楊紅力 李洋

（北京中職安康科技有限公司環(huán)境實驗室 北京 101399）

隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲（簡稱“兩蟲”）是一類寄生于人和動物體內(nèi)的腸道原蟲，是一類致病性原生寄生蟲［1］，主要通過飲用水和食物等途徑傳播［2］。人類飲用了含有這些原蟲孢囊或卵囊的飲用水，有可能造成嚴重的腸胃疾?。?-3］，且無特殊臨床癥狀，無預(yù)防疫苗，絕大多數(shù)抗生素無效，治療依賴于人體自身的抵抗力［1，4］，嚴重影響公眾的健康生活。美國早在1996 年就將“兩蟲”感染分別列入國家必須申報的傳染病名單，并給出相應(yīng)的檢測方法［3-5］。我國在2006 年頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標準》（GB 5749-2006）中，也新增加了“兩蟲”的檢測指標，并推薦了檢測方法［6-7］。

目前，檢測飲用水中的“兩蟲”主要采用免疫磁分離（IMS，Immunomagnetic Separation）技術(shù)，由美國環(huán)保總局（USEPA）發(fā)布推薦使用，是目前國際上最為常用的標準檢測方法，即利用標記有與“兩蟲”孢囊和卵囊表面抗原特異性結(jié)合的抗體的磁珠與卵囊和孢囊相結(jié)合，從而實現(xiàn)“兩蟲”與雜質(zhì)分離［8-9］。在檢測過程中，有一個非常重要的質(zhì)控指標——回收率［10-12］，即定量的“兩蟲”孢囊和卵囊在經(jīng)過整個檢測流程后能夠回收的孢囊和卵囊所占的百分率?；厥章实母叩褪桥袛鄼z測結(jié)果是否可信的重要指標，是水中“兩蟲”檢測過程中主要的質(zhì)控手段［13］。已有的研究表明，回收率的損耗主要在樣品的前處理階段［7，12-14］。水樣的前處理包括定量抽濾、洗脫淘洗、離心濃縮、免疫磁分離等過程，不同的前處理階段對回收率的影響有所差異［14］。以往的研究只是在整體上提出回收率主要損失在前處理階段，如水質(zhì)雜質(zhì)、顆粒物、渾濁度、水溫等［15-17］，或者在分子層面另辟蹊徑［18］，并沒有對前處理具體階段的損失程度進行定量評估。本實驗通過在各前處理階段定量加標，分析回收率在不同前處理階段對的損耗程度及所占比例，并提出“損失率”的概念，進而對回收率在各處理階段的損耗進行定量化分析，以期為優(yōu)化前處理過程、提高實驗質(zhì)量和檢測結(jié)果可信度提供一定的實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和設(shè)備

蠕動泵（Easyload 美國Masterflex）；Filta-Max Xpress快速淘洗裝置（美國IDEXX）；離心機（DDSM 湘儀）；樣品混旋器（Dynabeads MX Mixer 美國invitrogen）；磁極（MPC-1/MPC-S 挪威Dynal）；熒光顯微鏡（BX53日本Olympus）。

1.2 試劑和耗材

免疫磁分離試劑盒（Dynabeads GC-Combo 挪威Dynal）；免疫熒光染色試劑盒（EasyStain 澳大利亞BTF）；質(zhì)控標樣（澳大利亞BTF）；NaOH 溶液（1.0mol/L）；HCl 溶液（0.1mol/L）；PETT 淘洗緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）；磷酸鹽緩沖液（現(xiàn)用現(xiàn)配）；DAPI 溶液（德國Sigma）；Filta-Max Xpress濾器（美國IDEXX）；錐形離心管（500mL）；L型試管（10mL）。

1.3 加標微生物

“兩蟲”標樣由澳大利亞Easyseed 提供，單次加標一劑，含有賈第鞭毛蟲孢囊（100±1.7）個、隱孢子蟲卵囊（100±1.6）個。

1.4 實驗水樣

樣品來源：實驗室超純水（20L）。

1.5 實驗方法

實驗前處理方法采用目前《生活飲用水檢測標準微生物指標》（GB/T 5750.12-2006）推薦的Filta-Max Xpress快速法，分析步驟如下。

（1）抽濾：蠕動泵抽濾水樣，流速3L/min，樣品量20L。

（2）淘洗：將壓力淘洗裝置準備就緒，緩沖液槽中加入足量淘洗緩沖液，將緩沖液槽與淘洗裝置連接完畢，啟動Filta-Max Xpress 快速淘洗裝置，開始自動淘洗，取得淘洗液約450mL。

（3）離心：將取得的淘洗液放入低速離心機，2000G離心力離心15min，自然減速，虹吸法棄上清液，留取沉淀物約10mL，以超細玻璃吸管反復(fù)多次轉(zhuǎn)移沉淀物至L型試管。

（4）免疫磁分離：在L 型試管中加入bufferA、bufferB、“兩蟲”特異性磁珠抗體，旋轉(zhuǎn)結(jié)合至少1h，后以MPC-1 磁極收集磁珠，鹽酸酸化，以MPC-S 磁極分離磁珠與樣品；染色計數(shù)，EasyStain 試劑盒染色、DAPI溶液染色，封片，于熒光顯微鏡下觀察計數(shù)。

為了定量分析前處理具體階段的損失程度，進行以下實驗處理。

實驗1：全程序?qū)嶒灒?0L實驗室超純水加標一劑，經(jīng)過整個實驗步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對照1次。

實驗2：去除抽濾富集步驟，直接在濾芯中加標一劑，繼續(xù)剩余步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對照1次。

實驗3：去除抽濾和洗脫步驟，直接在錐形離心管中加標一劑，繼續(xù)剩余步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對照1次。

實驗4：去除抽濾、洗脫、離心步驟，直接在L 型試管中加標一劑，繼續(xù)剩余步驟，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3次，空白對照1次。

實驗5：直接一劑標樣直接滴入載玻片內(nèi)，染色鏡檢，得出回收率，算出損失率，重復(fù)3 次，空白對照2次。

實驗過程中所用濾芯、載玻片均為一次性使用，使用錐形離心管和L 型試管為高壓滅菌后使用。

2 結(jié)果

2.1 不同實驗處理所得回收率檢測結(jié)果

各實驗均做3次平行及空白，結(jié)果見表1。

表1 實驗各階段“兩蟲”回收率結(jié)果

由實驗結(jié)果可知，實驗5 的回收率在所有處理中最高，達96.7%，其影響主要發(fā)生在染色鏡檢階段；而實驗4 的回收率為92.3%，其對應(yīng)影響是免疫磁分離（IMS）階段和染色鏡檢階段，計算得知，此兩步處理對回收率的影響較小，在5%以下；將實驗4 與實驗1 對比，即去除抽濾、洗脫、離心之后，可知，其回收率為69.3%，由超過30%的“兩蟲”孢囊和卵囊損失于這3個階段。

2.2 不同實驗處理所得損失率檢測結(jié)果

為了更好地觀察各處理階段對隱孢子蟲卵囊和賈第鞭毛蟲孢囊回收的影響，本實驗提出了一個新的統(tǒng)計指標——損失率，即不計實驗偶然誤差及過程偏差、以理想實驗條件下的回收率100%，減去實際的回收率，得出損失率，以“兩蟲”實驗損失率表示。

在已知回收率的基礎(chǔ)上，測得各實驗處理的“兩蟲”損失率，結(jié)果見表2、表3。

表2 實驗各階段“兩蟲”實驗損失率結(jié)果

表3 實驗各階段“兩蟲”實驗損失率所占比例

由結(jié)果可知，無論是隱孢子蟲還是賈第鞭毛蟲，實驗損失率均集中在抽濾、洗脫、離心階段，其中洗脫階段最高，分別為30.7%、24.7%，其次是離心階段，分別為23.0%、22.3%，然后是抽濾階段，分別為17.0%、14.0%，所占比例見圖1。

分析得出，實驗各處理階段對飲用水中“兩蟲”回收率的影響各不相同，其中洗脫處理階段的影響最大所占比例最高。損失率主要集中在洗脫、離心、抽濾階段。具體來講，隱孢子蟲在各處理階段的損失率依次為：30.7%（洗脫淘洗）；23.0%（離心濃縮）；17.0%（定量抽濾）；4.3%（免疫磁分離）；3.3%（染色鏡檢）。賈第鞭毛蟲的損失率依次為：24.7%（洗脫淘洗）；22.3%（離心濃縮）；14.0%（定量抽濾）；3.0%（免疫磁分離）；2.3%（染色鏡檢）。

3 討論

結(jié)果表明，在實驗室檢測“兩蟲”時，為了提高實驗質(zhì)量和檢測結(jié)果可信度，必須優(yōu)化前處理過程，嚴格把控洗脫、離心、抽濾3個前處理階段的質(zhì)量。洗脫階段的損失率最高，表明大部分的隱孢子蟲孢囊和賈第鞭毛蟲卵囊洗脫環(huán)節(jié)被遺漏或者未被洗脫出來，洗脫階段將是至關(guān)重要的一環(huán)。這就要求在洗脫液的配制、振蕩頻率的設(shè)置、振蕩時間的控制、振蕩方式的優(yōu)化等方面做深入研究，如超聲波洗脫。離心階段的損失，主要在轉(zhuǎn)移過程，一般實驗室常用的轉(zhuǎn)移手段是虹吸法，操作不當輕則攪動“兩蟲”沉淀物，重則將沉淀物吸出，對檢測結(jié)果及質(zhì)量有很大影響，可以在離心時間、離心動力、離心管的設(shè)計及超細虹吸設(shè)備等做深入研究。抽濾階段的損失率主要原因涉及抽濾量、抽濾速率、抽濾方式的不同等，可以在改變抽濾量、優(yōu)化抽濾速率等方面作有益嘗試，從而降低“兩蟲”檢測損失率，提高實驗質(zhì)量。