷，每張切片在皮質區(qū)隨機觀察5個無重疊視野（×200），每個視野選取50個腎小管，按照Paller等[5]的標準進行評分：正常腎小管為0分；腎小管明顯擴張、細胞扁平為1分；間質水腫為1分；刷狀緣消失為2分；細胞質空泡為2分；腎小管細胞壞死為2分；形成管型或碎片為2分；有炎癥細胞浸潤為2分。每個腎小管腎病理評分總計為10分，每個視野最大評分為500分。

2.5 壩巴酸通淋活性的分子對接驗證

利用Auto Dock軟件和Vina程序進行壩巴酸和過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARG）、WNK賴氨酸缺乏蛋白激酶1（WNK lysine deficient protein kinase 1，WNK1）、鈣感應受體（calcium sensing receptor，CASR）、細胞色素P450家族24亞家族A成員1（cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1，CYP24A1）蛋白的分子對接，獲得各蛋白分子對接結合能和對接圖像，并分析對接結果。

2.6 統(tǒng)計學分析

3 結果

3.1 壩巴酸對MDCK細胞活力的影響

對照組值為1.132±0.021，壩巴酸（100 μmol/L）組值為1.116±0.027，兩者無明顯差異，表明100 μmol/L壩巴酸對MDCK細胞沒有毒性作用，此濃度可用于進一步實驗。

3.2 壩巴酸對LPS誘導的MDCK細胞活力的影響

研究不同質量濃度LPS（30、50 mg/mL）誘導的MDCK炎癥模型下，100 μmol/L壩巴酸對MDCK細胞的保護作用，結果見表1。與對照組相比，模型組細胞活力均顯著降低（＜0.05）；在LPS（30 mg/mL）誘導的MDCK細胞炎癥模型中，壩巴酸顯著提高MDCK細胞值（＜0.05），表明壩巴酸對LPS（30 mg/mL）誘導的MDCK細胞損傷模型具有保護作用。

表1 壩巴酸對LPS誘導的MDCK細胞活力的影響(, n = 4)

Table 1 Effect of babacic acid on MDCK cell viability induced by LPS (, n = 4)

組別濃度/ (μmol·L?1)A值 30 mg·mL?1 LPS50 mg·mL?1 LPS 對照—0.444±0.0610.444±0.053 模型—0.224±0.065#0.255±0.021# 壩巴酸1000.301±0.041*0.271±0.055

與對照組比較：*＜0.05；與模型組比較：#＜0.05，下表同

*<0.05control group;#<0.05model group, same as below tables

3.3 壩巴酸對腎結石小鼠腎組織病理變化的影響

如圖1和表2所示，與對照組相比，模型組小鼠腎臟結構紊亂，管腔擴張變大，腎組織有空泡，腎小管邊緣損傷，腎間質有大量炎性細胞浸潤，腎組織損傷評分顯著升高（＜0.05）；與模型組相比，壩巴酸組和腎石通組小鼠腎組織炎癥細胞浸潤得到改善，腎組織邊緣較完整，腎組織損傷評分顯著降低（＜0.05），表明壩巴酸對腎組織具有保護作用。

3.4 壩巴酸對腎結石小鼠腎鈣含量的影響

如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠腎鈣含量顯著升高（＜0.05），表明造模成功；與模型組比較，壩巴酸低劑量組和腎石通組小鼠腎鈣含量顯著降低（＜0.05），表明壩巴酸（10 mg/kg）具有較好的降低腎鈣蓄積作用。

3.5 壩巴酸對腎結石小鼠尿鈣含量的影響

如表4所示，與模型組比較，壩巴酸低劑量組和腎石通組小鼠尿鈣含量顯著升高（＜0.05），表明壩巴酸（10 mg/kg）具有較好的促進尿鈣排出活性，壩巴酸促進尿鈣排出與腎鈣含量降低的結果相一致。

A-對照組 B-模型組 C-壩巴酸低劑量組 D-壩巴酸高劑量組 E-腎石通組

表2 各組小鼠腎組織損傷評分 (, n = 7)

Table 2 Kidney damage score of mice in each group (, n = 7)

組別劑量/(mg·kg?1)腎組織損傷評分 對照—4.60±1.46 模型—129.57±15.68# 壩巴酸1053.29±9.24* 2043.63±10.52* 腎石通450026.21±8.84*

表3 壩巴酸高低劑量對腎結石小鼠腎鈣含量的影響(, n = 7)

Table 3 Effect of babacic acid on renal calcium content in mice with kidney stones (, n = 7)

組別劑量/(mg·kg?1)腎鈣含量/(mmol·mg?1) 對照—0.006±0.002 模型—0.012±0.002# 壩巴酸100.004±0.001* 200.010±0.004 腎石通45000.005±0.002*

表4 壩巴酸對腎結石小鼠尿鈣含量的影響(, n = 7)

Table 4 Effect of babacic acid on urinary calcium content in mice with kidney stones(, n = 7)

組別劑量/(mg·kg?1)尿鈣含量/(mmol·L?1) 對照—1.56±0.25 模型—1.62±0.23 壩巴酸102.34±0.11* 201.72±0.22 腎石通45002.55±0.15*

3.6 壩巴酸通淋活性的分子對接驗證

將壩巴酸分別與PPARG、WNK1、CASR、CYP24A1蛋白進行分子對接，選取晶體結構的PDB ID分別為6TSG、5DRB、7DD7、3K9Y。化合物與大分子蛋白能否結合主要通過結合能來評價。利用Auto Dock軟件和Vina語言分別進行對接，得到壩巴酸與以上蛋白的結合能，分別為?31、?33、?32、?29 kJ/mol。結合能負值越大代表對接效果越好，4種蛋白的結合能均小于?21 kJ/mol，表明對接效果較好。其中，對接效果最優(yōu)的為壩巴酸與WNK1蛋白，這與本課題組前期研究觀測到的壩巴酸具有良好的利尿效果相一致。同時在通淋的靶點CASR、CYP24A1也有較好的對接效果。4種蛋白的分子對接情況見圖2。

4 討論

現(xiàn)代研究認為，凡尿頻、尿急、排尿障礙或澀痛、淋瀝不斷的證候統(tǒng)稱“淋證”，分為“石淋”“氣淋”“膏淋”“勞淋”“血淋”“熱淋”6種類型。其中以“熱淋”“石淋”最為常見，為中醫(yī)常見病癥。黔產有柄石韋，味甘、苦，性微寒，有利尿通淋、涼血止血的功效。在本課題組前期研究中[3]，從黔產有柄石韋提取了21種單體化合物，其中壩巴酸在細胞和動物水平上均具有良好的利尿活性。本研究在前期研究的基礎上，聯(lián)系中醫(yī)通淋理論，進一步研究黔產有柄石韋中壩巴酸的通淋活性及作用機制。

在壩巴酸對LPS誘導的MDCK細胞炎癥模型保護作用實驗中發(fā)現(xiàn)，100 μmol/L壩巴酸對MDCK細胞活力沒有顯著影響，但造模前預給藥孵育24 h具有顯著提高MDCK炎癥模型細胞活力的作用，表明壩巴酸對腎小管細胞炎癥模型具有保護作用，可以顯著提高炎癥細胞活力。動物實驗HE染色結果進一步表明，壩巴酸對1%乙二醇和1% NH4Cl誘導的腎結石模型小鼠腎組織具有顯著保護作用，腎組織炎性細胞浸潤得到較好的改善。研究表明，巨噬細胞在機體炎癥過程發(fā)揮重要的作用[6]。機體組織中的巨噬細胞以2種形式出現(xiàn)，分為促炎型的M1型巨噬細胞和抗炎型的M2型巨噬細胞[7]。PPARG為巨噬細胞由M1型轉化為M2型的關鍵因子，因此激活PPARG可發(fā)揮一定的抗炎作用[8]。本研究分子對接結果顯示，壩巴酸與PPARG的對接效果較優(yōu)，分子對接能為?31 kJ/mol，且分子對接圖顯示對接存在較強的氫鍵作用。壩巴酸對腎小管炎癥的保護作用機制可能與其與PPARG有較好的對接活性有關。即壩巴酸通過結合并激活PPARG，使得炎癥腎小管組織中巨噬細胞轉化為具有抗炎作用的M2型，從而發(fā)揮抗炎作用，減輕結石或炎癥導致的腎小管損傷。

棍棒模型為壩巴酸三維結構，螺旋體為蛋白三位結構，每組字符代表1個氨基酸

Stick model is three-dimensional structure of babaric acid, spirochetes are three-position structure of protein, and each group of characters represents one amino acid

圖2 壩巴酸與PPARG (A)、WNK1 (B)、CASR (C)、CYP24A1 (D) 蛋白的分子對接圖

Fig. 2 Docking results of babaric acid and PPARG (A), WNK1 (B), CASR (C) and CYP24A1 (D) proteins

在1%乙二醇和1% NH4Cl誘導的腎結石模型小鼠實驗中，壩巴酸低劑量組小鼠腎鈣含量較模型組顯著降低，尿鈣含量較模型組顯著升高，與腎石通組水平相當，表明壩巴酸具有較好的降低腎鈣蓄積、促進尿鈣排出的活性，且劑量存在最適范圍，壩巴酸促進尿鈣排出與腎鈣含量降低的結果相一致。WNK1通過控制鈉離子和氯離子的轉運發(fā)揮利尿作用，為利尿藥治療的新興靶蛋白[9]。CASR為表達于腎臟的鈣離子感受器[10]，當血鈣濃度升高時，其可以抑制甲狀旁腺激素的釋放，從而減少腎鈣的重吸收，加速腎鈣排出，使血鈣濃度降低恢復正常水平[11-13]。CYP24A1蛋白可以使得活性維生素D3（vitamin D，VD3）側鏈羥基化而降解失活[14]，而活性VD3可促進鈣的吸收[15]，因此CYP24A1蛋白的激活可以抑制鈣的吸收，使血鈣濃度降低。本研究分子對接結果顯示，壩巴酸與WNK1、CASR、CYP24A1蛋白對接效果較優(yōu)，且分子對接圖均顯示存在較強的氫鍵作用，表明壩巴酸的利尿活性與WNK1蛋白的激活有關。壩巴酸促進腎鈣排出可能與其和CASR蛋白結合，發(fā)揮調解血鈣濃度活性有關；降低腎鈣蓄積與CYP24A1蛋白結合，促進活性VD3降解、抑制鈣吸收活性有關。

本研究在前期基礎上，基于中醫(yī)通淋理論，從抗炎和腎鈣排泄2個方面，從細胞和動物水平，考察了黔產有柄石韋中壩巴酸的通淋活性，為進一步研究壩巴酸的通淋活性和機制奠定基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Leaching effect of babaric acid in

SUI Yi, TENG Ming-gang, CHAI Hui-fang, YU Xiang, LONG Yi, LUO Guo-yong, YANG Wu-de

Guizhou University of Traditional Medical, Guiyang 550025, China

To study the leaching effect of babaric acid inin Guizhou.Canine renal tubular epithelial cells MDCK were incubated with 100 μmol/L babaric acid for 24 h. MTT method was used to detect the effects of babaric acid on viability of MDCK cells and cell viability of MDCK inflammation model induced by lipopolysaccharide. Male Kunming mice were randomly divided into normal group, model group, low-, high-dose (10, 20 mg/kg) babaric acid groups and Shenshitong (4.5 g/kg) group. Mice except normal group were daily ig 1% ethylene glycol and 1% NH4Cl for 30 d to continue to model, at the same time mice were ig drugs, after the last administration, urine and kidney of mice were taken, hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to detect the pathological changes of kidney tissue; Calcium ion detection kit was used to detect urinary calcium and renal calcium contents. Babaric acid and peroxisome proliferator activated receptor γ (PPARG), WNK lysine deficient protein kinase 1 (WNK1), calcium sensing receptor (CASR) and cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1 (CYP24A1) protein were molecularly docked by Auto Dock software and docking results were analyzed.The results ofexperiments showed that compared with normal group, 100 μmol/L babaric acid had no significant effect on MDCK cell viability; In 30 mg/mL lipopolysaccharide-induced inflammatory cell model, babaric acid significantly increased MDCK cell viability (< 0.05). The results ofexperiments showed that inflammatory cell infiltration in kidney tissue of mice in each administration group was improved, and kidney tissue damage score was significantly reduced (< 0.05); Calcium content of kidneys in low-dose babatic acid group and Shenshitong group was significantly decreased than that of model group (< 0.05), and urinary calcium content was significantly increased (< 0.05). The results of molecular docking showed that molecular docking energy of PPARG, WNK1, CASR, CYP24A1 protein and babaric acid were all less than ?21 kJ/mol, and docking effect was good.Babaric acid inin Guizhou has good anti-inflammatory and inhibiting effects on renal calcium accumulation. The mechanism of its leaching activity is related to the binding activity of PPARG, WNK1, CASR and CYP24A1 proteins.

leaching effect;(Christ) Chingin Guizhou; babaric acid; peroxisome proliferator activated receptor γ; WNK lysine deficient protein kinase 1; calcium sensing receptor; cytochrome P450 family 24 subfamily A member 1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)03 - 0767 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.03.016

2021-09-30

國家自然科學基金資助項目（82160773）；貴州省教育廳特色領域項目（黔教合KY字[2021]068）

隋 怡，碩士，助理實驗師，研究方向為中藥藥理和中藥毒理學研究。E-mail: 836017075@qq.com

楊武德，教授，研究方向為中藥化學成分及質量評價。E-mail: ywd_680708@sina.com

[責任編輯 李亞楠]