楊旭瓊，楊金易，王 弘

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量與安全重點實驗室，廣州 510642)

近年來，隨著畜牧業(yè)的發(fā)展動物疫病也逐漸增加，一些嚴(yán)重危害動物健康的疫病接連大批、大范圍暴發(fā)，動物發(fā)病率和死亡率較高，嚴(yán)重影響畜牧業(yè)的發(fā)展，并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。盡管新疫苗的開發(fā)和生物安全措施的實施對動物疫病的防控有一定的幫助，但動物疫病仍對動物衛(wèi)生健康、動物源性食品安全、國民經(jīng)濟(jì)和環(huán)境構(gòu)成嚴(yán)重威脅。病毒性疫病的增加使得動物疫病更加復(fù)雜，流行趨勢更加嚴(yán)峻。根據(jù)世界動物衛(wèi)生組織(OIE)發(fā)布的一份關(guān)于全球非洲豬瘟(African swine fever，ASF)形勢的報告可看出：自2016年以來，全球范圍內(nèi)的ASF疫情明顯增加；非洲、亞洲、歐洲是ASF主要暴發(fā)區(qū)，在2016-2020年造成全球生豬損失高達(dá)800多萬頭，特別是亞洲生豬損失比例最大，占全球報告損失總數(shù)的82%[1]。中國自2018年8月首次暴發(fā)高毒性ASF以來，疫情在全國范圍內(nèi)快速蔓延，僅5個月的時間因ASF造成生豬損失數(shù)目高達(dá)90多萬頭[2]。由于中國是世界上最大的豬肉生產(chǎn)國和消費國，豬肉產(chǎn)量約占全球供應(yīng)量的53%，一旦大規(guī)模的ASF疫情暴發(fā)將對全球豬肉食品體系如飼料、生豬、豬肉產(chǎn)品的供應(yīng)和價格等方面產(chǎn)生巨大影響[3]。目前，ASF在亞洲和歐洲一些國家尚未得到有效控制，對全球養(yǎng)豬業(yè)依然構(gòu)成嚴(yán)重威脅。由于目前還沒有商業(yè)化的非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)疫苗，中國的ASF防控策略在很大程度上依賴于嚴(yán)格的生物安全體系，與此同時，開發(fā)安全有效的動物疫苗將有助于控制和根除野豬和家豬的ASF[4]。但在有效疫苗或抗病毒治療藥物未成功研制出的情況下，動物疫病診斷技術(shù)的建立則是一種很好的防控措施。

傳統(tǒng)的動物疫病病原體分離培養(yǎng)方法費時費力，一般需幾天或十幾天的時間才能得知檢測結(jié)果，不利于疫病防控工作的開展，難以滿足對突發(fā)疫情防控的要求，且需集中的實驗室、大型設(shè)備和經(jīng)驗豐富的操作人員[5]。基于免疫血清學(xué)方法的病原體檢測相對簡便快速，但存在檢測窗口期，不能及時做出早期診斷，且需特異性和高親和力抗體，不易得到有效結(jié)果[6]。自PCR技術(shù)發(fā)明以來，其很快成為學(xué)術(shù)研究和臨床診斷的熱點技術(shù)，同時給病原體的診斷檢測帶來了革命性的變化[7]。第一代PCR技術(shù)應(yīng)用成熟，第二代實時熒光定量PCR及第三代數(shù)字PCR技術(shù)相繼實現(xiàn)了病原體核酸檢測的相對定量和絕對定量[8]。不依賴于熱循環(huán)設(shè)備的核酸等溫擴(kuò)增技術(shù)的出現(xiàn)及引入微機(jī)電系統(tǒng)(micro-electro-mechanical systems，MEMS)的微流控芯片加工平臺突飛猛進(jìn)的發(fā)展助力病原體核酸檢測進(jìn)入了一個新階段，實現(xiàn)動物疫病全自動即時檢驗(point-of-care test，POCT)分子診斷“樣本進(jìn)，結(jié)果出”的現(xiàn)場快速檢測[9-10]。隨著動物疫病診斷技術(shù)的不斷優(yōu)化革新(圖1)，發(fā)展快速、靈敏、特異、高效可實施的診斷檢測技術(shù)在當(dāng)下顯得尤為迫切，學(xué)科間相互滲透融合的高通量診斷技術(shù)則成為眾多研究者關(guān)注的熱點。有效的動物疫病診斷檢測可及時預(yù)防和控制常見動物疫病的傳播，從而保護(hù)動物及人類的健康和安全。筆者就主要的病毒性動物疫病診斷技術(shù)及其研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為動物疫病快速診斷提供更多的方案思路，提升動物疫病的防控能力。

圖1 診斷檢測技術(shù)的發(fā)展歷程Fig.1 Development process of detection technology

1 病原學(xué)診斷

病原學(xué)診斷主要用于傳染病的診斷，指從病料中分離病毒、細(xì)菌和寄生蟲等病原體。病毒性疫病如口蹄疫、非洲豬瘟、高致病性禽流感等重大動物疫病對人畜危害嚴(yán)重，需采取緊急、嚴(yán)厲的強(qiáng)制預(yù)防、控制和撲滅措施。自19世紀(jì)末人類發(fā)現(xiàn)病毒以來，科學(xué)家們一直在努力闡明病毒結(jié)構(gòu)，電鏡技術(shù)的發(fā)展為其提供了便利。透射電鏡是檢測和分析病毒復(fù)制的重要工具，具有高分辨力和全面捕獲表征病毒結(jié)構(gòu)的特點，用于常規(guī)檢測及初始篩查診斷，通過鑒定不同種屬的病毒，對后續(xù)檢測方法的選擇做出判斷[11]。在20世紀(jì)60年代，透射電鏡的使用促成了多種新型病毒的發(fā)現(xiàn)，并作為診斷工具用于臨床樣本或從細(xì)胞中培養(yǎng)分離后病毒的表征[12]。通常，負(fù)染電鏡法檢測所需病毒粒子含量相對較高，臨床樣本一般達(dá)不到檢測要求，且難以鑒別較小的、無明顯形態(tài)特征的病毒；離子捕獲電鏡法則可濃縮和純化病毒粒子，提高病毒粒子含量，敏感性相對較高；免疫電鏡法基于免疫血清學(xué)原理，無需純化抗體，可直接用于常規(guī)電鏡診斷后進(jìn)一步病毒鑒定[11,13]。在病毒的分離培養(yǎng)過程中需排除無致病性病原體的干擾，在細(xì)胞無病變的情況下很難確定是否感染病毒，且不同毒株對細(xì)胞的適應(yīng)性存在差異，一些病毒不能在細(xì)胞系中快速增殖，易受到病毒滴度的影響而導(dǎo)致試驗周期過長[14]。鑒于某些病毒分離培養(yǎng)較難，同時受實驗設(shè)備的限制且需要專業(yè)的高技能人員，使得常規(guī)病原學(xué)診斷難以大范圍推廣應(yīng)用。盡管如此，病原學(xué)常規(guī)檢測方法如目標(biāo)菌種的分離培養(yǎng)、涂片染色鏡檢等在動物疫病相關(guān)研究和生產(chǎn)預(yù)防中依然被合理的應(yīng)用，且發(fā)揮著重要作用。

2 免疫血清學(xué)診斷

動物疫病診斷主要針對病原體的抗原、病原體誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體及病原體的遺傳物質(zhì)進(jìn)行檢測和鑒別。標(biāo)記免疫作為一類典型的免疫血清學(xué)診斷技術(shù)，基于抗原抗體特異性識別免疫反應(yīng)，結(jié)合信號放大標(biāo)記物來捕獲樣本中存在的抗原或抗體。根據(jù)標(biāo)記物的不同可分為放射免疫(radio immunoassay，RIA)、酶免疫、熒光免疫等，相比非標(biāo)記免疫技術(shù)如凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、補(bǔ)體結(jié)合試驗、中和試驗等，標(biāo)記免疫技術(shù)靈敏度整體較高。其中，RIA依據(jù)放射性核素信號可進(jìn)行超微量分析，且放射性同位素種類多，選擇性較廣[15]。但放射性標(biāo)記物不穩(wěn)定，對人體健康及環(huán)境存在一定的損害污染風(fēng)險，在實施中需做好防護(hù)措施。此外，用于RIA檢測樣本的分離方法落后，難以實現(xiàn)操作和檢測的自動化，因此，對于動物疫病診斷檢測更偏向選擇非放射標(biāo)記免疫技術(shù)。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗

酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)因酶標(biāo)記物的高頻率催化效應(yīng)，使得ELISA具有較高的敏感度，通過優(yōu)化檢測參數(shù)、增加信號強(qiáng)度等可進(jìn)一步提高ELISA的靈敏性和特異性[16]。ELISA能一次性進(jìn)行大量樣本的檢測，且操作簡單，可對畜群進(jìn)行普檢。ELISA憑借其經(jīng)濟(jì)、快速的檢測優(yōu)點，現(xiàn)已成為動物疫病抗體檢測試劑盒研發(fā)的首選。根據(jù)ELISA微量板底部包被材料的不同可分為直接法、間接法、夾心法及阻斷法等。

間接ELISA法即利用固相載體包被抗原，結(jié)合比色法和分光光度法測定樣品中特異性抗體的含量。易華山等[17]以藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)的NS4蛋白作為包被抗原建立了BTV抗體間接ELISA方法，檢測敏感性可達(dá)1∶1 600；批內(nèi)和批間重復(fù)性變異系數(shù)均<10%；檢測76份重慶地區(qū)牛群血清樣品，陽性符合率為98%，陰性符合率為100%。傳統(tǒng)的ELISA一般采用單一辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶作為反應(yīng)標(biāo)記物，對于某些診斷而言有可能達(dá)不到檢測需求。為進(jìn)一步提高靈敏度，Wu等[18]利用二氧化硅納米微球負(fù)載辣根過氧化物酶進(jìn)行信號放大，對傳統(tǒng)的ELISA方法進(jìn)行了改進(jìn)，并將其用于豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)抗體的檢測，該方法表現(xiàn)出極高的檢測靈敏度，檢測限可達(dá)0.05 ng/mL。ELISA具有一次性檢測大量樣本的優(yōu)點，這對不同養(yǎng)殖場疫病感染情況的普檢及陰陽性血清樣本數(shù)據(jù)的獲取非常有利。Lin等[19]針對不同豬場的368份血清樣品以間接免疫熒光試驗(indirect immunofluorescence assay，IFA)作對比檢測，采用間接ELISA檢測出了213份豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)陽性，IFA檢測出了206份PEDV陽性，ELISA檢測方法總符合率為96.74%，證明了建立的間接ELISA方法具有良好的診斷敏感性和特異性。Houston等[20]利用ELISA和IFA檢測方法建立了豬群中A型塞內(nèi)卡病毒病流行率基線數(shù)據(jù)，對不同商品豬場的2 433份母豬血清樣本進(jìn)行了A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A，SVA)抗體檢測，結(jié)果顯示，2種方法的陽性檢測率分別是26.2%和15.9%，ELISA檢測方法明顯優(yōu)于IFA。盡管不同的ELISA方法被廣泛用于病毒性動物疫病檢測，但這些檢測方法是基于特異性單克隆抗體或多克隆抗體，而這2種抗體制備過程較為繁瑣且存在一定的局限性，表達(dá)率低、穩(wěn)定性差，且需更多的支持成本。 納米抗體以其分子質(zhì)量小(約15 ku)、高親和力、高穩(wěn)定性、高溶解度、高表達(dá)、易于進(jìn)化等獨特的優(yōu)勢廣泛應(yīng)用于動物疫病診斷和治療領(lǐng)域。Ma等[21]建立了一種新的快速、特異、低成本的基于體外生物素化納米抗體(biotin ligase nanobody，BiNb)的阻斷ELISA檢測方法(圖2)，可快速檢測豬臨床血清中抗PEDV抗體；通過檢測臨床血清樣本發(fā)現(xiàn)，該方法與常規(guī)商業(yè)化ELISA試劑盒相比，其檢測敏感性和特異性分別為100%和93.18%，兩者的符合率達(dá)94%。該研究表明,基于納米抗體建立的阻斷ELISA是一種快速、低成本、可靠的檢測方法，不僅可用于臨床病毒抗體的檢測，也可用于疫苗效力的血清學(xué)評估及病毒感染的間接診斷。

圖2 阻斷ELISA技術(shù)檢測抗PEDV抗體Fig.2 Detection of anti-PEDV antibodies by blocking ELISA technology

盡管基于抗原抗體特異性識別的ELISA檢測方法在病毒性動物疫病檢測中很流行，適用性較廣，但獲取特異性和高親和力抗體是高靈敏度、高特異性檢測方法建立的重要條件，特別是針對復(fù)雜病原體感染的情況下，有效抗體的制備顯得尤為關(guān)鍵。

2.2 化學(xué)發(fā)光免疫分析

化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immu-noassay，CLIA)以光信號強(qiáng)度指示標(biāo)記抗體或抗原，是標(biāo)準(zhǔn)ELISA的全自動變體，包含免疫反應(yīng)系統(tǒng)和化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)，根據(jù)標(biāo)記方法的不同有化學(xué)發(fā)光標(biāo)記免疫分析法和化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析法(electro-chemiluminescence immunoassay，ECLI)結(jié)合了化學(xué)發(fā)光，是一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，與CLIA相比其更易精確控制，靈活性較高。這2種技術(shù)具有背景熒光信號值低、線性范圍寬等優(yōu)勢，在靈敏度、精確度和檢測效率上明顯優(yōu)于ELISA方法，是推廣最快的標(biāo)記免疫分析技術(shù)之一，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于免疫分析等各個領(lǐng)域[22]。CLIA雖然有較強(qiáng)的特異性，但光信號持續(xù)時間短、光源穩(wěn)定性差，致使其靈敏度不高。任雪建等[23]建立了一種小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus,PPRV)抗體化學(xué)發(fā)光酶免疫分析檢測方法，用魯米諾作為發(fā)光底物代替?zhèn)鹘y(tǒng)的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物，避免了光源不穩(wěn)定的干擾，從而提高了CLIA檢測敏感性和穩(wěn)定性。Liu等[24]針對口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)抗原表位3A和3B全長蛋白建立了一種新的CLIA抗體檢測方法，具有較高的診斷靈敏度和特異性，檢測接種了5次的免疫牛產(chǎn)生的假陽性率為0，檢測接種15次的免疫牛產(chǎn)生的假陽性率低于6%，可高精度檢測FMDV。該方法的建立有效解決了基于FMDV蛋白3ABC檢測的商業(yè)化ELISA試劑盒或其他ELISA方法因非結(jié)構(gòu)蛋白對滅活疫苗污染而導(dǎo)致較高假陽性率的問題。

近年來，一些納米材料的興起促進(jìn)了ECLI的快速發(fā)展，如金納米粒子、二氧化硅納米粒子、碳納米管、量子點及復(fù)合納米結(jié)構(gòu)等，在化學(xué)發(fā)光檢測方法構(gòu)建中作為信號標(biāo)簽被廣泛應(yīng)用[25]?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析方法構(gòu)建過程中選擇合適的信號標(biāo)簽是實現(xiàn)高靈敏度和高穩(wěn)定性的關(guān)鍵，當(dāng)前針對ECLI信號標(biāo)簽放大策略的研究主要集中在增強(qiáng)基于酶的納米材料方面[26]。邵康[27]以金-石墨烯納米復(fù)合材料、二氧化硅納米粒子和生物素/鏈霉親和素構(gòu)建了三重和多重信號放大檢測豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)抗體的ECLI傳感器，與ELISA和熒光免疫分析方法相比，其最低檢測限可達(dá)0.40 pg/mL，靈敏度更高，檢測線性范圍更寬，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性更好。Ma等[28]提出了一種新的多路徑信號放大策略，利用金納米粒子修飾石墨烯納米片作為底物，構(gòu)建了簡單、靈敏的PEDV抗體定量分析ECLI平臺，最低檢測限可達(dá)0.05 pg/mL；這種新檢測方法的開發(fā)彌補(bǔ)了一些檢測技術(shù)在復(fù)雜儀器的使用、操作繁瑣和耗時費力等方面的局限性，在動物疫病抗體檢測中表現(xiàn)出良好的適用性。

3 分子生物學(xué)診斷

3.1 基于PCR的檢測技術(shù)

自1985年P(guān)CR技術(shù)發(fā)明以來，它已成為科學(xué)研究、臨床和法醫(yī)學(xué)研究中不可缺少的一項基礎(chǔ)分子生物技術(shù)[7]。PCR技術(shù)的多功能性和快速性使分子診斷學(xué)的研究發(fā)生了革命性的變化，其以特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用于病原檢測、食品微生物檢測、疾病診斷等領(lǐng)域，是病原診斷檢測的金標(biāo)準(zhǔn)[29]。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展和檢測需求的多樣性，基于普通PCR的各種衍生技術(shù)應(yīng)運而生。PCR技術(shù)不僅僅局限于對靶基因進(jìn)行體外無限擴(kuò)增，而是由定性檢測轉(zhuǎn)向了定量檢測。

實時熒光定量PCR技術(shù)同時具備PCR的高靈敏度和DNA分子雜交的高特異性以及光譜技術(shù)的高精確度相對定量等優(yōu)點，相比普通PCR技術(shù)，實時熒光定量PCR在病毒性動物疫病檢測方面應(yīng)用較廣泛。借助熒光信號對PCR進(jìn)程進(jìn)行實時監(jiān)測是檢測和鑒別致病性病毒的一種強(qiáng)有力的方法[30]。Chen等[31]基于SYBR染料法針對PCV3高度保守區(qū)建立了實時熒光定量PCR檢測方法，其檢測拷貝數(shù)為1.73×102拷貝/μL，與普通PCR相比，陽性檢出率高出4倍，能對PCV3做出有效診斷及流行病學(xué)調(diào)查。在實際生產(chǎn)中多病原的多重感染或混合感染已是疾病發(fā)生的普遍規(guī)律，畜群發(fā)病常常不是由某單一的病原體引起，而是多種病原體共同感染作用的結(jié)果。如引起豬腸道疾病的病毒種類眾多，臨床癥狀相似。多重PCR技術(shù)檢測效率高、特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點是此類病毒確診的首選手段。Huang等[32]建立了一種基于TaqMan探針的多重RT-實時熒光定量PCR(reverse transcription-qPCR，RT-qPCR)方法診斷流行性豬腸道冠狀病毒，彌補(bǔ)了此前沒有可同時檢測和鑒別4種豬腸道冠狀病毒的技術(shù)空缺，對豬病毒性腹瀉的預(yù)防控制和流行病學(xué)調(diào)查具有重要意義。但實時熒光定量PCR的結(jié)果依賴于閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)和校準(zhǔn)物，受樣品中抑制劑影響較大，且其無法解決不同反應(yīng)間的競爭性抑制。由于反應(yīng)體系內(nèi)熒光背景較高，導(dǎo)致無法準(zhǔn)確檢測低豐度樣品，這在一定程度上制約了其使用。

數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)作為第三代PCR技術(shù)能實現(xiàn)低豐度DNA絕對定量分析，只對一個靶分子擴(kuò)增，消除競爭性抑制，檢測結(jié)果判定不依賴閾值所需的Ct值，不受擴(kuò)增效率影響，且無需使用校準(zhǔn)曲線，可檢測復(fù)雜樣品中的微量核酸[8](圖3)。尤其在缺乏合適參考物或校準(zhǔn)物的情況下，數(shù)字PCR這一優(yōu)勢顯得愈發(fā)明顯，但當(dāng)分析物中模板的濃度極低時，會因不同分區(qū)反應(yīng)體系中模板的隨機(jī)化分布差異而引起其精確性降低[33]。數(shù)字PCR最初多應(yīng)用于腫瘤液體活檢的相關(guān)研究，現(xiàn)已在病毒性動物疫病檢測方面得到成功應(yīng)用。實時熒光定量PCR的多重檢測依賴于熒光通道數(shù)量或熔解曲線，數(shù)字PCR則提供了與實時熒光定量PCR不一樣的多重檢測策略，即根據(jù)熒光通道數(shù)量和微單元熒光信號強(qiáng)度差異來檢測多個指標(biāo)。Ren等[34]針對PRV建立了一種快速檢測PRV野生型分離毒株和基因缺失病毒疫苗株的數(shù)字PCR方法，研究發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR與TaqMan實時熒光定量PCR定量檢測病毒樣本均具有良好的線性和重復(fù)性，但數(shù)字PCR能在低濃度下仍符合線性區(qū)域，檢測限為4.75拷貝/μL，且靈敏度較實時熒光定量PCR高16倍，數(shù)字PCR在臨床血清樣本分析中更為靈敏。Yang等[35]基于豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)的ORF7區(qū)建立了數(shù)字PCR方法，與實時熒光定量PCR方法相比，2種方法均顯示出高度的線性相關(guān)性(R2≈1)和定量相關(guān)性，但數(shù)字PCR比實時熒光定量PCR敏感10倍左右，對125份疑似感染PRRSV的臨床樣本檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，數(shù)字PCR方法比實時熒光定量PCR多檢測出了9份陽性樣本。以上研究表明，數(shù)字PCR技術(shù)具有更高的靈敏度和更低的檢測限，可用于超敏定量檢測，有利于疫病的監(jiān)測與防控，尤其在新型冠狀病毒的診斷檢測方面顯示出潛在的應(yīng)用價值和前景。

圖3 數(shù)字PCR的原理示意圖Fig.3 Schematic diagram of digital PCR

3.2 環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)

2000年日本科學(xué)家Notomi等[36]發(fā)明了環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)(loop mediated isothermal amplification，LAMP)，其是一種新型的體外等溫擴(kuò)增特異性核酸片段的技術(shù)?；赑CR的核酸檢測體系預(yù)混物均需在不同溫度之間重復(fù)循環(huán)才能完成有效擴(kuò)增，受檢測設(shè)備的限制，較難推廣運用到現(xiàn)場檢測。LAMP技術(shù)可克服這一缺陷，其不需要熱循環(huán)以及繁瑣的凝膠電泳程序，即可在60～65 ℃等溫條件下延伸，完成高質(zhì)量鏈置換擴(kuò)增，達(dá)到診斷目的，而且具有結(jié)果可視化、操作簡單、不受樣品中非靶標(biāo)DNA的影響、易于適應(yīng)任何現(xiàn)場環(huán)境等優(yōu)勢，最短可10 min完成檢測，擴(kuò)增長度為700～10 000 bp，其是理想的POCT分子生物學(xué)檢測方法[37-39]。Wang等[40]建立了適用于現(xiàn)場檢測ASFV的實時LAMP和可視化LAMP檢測方法，結(jié)果表明構(gòu)建的2種LAMP方法能準(zhǔn)確、特異地檢測ASFV，檢出限為30拷貝/μL，為ASF的防控和監(jiān)測提供了有效可實施的方案。常規(guī)的用于檢測FMDV的LAMP方法存在一定的局限性，包括無法進(jìn)行信號放大、不能對所有的FMDV的7種血清型進(jìn)行檢測等。針對上述局限性，Bath等[41]取消了樣品稀釋步驟以簡化試驗設(shè)置，設(shè)計了內(nèi)部陽性對照降低假陰性率，進(jìn)而建立了一種新的泛血清型反轉(zhuǎn)錄LAMP方法用于現(xiàn)場檢測FMDV；同時該研究利用未提取核酸的現(xiàn)場口腔拭子樣本來驗證LAMP的現(xiàn)場使用性能，結(jié)果顯示新建立的反轉(zhuǎn)錄LAMP方法可作為群體診斷工具，其檢測診斷特異性達(dá)99%，檢測靈敏度為79%，該方法能由未經(jīng)實驗室培訓(xùn)的工作人員直接用于疑似病例的即時現(xiàn)場檢測。雖然LAMP非常適用于現(xiàn)場快速檢測，較其他核酸擴(kuò)增技術(shù)具有顯著的優(yōu)勢，但LAMP技術(shù)需要針對單個核酸片段的幾個區(qū)域設(shè)計4～6對引物，這種引物設(shè)計較為復(fù)雜，同時也增加了非特異性擴(kuò)增的可能性，會對檢測結(jié)果的特異性產(chǎn)生影響；此外，該技術(shù)較難實現(xiàn)多路復(fù)用，且擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳后會出現(xiàn)連續(xù)的幾個條帶，很難定位檢測每個條帶，因此其結(jié)果可靠性還有待提高[42]。針對LAMP多路復(fù)用開發(fā)，建議采用微流控芯片技術(shù)的便攜式生物分析系統(tǒng)，將LAMP與離心式微流控技術(shù)相結(jié)合，可對多項指標(biāo)同時進(jìn)行檢測分析，能有效解決LAMP技術(shù)多路復(fù)用的問題。

4 高通量診斷

基于免疫血清學(xué)或分子生物學(xué)的診斷技術(shù)可簡單、快速識別病原體。然而，大多數(shù)的檢測方法一次只能檢測到一個或幾個病原體，且冗長的試驗流程、專業(yè)的設(shè)備降低了檢測技術(shù)立即干預(yù)突發(fā)疫情的能力及診斷相關(guān)性，同時無法滿足某些檢測分析需求。高通量診斷技術(shù)具有同時監(jiān)測、檢測和表征成百上千個靶點的能力，能滿足當(dāng)下快速檢測的需求，是生命科學(xué)發(fā)展過程中一種重要的生物學(xué)檢測手段。

4.1 生物芯片技術(shù)

4.1.1 固液相芯片 基因芯片也稱DNA芯片，由于該技術(shù)能將大量核苷酸探針同時固定于固相載體上，可實現(xiàn)多個病原核酸的自動化快速檢測，因此解決了傳統(tǒng)核酸印跡雜交技術(shù)操作復(fù)雜、自動化程度低、操作序列數(shù)量少、檢測效率低等問題。通過設(shè)計不同的探針陣列，使用特定的分析方法可使該技術(shù)具有多種不同的應(yīng)用價值，如分析病毒基因組變化、分離毒株差異性、病毒溯源等，在畜禽疫病診斷檢測中的應(yīng)用已較成熟。特別地，針對畜禽生產(chǎn)具有重大威脅的人畜共患病的檢測顯示出明顯優(yōu)勢。由不同病原誘發(fā)的豬腹瀉在臨床癥狀及病理變化方面非常相似，常規(guī)的檢測方法難以鑒定出正確的誘發(fā)病原體，基因芯片技術(shù)則能夠?qū)⒁鹱胸i發(fā)生腹瀉癥狀的幾種病毒進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，可針對病毒的混合感染做出有效診斷。與基因芯片不同的是，蛋白芯片由固相載體上的抗原、抗體及標(biāo)志蛋白微陣列化組成，通過Cy3、Cy5、化學(xué)發(fā)光物、免疫膠體金等標(biāo)記物放大抗原抗體反應(yīng)，具有高通量、高靈敏度、高特異性等特點。Wu等[43]使用環(huán)氧涂層玻璃載玻片作為診斷材料，建立了2種可視化蛋白質(zhì)芯片檢測方法用于血清中豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)抗體的檢測。對于常規(guī)ELISA方法而言，待檢樣本通常需要含有200～1 000 ng抗原蛋白，而蛋白芯片僅需0.5～2 ng抗原蛋白，2種方法的最低檢測限分別為6 000倍稀釋和12 800倍稀釋[43]。這說明蛋白質(zhì)芯片技術(shù)是一種快速、靈敏、有效的診斷工具，在定量檢測和新標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中有著廣泛的應(yīng)用前景。值得注意的是，基因芯片技術(shù)和蛋白芯片技術(shù)均是固相載體上探針與標(biāo)記樣品的雜交反應(yīng)，從而實現(xiàn)病原體的診斷檢測。液相芯片即熒光微球免疫分析(fluorescent microsphere immunoassays，F(xiàn)MIA)則結(jié)合了激光技術(shù)、流式細(xì)胞儀、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)以不同熒光編碼的聚苯乙烯微球作為探針載體偶聯(lián)不同的檢測分子，借助流式細(xì)胞儀在液相中可以對小量單個樣本中存在的多種抗原或抗體進(jìn)行定性定量分析，不僅實現(xiàn)了高通量多重檢測，且極大地提高了樣品的利用率[44-45]。與常規(guī)免疫學(xué)或分子生物學(xué)檢測技術(shù)相比，F(xiàn)MIA可在同一反應(yīng)孔中實現(xiàn)多達(dá)100種不同的生物學(xué)反應(yīng)，能夠檢測體系含量少至1 μL的待測樣本，適用于小量稀有樣品分析?；谝合喾磻?yīng)動力學(xué)，其可快速簡便地完成檢測，得到特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的檢測結(jié)果。Feichtner等[46]建立了首個用于檢測禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)的多路復(fù)用FMIA血清學(xué)診斷檢測方法，該方法涵蓋了所有FAdV臨床相關(guān)血清型，可在單一反應(yīng)中同時檢測和分化相應(yīng)的抗體，具有高通量篩選的優(yōu)勢。 液相芯片技術(shù)作為一項新型的檢測工具，廣泛應(yīng)用于禽類、哺乳動物中，能同時檢測和分析致病性病毒、細(xì)菌、寄生蟲和真菌及抗原或抗體[45]。

4.1.2 微流控芯片 微流控芯片利用單個微米級通道芯片容納微量流體來實現(xiàn)微小型生化實驗室，集待檢樣品的制備、基因擴(kuò)增、核酸標(biāo)記及檢測等相關(guān)步驟為一體的微流控芯片技術(shù)是一種便攜式生物分析系統(tǒng)，可形象地稱之為“微縮芯片實驗室”。該技術(shù)屬于多學(xué)科交叉技術(shù)，其與毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜檢測、免疫檢測、電化學(xué)檢測及光學(xué)檢測的結(jié)合在動物疫病診斷中被靈活應(yīng)用，實現(xiàn)了單芯片高通量、自動化、無污染、高靈敏度診斷檢測[37]。因其系統(tǒng)集成、低樣品消耗，可利用空間編碼技術(shù)在芯片上實現(xiàn)多路檢測的特點，受到了科研人員的廣泛關(guān)注。其中，三維納米結(jié)構(gòu)和生物傳感器的發(fā)展為微流控技術(shù)的應(yīng)用提供了諸多便利，Yu等[47]研制了一種新型的氧化鋅納米棒集成微流控芯片，其能在免疫功能化的氧化鋅納米棒表面捕獲禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)，并通過多重夾心免疫分析進(jìn)一步檢測病原體，整個檢測過程可在1.5 h內(nèi)完成，檢測下限為3.6×103EID50/mL，檢測靈敏度是常規(guī)ELISA方法的22倍。該平臺通過在同一氧化鋅納米棒集成微芯片上對不同抗體進(jìn)行空間編碼，展示了可同時檢測多種病毒病原體的能力。據(jù)報道，LAMP的原理及多路復(fù)用反應(yīng)機(jī)制略微復(fù)雜[48]，但鑒于LAMP顯著的優(yōu)勢特性，其在其他技術(shù)方面的應(yīng)用值得研究人員進(jìn)一步探索。不論是基于PCR的檢測技術(shù)還是LAMP技術(shù)均離不開核酸提取、基因擴(kuò)增、產(chǎn)物分析等多個步驟，而微流控芯片與LAMP技術(shù)的結(jié)合能簡化與集成這些繁瑣步驟，成為應(yīng)用于現(xiàn)場快速檢測的關(guān)鍵技術(shù)[10]。Ye等[49]建立了一種便攜式離心微流控芯片熒光探針介導(dǎo)的LAMP檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用BstDNA聚合酶和DNase Ⅰ進(jìn)行特異性擴(kuò)增和熒光信號釋放；同時，該研究采用微注射成型技術(shù)制備微流控芯片，這種新穎的設(shè)計保證了高特異性信號的產(chǎn)生和高靈敏度的熒光檢測，可克服其他擴(kuò)增方法的缺點，具有檢測設(shè)備小、簡單、吞吐量高、便于現(xiàn)場使用等優(yōu)點；檢測限低至10拷貝/μL，靈敏度為92.73%。這表明，該技術(shù)能快速、準(zhǔn)確地檢測病原體，LAMP技術(shù)和微流控芯片的結(jié)合在多路復(fù)用和高通量篩查方面具有良好的應(yīng)用前景。

4.2 新型生物傳感器

生物傳感器分析系統(tǒng)由生物識別分子和物理化學(xué)探測器組成，具有接收器與轉(zhuǎn)換器的功能，其通過抗體、核酸、多糖、凝集素、酶、組織、全細(xì)胞等固定化傳感元件來識別病原體所特有的靶生物標(biāo)記物，通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)將生物分子間的相互作用轉(zhuǎn)化為可測量的顯示信號(圖4)。Narang等[50]研究表明，基于微流控芯片技術(shù)的新型生物傳感器可快速檢測病原體，且能準(zhǔn)確分析檢測結(jié)果并即時生成檢測報告。這種特定生物識別傳感系統(tǒng)與微流控芯片結(jié)合，能實現(xiàn)對病原體陣列化、高通量、定性及定量分析[5]。 隨著納米技術(shù)、電子信息技術(shù)的快速發(fā)展，基于化學(xué)發(fā)光、表面等離子體共振、電化學(xué)等新型生物傳感器在病原體快速、高靈敏度診斷檢測中被廣泛應(yīng)用[51-52]。 Luo等[53]利用包覆金納米微球的傾斜光柵制備了一種檢測新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)的無標(biāo)記免疫傳感器，病毒最小可檢測量約為5 pg，該系統(tǒng)通過金納米微球局域表面等離子體共振效應(yīng)大大增強(qiáng)了分析物對光纖包層模式的影響，從而提高了免疫傳感器的檢測限和靈敏度。由于臨床樣本復(fù)雜的基質(zhì)特性，目前大多數(shù)生物傳感器診斷多用于實驗室研究，但相信未來基于納米材料能提升生物傳感器光學(xué)和電化學(xué)的功能，將會開發(fā)更多可供獸醫(yī)或疫病防控機(jī)構(gòu)現(xiàn)場使用的便攜式、小型化和多目標(biāo)智能化的生物傳感器設(shè)備。值得注意的是，大多數(shù)生物傳感器對環(huán)境因素的變化高度敏感，如溫度、pH等[54]?？偟膩碚f，生物傳感器檢測動物疫病病原體，開發(fā)幾種新的方法來克服樣本基質(zhì)效應(yīng)是非常有必要的，在檢測適用性上仍有提高的空間，需科研工作者在這個領(lǐng)域進(jìn)行更多的研究。

圖4 生物傳感器原理示意圖Fig.4 Schematic diagram of biosensor

4.3 下一代測序技術(shù)

一般而言，未知病毒的發(fā)現(xiàn)和檢測往往受到細(xì)胞培養(yǎng)過程中病毒對細(xì)胞侵染能力的限制，下一代測序(next-generation sequencing，NGS)技術(shù)的出現(xiàn)及其與生物信息學(xué)的結(jié)合為新病原的發(fā)現(xiàn)、溯源與傳播機(jī)制、毒力、藥物敏感性等研究開辟了另一條途徑[55]。NGS在2014年被引入疫病診斷，適用于動物疫病流行病學(xué)調(diào)查和高抗性微生物的基因分型，為傳染性疫病診斷帶來了革命性的變化[56]。NGS不僅是用于物種轉(zhuǎn)錄組和基因組全貌解析的強(qiáng)有力工具，且是當(dāng)前用于發(fā)現(xiàn)未知病原體吞吐量最大的診斷工具。與傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)Sanger測序技術(shù)相比，NGS技術(shù)以更低的成本提供了更多的測序讀數(shù)，可同時對DNA或RNA樣本數(shù)百萬個堿基進(jìn)行快速測序，超深度覆蓋病毒基因組，實現(xiàn)樣本檢測多路復(fù)用[56]。NGS技術(shù)檢測流程主要有3個環(huán)節(jié)：模板制備，通過離心、過濾、捕捉等物理方法對病毒粒子進(jìn)行富集；樣品文庫制備，包括克隆擴(kuò)增；數(shù)據(jù)分析，通過對測序的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控和過濾后，去除宿主的基因序列，鑒定病毒的組成與豐度，拼接病毒序列，最后構(gòu)建分子進(jìn)化樹進(jìn)行分析比對[57]。NGS技術(shù)能靈敏、特異地檢測和區(qū)分單個宿主內(nèi)的混合感染及鑒定變異毒株。秦毅斌等[58]應(yīng)用NGS技術(shù)對PEDV分離毒株的全基因組序列進(jìn)行測序，證明了分離獲得的新毒株是PEDV地方流行性變異毒株，該發(fā)現(xiàn)為PEDV新型高效疫苗的研發(fā)提供了候選毒株。He等[59]基于NGS平臺對Ⅵ型NDV特性進(jìn)行研究，揭示了該病毒未知的遺傳多樣性，并提供了其持續(xù)進(jìn)化的證據(jù)。NGS技術(shù)可一次性獲取臨床樣本中病毒核酸序列，通過序列比對獲得樣本中病毒的序列信息，有利于未知病毒的發(fā)現(xiàn)。2019年，Wu等[60]利用NGS技術(shù)首次公布了新型冠狀病毒全基因組序列，為后續(xù)相關(guān)研究的順利展開提供了強(qiáng)有利的先決條件。由于NGS流程復(fù)雜，數(shù)據(jù)量大，大多數(shù)針對病毒診斷的NGS平臺都將重點放在提高序列讀取和數(shù)據(jù)分析上，且需要生物信息學(xué)專業(yè)人員對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，一般需要2～3 d，所以NGS目前僅在科研機(jī)構(gòu)應(yīng)用廣泛。盡管NGS技術(shù)能獲取大量測序數(shù)據(jù)，但根據(jù)平臺和應(yīng)用不同，約有0.1%～15%的高錯誤率，這往往會阻礙罕見突變的檢測[61]。為了糾正這種關(guān)鍵性錯誤，已開發(fā)了用于變體調(diào)用的生物信息學(xué)工具，以研究病毒變體及測量2個相似病毒準(zhǔn)種之間的遺傳距離[62]。隨著測序技術(shù)的發(fā)展，其在新發(fā)病原的鑒定和流行病學(xué)研究中發(fā)揮非常關(guān)鍵的作用，但去宿主基因、測序靈敏度和覆蓋度、標(biāo)準(zhǔn)化分析等還需完善。此外，該技術(shù)作為診斷檢測其運行成本較高，需要復(fù)雜的設(shè)備。但鑒于NGS平臺的快速準(zhǔn)確性和多能性等特點，未來NGS診斷方法很可能成為疫病診斷的常規(guī)技術(shù)。

4.4 CRISPR/Cas系統(tǒng)

盡管當(dāng)前已開發(fā)出了很多疫病診斷檢測的方法，但更快速、更廉價、更特異、更靈敏的技術(shù)仍然是動物疫病診斷檢測領(lǐng)域不斷追求的目標(biāo)。CRISPR/Cas是一種細(xì)菌和古細(xì)菌抵御噬菌體、質(zhì)粒入侵的適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，近年來隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，該系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于提高家畜繁殖效率、生產(chǎn)性能、抗病性及動物模型構(gòu)建等研究中，并創(chuàng)制了一批基因編輯牛羊育種新材料[63-64]。在疫病診斷檢測方面，CRISPR/Cas系統(tǒng)與NGS技術(shù)相比僅適用于對已知病毒的診斷檢測，但在檢測時間上其明顯優(yōu)于NGS技術(shù)，更加快速靈敏。2017年，Gootenberg等[65]建立了一種新型的病毒檢測技術(shù)SHERLOCK(specific high sensitivity enzymatic reporter unlocking，SHERLOCK)，可特異、靈敏地檢測樣本中的超微量病毒，靈敏度達(dá)到了渺摩爾水平。2018年Gootenberg等[66]對SHERLOCK診斷平臺進(jìn)行一系列優(yōu)化改進(jìn)，開發(fā)出了一種微型試紙條測試方法，可肉眼觀察檢測結(jié)果，無需使用昂貴設(shè)備，突出了其作為多路復(fù)用、便攜式、快速和定量核酸檢測平臺的潛力。通常CRISPR診斷依賴于對靶標(biāo)RNA的預(yù)擴(kuò)增，進(jìn)而通過Cas蛋白完成檢測[67]。SHERLOCK平臺中的Cas13a屬于第二大類CRISPR/Cas系統(tǒng)，其與CRISPR RNA(crRNA)靶標(biāo)配對形成核糖核蛋白復(fù)合物從而表現(xiàn)出高特異性，Cas13a附帶的切割效應(yīng)引起信號放大額外增加了檢測靈敏度[68]。Fozouni等[67]設(shè)計了一種基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的新型冠狀病毒定量檢測方法，該方法不需要靶標(biāo)RNA預(yù)擴(kuò)增，且檢測結(jié)果可通過電子移動設(shè)備直接讀出，實現(xiàn)了快速、低成本、定點篩查。 Qin等[69]建立了一種基于CRISPR/Cas13a的全溶液等溫微流控芯片診斷埃博拉病毒的自動化檢測系統(tǒng)，因檢測儀器小，并且Cas13a易于在紙上發(fā)生重組，所以非常適用于現(xiàn)場診斷檢測；現(xiàn)場檢測可在5 min內(nèi)完成，這種基于溶液的等溫診斷方法具有快速、簡單和高靈敏的特點，不需要復(fù)雜的固相萃取和純化等步驟。同樣地，基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的檢測技術(shù)在動物源疫病診斷檢測方面也有報道。 Chang等[70]利用基于CRISPR的SHERLOCK診斷系統(tǒng)，通過結(jié)合Cas13a附帶切割效應(yīng)及重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)，建立了一種能夠在37 ℃恒溫條件下進(jìn)行PRRSV可視化核酸檢測的方法。該方法具有恒溫反應(yīng)、靈敏、特異、直觀、利于現(xiàn)場操作等特點。由于SHERLOCK具有高度錯配敏感性，可檢測到一個堿基的突變，能夠?qū)π蛄懈叨韧吹牟《径局赀M(jìn)行有效區(qū)分。CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的發(fā)展為病毒的診斷檢測提供了一條新的分子途徑，具有廣闊的應(yīng)用前景。幾種動物疫病診斷技術(shù)對比情況見表1。

表1 幾種動物疫病診斷技術(shù)對比

續(xù)表

5 小結(jié)與展望

隨著畜牧業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，動物疫病對畜牧業(yè)的影響日益加大，還會嚴(yán)重危害人類健康。研究人員也在不斷開發(fā)更多能滿足當(dāng)下診斷檢測需求的快速檢測技術(shù)，不斷向自動化、精密化、多元化、高通量方向發(fā)展，病原體的鑒定不再局限于外部形態(tài)和生理特性。學(xué)科間相互滲透融合的高通量診斷技術(shù)則成為眾多研究者的關(guān)注熱點。

縱觀以上病毒性動物疫病診斷技術(shù)，各種檢測技術(shù)在病毒性疫病檢測中各有特點。常規(guī)病原學(xué)診斷方法較為費時費力，操作復(fù)雜、試驗要求性高，不利于疫病防控工作的開展，且需集中的實驗室、大型設(shè)備和經(jīng)驗豐富的操作人員，在實際應(yīng)用中制約診斷檢測的可實施性[5]。盡管免疫血清學(xué)診斷在動物疫病臨床檢測中很流行，適用性較廣，但需特異性和高親和力抗體，特別是在復(fù)雜病原體感染的情況下，不易得到有效結(jié)果。分子生物學(xué)診斷主要存在外來核酸源污染的風(fēng)險和非特異性擴(kuò)增的問題，且通常需幾個小時才能完成檢測，難以用于緊急生物識別的檢測。這些缺陷限制了它們作為常規(guī)檢測的使用。因此，發(fā)展快速、靈敏的早期診斷檢測技術(shù)對預(yù)防及控制動物疫病的傳播具有重要的社會和經(jīng)濟(jì)效益。從長遠(yuǎn)來看，多重核酸擴(kuò)增技術(shù)、微流控芯片技術(shù)、結(jié)合納米材料的生物傳感診斷技術(shù)、下一代高通量測序分析以及基于CPISPR/Cas13a系統(tǒng)的診斷技術(shù)將成為控制和預(yù)防動物疫病暴發(fā)的有效診斷監(jiān)測系統(tǒng)。另一方面，在診斷檢測技術(shù)不斷開發(fā)優(yōu)化革新的同時，強(qiáng)化診斷技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化管理及提升診斷技術(shù)的體系建設(shè)表現(xiàn)出一定的必要性。融合生物安全考量的新發(fā)病原檢測技術(shù)，特別是能提高檢測效率的技術(shù)，將會是未來的發(fā)展趨勢。將研究性和實用性有效結(jié)合，相輔相成，為動物疫病的診斷和防控奠定良好的技術(shù)基礎(chǔ)。