林士杰， 王梓默， 朱紅波， 何懷江， 勾天兵， 韓 姣

(1. 吉林省林業(yè)科學研究院， 吉林 長春 130033； 2. 吉林省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院， 吉林 長春 130022)

椴樹屬(TiliaL.)隸屬于椴樹科，形態(tài)結(jié)構(gòu)特殊，是該科中唯一典型的北溫帶分布屬。分布在亞洲、歐洲和北美洲，相互分離，構(gòu)成典型的三塊獨立分布格局[1]。椴樹屬植物為落葉喬木，全球約有80種，中國有30多種，其形態(tài)特征表現(xiàn)為花序或果序上著生著奇葩的大型苞片，這是其他所有科屬植物都不具有的特征[2]。該屬植物材質(zhì)輕軟，紋理通直，光澤而又富有彈性，是極好的用材樹種。樹形優(yōu)美，葉大陰濃，花香馥郁，對煙塵和有害氣體抗性強，是極佳的園林觀賞樹種，被譽為世界四大闊葉行道樹之一[3]。同時，椴樹屬植物既是重要的蜜源植物，又具有較高的藥用價值，是開發(fā)潛力極大的闊葉用材樹種。

近年來，我國對椴樹屬苗木的需求量日漸增大，但因其種子具有致密的種皮、堅韌的果皮，嚴重影響了氣體與水分的攝入，果皮、種皮以及胚乳中均存在抑制物質(zhì)，導(dǎo)致椴樹屬植物具有不同程度的休眠性，種子發(fā)芽率低，參差不齊[4-10]，難以滿足其種群的擴大[11，12]。同時，種子繁殖，后代會產(chǎn)生性狀嚴重分離，而無性繁殖技術(shù)能夠保持母本的優(yōu)良性狀，個體之間差異較小，是實現(xiàn)椴樹屬優(yōu)質(zhì)資源高效繁殖、穩(wěn)定遺傳的重要基礎(chǔ)。但在無性繁殖技術(shù)方面有關(guān)椴樹屬植物的研究進展比較遲緩，筆者對國內(nèi)外學者在椴樹屬植物無性繁殖方面的研究進行詳細總結(jié)歸納，分析這些技術(shù)中存在的主要問題，提出一些合理化建議，旨在為椴樹屬優(yōu)質(zhì)資源快繁技術(shù)以及資源開發(fā)利用提供參考。

1 研究進展

椴樹屬樹種傳統(tǒng)的繁殖方法是以播種繁殖為主，但由于椴樹屬植物具有不同程度的休眠特性，自然條件下，經(jīng)過2個冬季1個夏季后，種子才會陸續(xù)萌發(fā)，多數(shù)在自然狀態(tài)下甚至更長時間才能萌芽，發(fā)芽率低，幼苗出土后參差不齊。同時，絕大多數(shù)樹木實生繁殖方式不能保持植株遺傳特性，而且易產(chǎn)生遺傳分化，無性繁殖是有效保護、保存紫椴優(yōu)良基因資源穩(wěn)定性的最佳途徑。國內(nèi)外許多研究人員對椴樹屬樹種的嫁接、扦插及組培繁殖技術(shù)進行了研究，并取得了一定的進展，但是，到目前為止，仍無法滿足國內(nèi)外市場對椴樹屬優(yōu)良苗木的需求。

1.1 嫁接

嫁接繁殖具有能夠保持母本個體的優(yōu)良特性、固定變異、擴大繁殖系數(shù)、改變植株觀賞形態(tài)等諸多優(yōu)點[13，14]。姚盛智等[15]于1977—1986年對紫椴進行了4次嫁接對比試驗，篩選出成活率在89 %以上的“貼接法”應(yīng)用于生產(chǎn)，認為嫁接時間最好選在5月9日至5月15日之間；接穗應(yīng)從原始母樹林中采穗建立采穗圃，從采穗圃無性系分株上采集接穗進行嫁接，可大大提高嫁接成活率。李慶國等[16]以7種椴樹屬樹種1年生枝條為接穗，2年生紫椴作為砧木進行劈接、芽接，結(jié)果表明，樹種不同、方法不同，嫁接成活率也大不相同，其中以紫椴為砧木，小葉椴嫁接成活率最高，達81.25 %。砧木的選擇對嫁接新品系的生長狀況、結(jié)實品質(zhì)以及抗逆性都會產(chǎn)生很大的影響[17-20]。劉云強等[21]以糠椴、蒙椴、紫椴為砧木，對大葉美洲椴、錐形銀椴采用不同方式進行嫁接試驗，總結(jié)表明，糠椴、蒙椴、紫椴作為砧木與大葉美洲椴、錐形銀椴都具有較強的親和力，嫁接成活率平均達85 %以上。這些研究為椴樹屬樹種嫁接繁殖在生產(chǎn)應(yīng)用中提供了一定的技術(shù)參考。

1.2 扦插繁殖

與嫁接、壓條、埋條等方法相比，扦插繁殖技術(shù)具有諸多優(yōu)點，扦插材料容易獲取，操作簡便易行，苗木生長速度也較快，成本低，并且能夠保留親本的優(yōu)良性狀[22-25]。影響扦插生根率的因素有很多，關(guān)鍵因子主要有以下幾個。

1.2.1 植物生長調(diào)節(jié)劑(植物激素)

植物生長調(diào)節(jié)劑(植物激素)可以促進插穗生根，尤其對扦插生根比較困難的樹種具有明顯促進效果[26]，但其種類的選擇、濃度以及浸泡時間對插穗生根的效果都會產(chǎn)生極大的影響。謝遵國等[27]、楊虹等[28]、吳小龍等[29]研究表明，IBA、NAA、ABT 3種植物生長調(diào)節(jié)劑對紫椴、泰山椴插穗生根具有明顯的促進作用，嫩枝生根率顯著高于硬枝。王文鳳等[30]提出，不同濃度的IBA處理蒙椴2～3年生嫩枝不僅大大提高了插穗生根率，而且生根數(shù)量和根長也明顯增加，生根時間也顯著縮短。姚穎等[31]通過對3年生紫椴實生苗的半木質(zhì)化插穗采用不同生長調(diào)節(jié)劑處理15 s，定期對比生根情況，結(jié)果表明，IBA的各個濃度處理生根效果都優(yōu)于相同濃度的IAA、NAA處理，1 000 mg·kg-1的IBA處理生根效果最佳，生根率達到56 %。王海南等[32]采用不同濃度IBA、NAA、ABT，不同時間處理紫椴1年生新苗嫩枝，其生根情況對比分析表明，與NAA、ABT1處理相比，IBA能顯著促進繁殖材料的生根率、生根量以及平均根長，最優(yōu)組合為100 mg·L-1IBA處理8 h，生根率高達63.07 %，并提出各植物生長調(diào)節(jié)劑低濃度結(jié)合較長時間處理會顯著影響嫩枝的生根數(shù)量和平均根長。

張曉曼等[33]、張芹等[34]將大葉金葉椴、糠椴嫩枝采用一定濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑浸泡與發(fā)根農(nóng)桿菌處理相結(jié)合，生根率及根長生長效果顯著高于對照，生根時間大大縮短。

1.2.2 插條選擇

扦插苗木的生長狀況在一定程度上取決于母樹年齡、插穗類型、插穗采集時間以及部位。謝遵國等[27]試驗證實，母樹年齡越高生根越難。王海南等[32]對比研究表明，1年生紫椴嫩枝插穗無論是生根質(zhì)量還是生根率、生根量以及平均根長都明顯優(yōu)于2年生嫩枝插穗。楊虹等[28]、吳小龍等[29]提出，紫椴、泰山椴嫩枝生根率顯著高于硬枝。張淑華等[35]試驗證實，紫椴6月下旬采集插穗生根效果最佳。帶有側(cè)芽的插穗生根效果遠遠好于帶有頂芽的插穗。吳小龍等[29]通過對泰山椴插穗不同部位、不同采集時間研究得出，選擇8月上旬的半木質(zhì)化枝條中段生根效果最佳。史鋒厚等[36]通過對插穗留葉數(shù)量、插穗粗度對比研究，得出南京椴選擇粗度0.55 cm以上的嫩枝制備插穗，保留一片葉片生根效果最佳。

1.2.3 基質(zhì)及環(huán)境

基質(zhì)不同，其透水性、通氣性、保水性等功能特點也有所不同[37-40]，與扦插環(huán)境直接影響插穗生根部分的溫度、濕度與插穗的水分平衡[41-43]，適宜基質(zhì)及環(huán)境的選擇是確保扦插生根率的關(guān)鍵因子，同時，利用半木質(zhì)化嫩枝插穗進行扦插是開展繁殖困難樹種規(guī)?；瘮U繁的重要途徑[44，45]。王海南等[32]在溫室內(nèi)，以河沙、蛭石及珍珠巖+泥炭土(體積比1∶3)作為基質(zhì)，采用自動間歇式噴霧，以1年生、2年生紫椴當年半木質(zhì)化枝條中上部分制成插穗進行扦插，60 d研究結(jié)果顯示，3種基質(zhì)中河沙扦插生根率顯著高于其他基質(zhì)，在河沙上1年生枝條生根率平均為37.16 %，2年生枝條生根率平均為28.99 %。姚穎等[31]在插床上搭建拱棚，設(shè)置控溫控濕設(shè)備，選用河沙、蛭石、河沙+蛭石(體積比1∶3)3種無機基質(zhì)，將闊葉落葉、針葉落葉、蘑菇栽培廢棄物、木耳栽培廢棄物、樹皮、稻殼、鋸末和草炭8種材料按不同比例混合配置成43個有機混合基質(zhì)，采用相同濃度生長調(diào)節(jié)劑處理3年紫椴實生苗的嫩枝插穗，統(tǒng)計結(jié)果顯示，在無機基質(zhì)中，河沙的生根率最高達51 %，在有機基質(zhì)中，樹皮+針葉，樹皮+鋸末，樹皮+蘑菇栽培廢棄物、針葉+樹皮+草炭這4個混合基質(zhì)生根率較高，其中樹皮+針葉生根率最高達到60 %。史鋒厚等[36]采用自動噴霧、自動遮陽和溫控系統(tǒng)，在溫室內(nèi)以珍珠巖為基質(zhì)，插穗采用1 000～1 500 mg·L-1IBA處理，生根率可達80 %。

1.3 組織培養(yǎng)

植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有增殖倍數(shù)大、繁殖速度快、經(jīng)濟效益好等優(yōu)點，而且不會因為場地和外界環(huán)境條件而受到局限。椴樹屬樹種組織培養(yǎng)技術(shù)具有一定難度，最早進行椴樹研究的是Barker，他從美洲椴的不同組織中誘導(dǎo)出了愈傷組織；Chalupa首次從心葉椴幼樹腋芽中獲得了分化的嫩芽；國內(nèi)外學者又相繼對椴樹屬樹種組培再生擴繁技術(shù)進行研究并取得了一定的進展。椴樹屬樹木離體快繁研究概況見表1。

表1 椴樹屬樹木離體快繁研究概況

1.3.1 外植體

目前，開展離體再生繁殖的椴樹屬樹種主要有美洲椴、心葉椴、日本椴、歐洲小葉椴、南京椴、紫椴。外植體的選擇是椴樹屬樹種組培再生體系建立成功與否的關(guān)鍵因子之一，到目前為止，椴樹屬樹種選取的外植體類型包括腋芽、莖尖、葉片、根尖、無芽莖段、帶腋芽的莖段、成熟胚、上胚軸。椴樹以腋芽、帶腋芽的莖段、成熟胚、上胚軸為外植體，能夠成功誘導(dǎo)出叢生芽，而其他組織僅僅只是誘導(dǎo)出了愈傷組織，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，愈傷組織逐漸變成黑褐色，失去分化能力。這些研究表明，帶芽莖段、成熟胚作為外植體，是椴樹屬樹種叢生芽誘導(dǎo)的最佳選擇材料。

1.3.2 培養(yǎng)基

日本尹陽等[46]選擇IS、WPM、BTM 3種培養(yǎng)基添加不同濃度的BAP篩選適宜心葉椴腋芽萌發(fā)的培養(yǎng)基，結(jié)果表明，WPM培養(yǎng)基適宜誘導(dǎo)心葉椴腋芽萌發(fā)。日本尹陽[47]又在MS、IS中添加不同濃度BAP篩選誘導(dǎo)紫椴腋芽萌發(fā)的培養(yǎng)基，結(jié)果表明，MS培養(yǎng)基有利于誘導(dǎo)腋芽萌發(fā)，嫩枝形成率77.6 %。張建瑛等[48]選擇WPM、1/2 WPM、MS 3種培養(yǎng)基添加一定濃度的BA、NAA進行帶芽莖段誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選，結(jié)果表明，帶芽莖段在WPM培養(yǎng)基上啟動率顯著高于1/2 WPM、MS，啟動時間顯著快于二者，是誘導(dǎo)帶芽莖段萌發(fā)的最佳啟動培養(yǎng)基。

MS培養(yǎng)基適用于日本椴、歐洲小葉椴、紫椴叢生芽的增殖培養(yǎng)，WPM適合于心葉椴、紫椴腋芽增殖培養(yǎng)。日本椴、歐洲小葉椴、南京椴、紫椴生根多以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，湯詩杰等[49]以MS為南京椴生根培養(yǎng)基，也成功獲得生根苗。心葉椴以WPM為生根基本培養(yǎng)基。

1.3.3 植物生長調(diào)節(jié)劑

基本培養(yǎng)基中添加一定濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑是樹木組培再生體系能否成功建立的關(guān)鍵因子，植物生長調(diào)節(jié)劑在植物組織培養(yǎng)工作中占據(jù)至關(guān)重要的地位。目前研究顯示，椴樹屬樹種組培再生體系應(yīng)用的植物生長調(diào)節(jié)劑細胞分裂素主要有6-BA、KT，生長素主要有NAA、IBA、GA3。從表1中可以看出，從腋芽誘導(dǎo)、叢生芽的形成、叢生芽的增殖培養(yǎng)以及誘導(dǎo)生根培養(yǎng)基的成功建立，并不是細胞分裂素或生長素獨立作用的結(jié)果，而是二者在一定濃度范圍內(nèi)的相互協(xié)同作用促進了椴樹屬樹種外植體組培再生體系的成功建立。單獨使用6-BA時，南京椴不定芽分化率僅為25 %，并且莖很細，葉黃，出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象[50]。培養(yǎng)基中除6-BA、IBA外，添加一定質(zhì)量濃度的GA3，不僅利于紫椴腋芽的伸長生長，而且增殖的不定芽數(shù)量增多，不定芽莖粗壯、葉子大[48]。適宜濃度的6-BA、NAA有利于南京椴、歐洲小葉椴、日本椴不定芽分化、增殖[50-52]。IBA、KT、GA3也被應(yīng)用到了南京椴腋芽的誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)[49]。對于歐洲小葉椴[51]、日本椴[52]、心葉椴[46]，適宜質(zhì)量濃度的IBA、NAA相互組合使用即可誘導(dǎo)正常生根[46，51，52]，而南京椴生根誘導(dǎo)過程中，除IBA外，培養(yǎng)基中還加入了一定量的6-BA[50]。

1.3.4 蔗糖、pH及添加劑

張建瑛等[48]試驗證實，蔗糖質(zhì)量濃度過低、過高對紫椴腋芽的增殖都會產(chǎn)生影響，20 g·L-1最為適宜。同時提出，培養(yǎng)基微酸性(pH 6.0～6.5)增生的腋芽飽滿，長勢良好，pH 5.5的酸性環(huán)境條件下腋芽增殖系數(shù)顯著下降，葉片變得細長。南京椴生根培養(yǎng)過程中，MS培養(yǎng)基中添加活性炭，有助于不定根的誘導(dǎo)，與培養(yǎng)基中不添加任何物質(zhì)相比，生根率提高了74.2 %，而且苗生長旺盛，粗壯[50]。

1.3.5 移栽基質(zhì)及環(huán)境條件

組培生根苗移栽的成活率、長勢是直接關(guān)系到能否實現(xiàn)椴樹屬樹種苗木規(guī)?；a(chǎn)的關(guān)鍵，到目前為止，椴樹屬樹種組培苗移栽方面的研究主要包括基質(zhì)、移栽后的溫度、濕度。陳罡等[52]提出，日本椴生根苗在自然光下開瓶2～3 d，20～25 ℃清水沖洗根部，0.1 %代銨森浸根3～5 min，移栽至細河沙+珍珠巖(體積比2∶1)的混合基質(zhì)中，每天早晚各噴水1次，成活率達到80 %。白卉等[51]在22～25 ℃，空氣濕度為70 %～90 %的條件下，選用蛭石+壤土(體積比1∶1)的混合基質(zhì)，移入經(jīng)70 %甲基托布津藥液消毒的歐洲小葉椴生根苗，成活率達75 %。南京椴移入泥炭土和河沙中，30 d后統(tǒng)計結(jié)果顯示，生根苗在泥炭土中成活率較高，達80 %以上，而在河沙中成活率為60 %[50]。

1.4 體胚誘導(dǎo)

體胚發(fā)生技術(shù)已經(jīng)成為木本植物快速繁殖的重要手段[53]。Gupta P K，Durzan D J，Smith D R[54-56]將體胚發(fā)生和植株再生技術(shù)成功應(yīng)用到火炬松、挪威云杉、輻射松等木本植物，并實現(xiàn)了商業(yè)化應(yīng)用。體胚發(fā)生技術(shù)應(yīng)用到椴樹方面的研究進展十分緩慢，僅Chalupa[57]提出MS培養(yǎng)基中添加2，4-D 0.5 mg·L-1為歐洲小葉椴體胚最佳誘導(dǎo)條件，成熟的胚性細胞植入添加0.1～0.2mg·L-1IBA的MS培養(yǎng)基中，體胚萌生2～4周長出根和芽。

2 展望

常規(guī)無性繁殖(嫁接、扦插)技術(shù)研究在近年來得到很大發(fā)展，但仍存在很多不足。尤其是目前在椴樹屬樹種的生根機理的解剖學、生理生化(植物激素、酶活性、營養(yǎng)物質(zhì)等)以及生根過程中養(yǎng)分變化、輔助因子與生根的相互關(guān)聯(lián)性等方面研究較為匱乏，諸多問題有待于進一步研究。

生物技術(shù)中的組織培養(yǎng)和體細胞胚培養(yǎng)技術(shù)在近年來取得很大進步，主要研究的重點集中在不同外植體的叢生芽誘導(dǎo)、增殖以及生根培養(yǎng)，雖獲得了不同椴樹的再生植株，但是再生體系并不成熟，有待于進一步完善。同時，對于近些年迅速發(fā)展起來的如細胞懸浮培養(yǎng)、突變體篩選等方面并未見報道。隨著時代的飛速發(fā)展，生物技術(shù)的日新月異，體細胞胚胎發(fā)生技術(shù)將成為林木規(guī)?；旆钡闹匾侄危_辟椴樹屬植物無性繁殖技術(shù)研究新的途徑，具有極高的應(yīng)用價值。相信通過不懈努力，椴樹屬植物的組織培養(yǎng)工作將會取得更大的成績，使其綜合利用價值更高。