周巖飛 吳長輝 姚渭溪 李 曄

（福建仙芝樓生物科技有限公司/國家食用菌加工技術分中心，福建福州 350002）

靈芝Ganoderma lucidum為多孔菌科真菌赤芝的干燥子實體[1]，含有多種活性成分，以靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝甾醇和核苷類為主，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤和保肝等活性[2]。目前已經(jīng)從不同來源的靈芝中分離出200 多種靈芝多糖，它們主要是由β-（1→3）-D、β-（1→4）-D、β-（1→6）-D 等幾種β-葡聚糖組成。葡聚糖是由葡萄糖單體聚合而成的一類高分子多糖，可分為α 型和β 型。常見的α-葡聚糖主要存在于淀粉、糊精和糖原，β-葡聚糖主要存在于微生物和食藥用菌等真菌中。目前藥理學研究表明，β-葡聚糖是高效的生物反應調(diào)節(jié)因子，是一種生物活性多糖，在調(diào)節(jié)免疫和抗腫瘤方面發(fā)揮著重要作用，具有重要開發(fā)應用前景[3]。靈芝的β-葡聚糖屬于胞內(nèi)多糖，存在于細胞壁或細胞間質中；而靈芝子實體的細胞壁是由纖維素、半纖維素和木質素組成的致密結構，因此不易從細胞內(nèi)提取出靈芝多糖。目前提取多糖的方法主要有熱水浸提法[1]、超聲輔助提取法[4]、微波輔助提取法[5]、酶法輔助提取法[6]、亞臨界水提取法[7]和超高壓提取法[8]，熱水浸提法是工業(yè)生產(chǎn)常用的方法，但提取時間長和能耗高限制其產(chǎn)業(yè)化發(fā)展；超聲輔助提取以超聲高頻振蕩產(chǎn)生的空穴效應破壞細胞壁使多糖溶出，但中試及產(chǎn)業(yè)化投資成本高；微波輔助提取以微波破壞細胞壁，但對設備要求高，樣品處理量小，會產(chǎn)生大量蒸汽，難以大規(guī)模應用；酶作用于靈芝中幾丁質、纖維素等物質，使其與多糖分離，不破壞多糖結構，但酶易失活，且較難把控酶的適宜pH 及最佳溫度；超微粉碎將物料粉碎成直徑小于10 μm粉體，使靈芝細胞最大限度破壁，直接釋放胞內(nèi)有效成分，但存在毒性成分溶出風險，易吸附雜質[9]。亞臨界水提取基于相同原理，但是溫度和壓力要求更高，高溫易導致β-葡聚糖生物活性的下降[10]。高溫高壓水提法利用高壓和高溫對細胞壁的破碎作用使多糖溶出，該提取方法簡單可行、適用性強，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。為此，筆者進行高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的優(yōu)化工藝條件，以期為靈芝的深加工提供科學的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院）、中溫α-淀粉酶（4000 U/g，上海麥克林生化科技有限公司）、糖化酶（10000 U/g，西亞化學科技（山東）有限公司）、蒽酮（AR，上海麥克林生化科技有限公司）、硫酸（AR，西隴科學股份有限公司）、純化水（RO，自制）、GMA-UN2 超純水機（北京普析通用儀器有限責任公司）、UV-2450 紫外可見分光光度計（島津制作所）、TD-5 臺式離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州易晨儀器制造有限公司）、WGL-125B電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）、LDZF-75 L-1 立式高壓滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，溫度上限為137 ℃，壓力上限0.33 MPa）

1.2 材料

靈芝顆粒（批號SBB-L3C-201012）由仙芝科技（福建）股份有限公司提供，靈芝經(jīng)除雜、干燥和粉碎后過篩（孔徑為840～2000 μm）。

1.3 方法

稱取靈芝顆粒若干份，每份20 g，加水后進行高溫高壓提取，提取后使用74 μm孔徑濾布過濾，濾液濃縮蒸干，烘干至恒重，稱重得到提取物質量并計算提取物得率；用水溶解提取物并定容，以無水葡萄糖為對照品，用酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法檢測β-葡聚糖總量，計算得靈芝β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)。

1.4 酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法

2020版中國藥典一部靈芝[含量測定]多糖[1]的方法中加入酶解α-葡聚糖步驟（供試品溶液的制備方法）：取烘干恒重后的提取物，加水溶解，定容至100 mL，取25 mL轉移至50 mL離心管，加入30 mg中溫α-淀粉酶，55 ℃酶解1 h；用滴管滴入1 滴（約0.002 mL）0.1 mol/L的鹽酸溶液，使其pH為4.0～4.5，加入30 mg 糖化酶，55 ℃酶解1 h；離心取上清5 mL，邊攪拌邊加入乙醇75 mL，醇沉后操作同2020版中國藥典。

1.5 高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素試驗

1.5.1.1 提取溫度對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

稱取靈芝顆粒7 份，每份20 g，料（g）液（mL）比為1∶15，提取溫度為100 ℃、105 ℃、110 ℃、115 ℃、120 ℃、125 ℃、130 ℃，提取時間為10 min，提取后操作同1.3。每組試驗重復3 次，取平均值。

1.5.1.2 提取時間對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

稱取靈芝顆粒5 份，每份20 g，料（g）液（mL）比為1∶15，提取時間為10 min、20 min、30 min、40 min、60 min，提取溫度為130 ℃，提取后操作同1.3。每組試驗重復3 次，取平均值。

1.5.1.3 料液比對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

稱取靈芝顆粒5 份，料（g）液（mL）比為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40，提取時間為40 min，提取溫度為125 ℃，提取后操作同1.3。每組試驗重復3次，取平均值。

1.5.1.4 提取次數(shù)對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

稱取靈芝顆粒5 份，每份20 g，料（g）液（mL）比為1∶15，提取時間為40 min，提取溫度為125 ℃，提取1、2、3、4、5 次，提取后操作同1.3。每組試驗重復3 次，取平均值。

1.5.2 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果，用L9（34）設計正交試驗，考察提取溫度、時間、次數(shù)對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響。靈芝顆粒每份20 g，每組試驗重復3 次，取平均值以確定最佳工藝條件。

1.6 不同方法提取靈芝β-葡聚糖對比

分別采用熱水浸提法[1]、超聲輔助法[4]、微波輔助法[5]和酶法輔助法[6]提取靈芝β-葡聚糖。靈芝顆粒每份20 g，每組試驗重復3 次，取平均值。

2 結果與分析

2.1 測定方法和試驗參數(shù)的確定

酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法測定β-葡聚糖標準曲線見圖1。

圖1 酶解α-葡聚糖-蒽酮-硫酸法測定靈芝β-葡聚糖標準曲線

2.2 高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖

2.2.1 提取溫度對β-葡聚糖提取率及提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

由圖2 可以看出，β-葡聚糖提取率與提取溫度成正比關系，130 ℃時提取率最高；提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)與提取溫度成正比關系，說明隨著溫度升高，β-葡聚糖的溶出速度大于雜質的溶出速度，130 ℃時提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)最高。綜合結果選取130 ℃作為以下試驗的提取溫度。

圖2 提取溫度對提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)及β-葡聚糖提取率的影響

2.2.2 提取時間對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

由圖3 可以看出，β-葡聚糖提取率與提取時間成正比關系，特別是提取30 min 以后，提取率上升加快，提取60 min 時提取率最高；提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)與提取時間成正比關系，說明延長提取時間，特別是提取30 min 以后，β-葡聚糖的溶出速度大于雜質的溶出速度，提取60 min時提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)最高。綜合結果表明30 min 以后β-葡聚糖會加速溶出，提取60 min最佳。

圖3 提取時間對提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)及β-葡聚糖提取率的影響

2.2.3 料液比對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

選取最佳提取溫度和時間次優(yōu)點，125 ℃，40 min，料液比設定5個梯度，提取結果見圖4。

圖4 料液比對提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)及β-葡聚糖提取率的影響

由圖4 可以看出隨著料液比上升，β-葡聚糖提取率緩慢上升，料液比1∶35以后停滯。由此得出，液料比過高，溶出雜質越多，不僅延長濃縮時間，還會導致多糖的損失，提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)下降[11]。綜合考量，以料（g）液（mL）比1∶15為最佳。

2.2.4 提取次數(shù)對β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響

選取最佳提取溫度和時間次優(yōu)點，125 ℃，40 min，料液比1∶15（g/mL），提取1～5 次。 結果見圖5。

圖5 提取次數(shù)對提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)及β-葡聚糖提取率的影響

由圖5 可以看出，提取3 次即可完全提取β-葡聚糖，β-葡聚糖提取率增長趨于平緩；再增加提取次數(shù)，提取物中β-葡聚糖反而降低，說明β-葡聚糖存在溶出上限，提取次數(shù)過多反而溶出更多雜質，導致提取物中β-葡聚糖下降。綜合結果，以提取3次為最佳。

2.2.5 正交試驗

仿真的參數(shù)帶寬為800 kHz， FFT點數(shù)為4 096點，所加時延為[0 0.2 0.6 1.0 1.5 2.0]，最大多普勒頻移為4 Hz，萊斯因子等于5的萊斯信道。

選取提取溫度、時間、次數(shù)作為高溫高壓水提靈芝β-葡聚糖的關鍵因素，料（g）液（mL）比為1∶15，由于提取溫度對提取率及提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)的影響較大；又因為立式高壓滅菌器的溫度上限為137 ℃，故溫度因素補充135 ℃水平。

試驗因素水平見表1，正交試驗結果見表2，β-葡聚糖提取率極差分析見表3，β-葡聚糖提取率方差分析見表4，提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)極差分析見表5，提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)方差分析見表6。

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗

表3 β-葡聚糖提取率極差分析

表4 β-葡聚糖提取率方差分析

最佳水平為A3B1C3，提取次數(shù)對β-葡聚糖提取率影響較大，其次為溫度。

提取次數(shù)對β-葡聚糖提取率影響具有顯著性影響，提取溫度和提取時間對β-葡聚糖提取率沒有顯著性影響。

最佳水平為A3B3C3，提取溫度對提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)影響較大，其次為提取次數(shù)。

溫度和次數(shù)對提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)具有顯著性影響，提取時間沒有顯著性影響。

以提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)為目標，兼顧β-葡聚糖提取率，選取A3B3C3進行重復試驗，結果見表7。

表7 重復驗證試驗結果

2.3 不同方法提取靈芝β-葡聚糖結果對比

由圖6 可以看出，高溫高壓水提取的β-葡聚糖提取率和提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)都高于熱水浸提法和其他提取方法。

圖6 不同提取方法提取β-葡聚糖效果

3 小結與討論

采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的條件，結果表明，高溫高壓水提取靈芝β-葡聚糖的最佳條件為料（g）液（mL）比1∶15，提取溫度為135 ℃，提取時間為60 min，提取次數(shù)為3 次，在此條件下，提取物中β-葡聚糖的質量分數(shù)為27.03%，β-葡聚糖的提取率為3.824%。

以往研究中只注重靈芝多糖提取率[4-9]，忽視提取物中靈芝多糖質量分數(shù)，若提取時雜質溶出過多，需要更多的純化手段以提高成品中的靈芝多糖純度，從而加重多糖純化工作。筆者研究表明，與傳統(tǒng)的提取方法和亞臨界水提取法相比，高溫高壓水提取法明顯提高了β-葡聚糖提取率及在提取物中的質量分數(shù)，同時又避免了提取雜質溶出過多或提取溫度過高時大分子的β-葡聚糖發(fā)生分解，導致提取物中β-葡聚糖質量分數(shù)下降的弊端。高溫高壓水提取溫度為135 ℃，壓力約0.3 MPa時，β-葡聚糖的提取率比常壓的熱水提取方法提高一倍多（圖6），操作簡便安全，大幅度提高資源利用率，可進一步擴大進行工業(yè)化生產(chǎn)。

正交試驗提取溫度為135 ℃時，β-葡聚糖提取率最高，從圖2 的β-葡聚糖提取率上升趨勢可知，β-葡聚糖提取率并未在135 ℃達最高值。由于試驗滅菌器的溫度和壓力存在上限，今后可采用其他設備進行更高提取溫度試驗。