于慧敏，吳鵬杰，李南南，譚 靜，徐書法，武江利

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部授粉昆蟲生物學(xué)重點實驗室，北京 100093)

細胞自噬(autophagy)是維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及抗病調(diào)節(jié)的重要調(diào)控途徑[1-3]。自噬的形成和發(fā)生由一系列的自噬相關(guān)蛋白(autophagy related genes,ATG)進行調(diào)控。在自噬過程中Atg8蛋白是唯一能留在膜上的ATG蛋白，可作為自噬發(fā)生的標(biāo)記蛋白。Atg8蛋白家族可與磷脂酸肌醇結(jié)合，參與自噬體膜的形成影響自噬途徑[4-6]。已知的γ-氨基丁酸A受體相關(guān)蛋白(gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein，GABARAP)是自噬相關(guān)蛋白Atg8家族的成員，在自噬過程中發(fā)揮著不可替代的作用[7]。人源GABARAP蛋白由117個氨基酸組成,分子質(zhì)量約為14 ku，在進化上高度保守，其N-端亞結(jié)構(gòu)區(qū)域能與微管蛋白結(jié)合，而C-端亞結(jié)構(gòu)區(qū)域可與GABAA受體結(jié)合[8-9]。相關(guān)研究證明了在GABAA受體的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程中，GABARAP蛋白能起到組裝微管的作用，且GABRAP蛋白可通過調(diào)節(jié)GABAA受體的轉(zhuǎn)運來調(diào)控GABAA受體的突觸定位[10-11]。Wang等[12]通過免疫學(xué)方法證明了GABARAP蛋白在神經(jīng)元的胞體和突觸中表達。研究發(fā)現(xiàn)，GABARAP蛋白是自噬發(fā)生的良好標(biāo)記，對于自噬體的形成、延伸和成熟非常重要[13-15]。因此，GABARAP蛋白不僅在神經(jīng)傳遞中發(fā)揮重要作用，還參與細胞自噬過程。GABARAP蛋白可激活絲氨酸/蘇氨酸激酶家族中的UNC-51激酶復(fù)合體(UNC-51 like kinase,ULK)來調(diào)節(jié)其特定自噬體的擴張[16-17]。相關(guān)研究表明，與LC3家族相比，GABARAP家族在氨基酸匱乏和線粒體自噬方面發(fā)揮著更重要的作用[18-19]。GABARAP蛋白能與一種RNA解旋酶DDX47發(fā)生相互作用，將二者共轉(zhuǎn)染到腫瘤細胞系中可誘導(dǎo)細胞凋亡[20-21]。白榮耀[22]研究發(fā)現(xiàn)，在感染溶藻弧菌3 h后，鮑魚血細胞SaGABARAP基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)且達到最大值。由此可知，GABARAP蛋白在生物體細胞凋亡、免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

關(guān)于GABARAP基因的研究已從單細胞酵母逐步擴展到了高等動物和植物。但就蜜蜂而言，僅有GABARAP和LC3作為自噬相關(guān)蛋白Atg8家族成員在西方蜜蜂上進行報道，然而對GABARAP基因在自噬過程中的作用機制研究仍較少[23]。鑒于此，本研究克隆了中華蜜蜂的自噬相關(guān)基因GABARAP，利用生物信息學(xué)方法對該基因進行了序列分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測，構(gòu)建了原核表達載體，誘導(dǎo)并純化了帶有His標(biāo)簽的GABARAP蛋白，以期為中華蜜蜂GABARAP基因功能的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

3日齡中華蜜蜂幼蟲均由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供，樣品收集后于液氮迅速冷凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

總RNA提取試劑購自Invitrogen公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Promega公司；TransTaq酶、T4 DNA快速連接酶均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)實時熒光定量試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ均購自NEB公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自Bio-Tek公司；抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、One Step Western Kit HRP(MOUSE)、DAB蛋白顯色試劑盒均購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計與合成

參照GenBank中的西方蜜蜂GABARAP基因序列(登錄號:XM_001120069.5)，使用Primer Premier 5.0軟件在非編碼區(qū)設(shè)計引物，引物序列為：GABARAP-F1：5′-ACTGACGCACGGTGAT-TG-3′；GABARAP-R1：5′-AGCTTCTAAAAGGA-CTAC-3′。同時設(shè)計帶有酶切位點的特異性引物用于擴增開放閱讀框,引物序列為:GABARAP-F2：5′-CGCGGATCCATGAAGTTTCATTACAAAG-3′；GABARAP-R2：5′-ATTTGCGGCCGCTTAGTGT-CCATACACATTC-3′；下劃線處分別為BamHⅠ和NotⅠ酶切位點。 引物均由北京博邁德公司合成。

1.4 GABARAP基因克隆

1.4.1 中華蜜蜂總RNA提取與單鏈cDNA合成 取2只中華蜜蜂幼蟲于1.5 mL的EP管中，加入液氮迅速研成粉末，采用Trizol法提取總RNA，通過NanoDrop2000c及瓊脂糖凝膠電泳對RNA進行質(zhì)控檢測。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.4.2GABARAP基因巢式PCR擴增 以cDNA為模板，用引物GABARAP-F1/R1進行第1輪PCR擴增。 PCR反應(yīng)體系50 μL：10×TransTaqHiFi BufferⅡ 5 μL，dNTPs 4 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 4 μL，TransTaqHiFi DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 34 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以第1輪PCR產(chǎn)物為模板，用GABARAP-F2/R2引物進行第2輪PCR擴增,PCR反應(yīng)體系與第1輪擴增相同。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，膠回收純化獲取目的片段。

1.4.3 pEasy-T5-GABARAP重組質(zhì)粒的克隆與鑒定 將回收的目的片段與pEasy-T5克隆載體在25 ℃金屬浴下連接15 min。連接體系5 μL：PCR產(chǎn)物4 μL，pEasy-T5克隆載體1 μL。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素(Amp)(50 μg/μL)、X-Gal(20 mg/mL)和IPTG(500 mmol/L)的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)約12 h后挑取菌落，放入具有Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)過夜。 利用菌液PCR方法鑒定分析pEasy-T5-GABARAP陽性克隆,并測序鑒定。

1.4.4 生物信息學(xué)分析 用ORFfinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在線軟件對中華蜜蜂GABARAP基因的陽性克隆序列進行核苷酸翻譯；利用NCBI的BLAST程序?qū)χ腥A蜜蜂GABARAP基因序列進行比對；篩選出與GABARAP氨基酸序列相似性高的物種；應(yīng)用Mega 5.1軟件對氨基酸序列進行對比并利用鄰接法建立系統(tǒng)進化樹；采用PrediceProtein(https:∥www.predictprotein.org/)在線分析軟件預(yù)測中華蜜蜂GABARAP蛋白二級結(jié)構(gòu)及組成；通過SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)在線預(yù)測GABARAP蛋白三維結(jié)構(gòu)[24]。

1.5 GABARAP的原核表達

1.5.1 pET-32a(+)-GABARAP重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和NotⅠ將pEasyT5-GABARAP與pET-32a(+)原核表達載體于37 ℃酶切3 h，對雙酶切產(chǎn)物鑒定并回收純化，然后用T4 DNA連接酶連接。反應(yīng)體系10 μL：5×T4 DNA Ligase Buffer 2 μL，pET-32a(+)酶切產(chǎn)物1 μL，pEasyT5-GABARAP酶切產(chǎn)物5 μL，T4 DNA連接酶1 μL，ddH2O 1 μL。25 ℃連接15 min。將重組質(zhì)粒連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆并測序。最后將測序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞,涂布于具有Amp抗性的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。

1.5.2 GABARAP蛋白的誘導(dǎo)表達 挑取含有pET-32a(+)-GABARAP重組質(zhì)粒的BL21(DE3)陽性菌，在含有氨芐青霉素(50 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)直至D600 nm值為0.8，保存菌液，取部分菌液作為對照組，余下菌液按1∶1 000加入IPTG進行誘導(dǎo)，于37 ℃搖床中振蕩培養(yǎng)4 h后，取出少量菌液，離心后去上清，沉淀用PBS重懸后加入等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液,沸水中煮5 min，進行SDS-PAGE，之后用考馬斯亮藍染色初步鑒定GABARAP蛋白是否表達。

1.5.3 GABARAP蛋白的Western blotting鑒定 將經(jīng)SDS-PAGE的蛋白條帶轉(zhuǎn)印至NC膜上，采用抗His標(biāo)簽鼠單克隆抗體進行一抗孵育，山羊抗小鼠IgG(H+L)二抗孵育后用One Step Western Kit HRP(MOUSE)進行顯色，進一步驗證表達產(chǎn)物。

1.6 GABARAP蛋白的純化

1.6.1 GABARAP蛋白可溶性分析 對誘導(dǎo)的菌液用超聲波破碎，經(jīng)12 000 r/min離心30 min后，分別取上清和沉淀進行Western blotting，鑒定其表達形式。

1.6.2 GABARAP蛋白包涵體純化 按照His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒操作說明書對包涵體蛋白進行純化，將超聲處理后的沉淀依次在包涵體洗滌液Ⅰ和洗滌液Ⅱ中進行重懸溶解，在含8 mol/L尿素的變性液中進行變性，然后在不同濃度尿素的復(fù)性液中低溫透析，最后置換到PBS中，獲得純化蛋白[25]。

2 結(jié) 果

2.1 GABARAP基因克隆

中華蜜蜂幼蟲總RNA經(jīng)巢式PCR擴增結(jié)果顯示，第1輪PCR擴增獲得大小約606 bp的目的片段，第2輪PCR擴增得到大小約354 bp的目的片段(圖1)，均與預(yù)期相符。將目的片段成功轉(zhuǎn)化后，利用GABARAP-F2/R2引物經(jīng)菌液PCR方法擴增得到大小為354 bp的片段(圖2)，與第2輪PCR擴增的目的片段一致，且測序結(jié)果證明了該片段為GABARAP基因的有效序列，方向正確。NCBI同源檢索表明中華蜜蜂GABARAP基因與西方蜜蜂GABARAP基因的序列一致性為100%。

M,DL5000 DNA Marker；1,第1輪PCR產(chǎn)物；2,第2輪PCR產(chǎn)物M,DL5000 DNA Marker;1,The first round PCR product；2，The second round PCR product圖1 中華蜜蜂GABARAP基因巢式PCR擴增結(jié)果Fig.1 Nested PCR amplification results of GABARAP gene of Apis cerana cerana

圖2 重組質(zhì)粒pEasy-T5-GABARAP的PCR檢測Fig.2 PCR detection of recombinant plasmid pEasy-T5-GABARAP

2.2 GABARAP相似性比對與系統(tǒng)進化分析

GABARAP蛋白氨基酸序列分析顯示，GABARAP基因的354 bp有效序列共編碼117個氨基酸，分子質(zhì)量為13.99 ku，等電點為9.48。

BLAST在線分析結(jié)果顯示，中華蜜蜂GABARAP氨基酸序列與西方蜜蜂、大蜜蜂、小蜜蜂、歐洲熊蜂、東方熊蜂的氨基酸序列相似性均高達100%；與蘆蜂的GABARAP氨基酸序列相似性也較高，達99%(表1)。由構(gòu)建的進化樹可知，中華蜜蜂與同為膜翅目的其他昆蟲如西方蜜蜂、小蜜蜂、大蜜蜂、歐洲熊蜂和東方熊蜂親緣關(guān)系最近，處于同一簇中(圖3)。

表1 中華蜜蜂GABARAP蛋白與其他物種同源蛋白氨基酸序列一致性比對

圖3 基于中華蜜蜂與其他物種GABARAP氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of GABARAP from Apis cerana cerana and other species

2.3 GABARAP蛋白結(jié)構(gòu)功能預(yù)測

經(jīng)PrediceProtein在線預(yù)測分析獲得GABARAP基因編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)，GABARAP蛋白含有3個α-螺旋和4個β-折疊結(jié)構(gòu)，以alpha-beta-beta-alpha-beta-alpha-beta的排列方式存在,具有6個多肽結(jié)合位點，沒有預(yù)測到蛋白含有二硫鍵或跨膜結(jié)構(gòu)域(圖4)。

圖中條紋框代表α-螺旋；填充框代表β-折疊；菱形框代表多肽結(jié)合位點The striped frame indicates alpha-helices;The fill frame indicates beta-sheets;The diamond frame indicates polypeptide binding sites圖4 中華蜜蜂GABARAP蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.4 Secondary structure prediction of GABARAP protein of Apis cerana cerana

利用SWISS-MODEL在線預(yù)測GABARAP蛋白三級結(jié)構(gòu)。根據(jù)相似性選擇氨基酸序列一致性為85.47%的1gnu.1.A作為同源模擬的模板，進行GABARAP單體的同源建模。由圖5A可知，3個α-螺旋在圖示蛋白結(jié)構(gòu)的外表面，4個β-折疊在圖示蛋白結(jié)構(gòu)的內(nèi)表面。預(yù)測到的中華蜜蜂GABARAP蛋白的三級結(jié)構(gòu)與圖5B中真核生物的GABARAP的晶體結(jié)構(gòu)(PDB:1GNU)極為類似，由此推測中華蜜蜂GABARAP蛋白可能執(zhí)行與真核生物GABARAP蛋白相似的功能。

圖5 中華蜜蜂GABARAP蛋白單體三級結(jié)構(gòu)同源模擬(A)和1GNU三維結(jié)構(gòu)(B)比較Fig.5 Comparison of the tertiary structure homology modeling in Apis cerana cerana GABARAP monomer protein (A) and 1GNU three-dimensional structure (B)

2.4 GABARAP蛋白原核表達

SDS-PAGE結(jié)果顯示，誘導(dǎo)的pET-32a(+)-GABARAP重組質(zhì)粒在35 ku處有一條特異蛋白條帶，與預(yù)期大小一致，而未誘導(dǎo)樣品中則無相應(yīng)的條帶(圖6A)。利用His 標(biāo)簽抗體進行Western blotting檢測進一步證明了35 ku的單一蛋白條帶為重組蛋白(圖6B)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，未誘導(dǎo)重組質(zhì)粒；2、3，誘導(dǎo)后重組質(zhì)粒M,Protein Marker；1,Uninduced recombinant plasmid；2 and 3,Induced recombinant plasmid圖6 GABARAP蛋白的誘導(dǎo)表達(A)和Western blotting檢測(B)Fig.6 Induced expression (A) and detection of Western blotting (B) of GABARAP protein

超聲處理過的誘導(dǎo)表達重組菌液，經(jīng)Western blotting分析可知該重組蛋白的表達在包涵體中(圖7)。經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒(包涵體蛋白)純化后，在獲得第3 mL穿流液時檢測到重組蛋白(圖8)。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1，重組蛋白超聲后上清；2，重組蛋白超聲后沉淀M，Protein Marker；1，Supernatant of recombinant protein after ultrasonic processing；2，Precipitation of recombinant protein after ultrasonic processing圖7 GABARAP重組蛋白可溶性分析Fig.7 Soluble analysis of recombinant protein GABARAP

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1～6，第1～6 mL流穿液M，Protein Marker；1-6,The 1-6 mL filtration圖8 重組蛋白GABARAP純化Fig.8 Purification of the recombinant protein GABARAP

3 討 論

細胞自噬廣泛存在于真核生物中，是一種高度保守的自我降解系統(tǒng)，可參與生物的生長發(fā)育、分化、炎癥反應(yīng)及免疫調(diào)控等，在維持胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用[26]。自噬的發(fā)生與調(diào)節(jié)是由一系列的ATGs共同發(fā)揮作用。Atg8蛋白可通過調(diào)控自噬體膜的形狀和功能影響細胞自噬。GABARAP蛋白是Atg8家族的成員，是一種高度保守的蛋白，能與多種細胞因子互作，高度調(diào)控自噬體的運輸、形成與成熟等過程[4-6,27]。GABARAP能與上游調(diào)控因子MAPK15和ERK8發(fā)生相互作用，從而誘導(dǎo)自噬的起始[28-30]。Huber等[31]研究表明，GABARAP蛋白可通過不依賴脂化的方式調(diào)節(jié)泛素修飾蛋白活化酶5(UBA5)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的定位和功能。此外，在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染早期輔助蛋白Nef(負調(diào)控因子)大量表達，該蛋白能通過干擾內(nèi)吞和晚期分泌途徑中的蛋白質(zhì)來調(diào)控在免疫和病毒生命周期中起重要作用的各種細胞表面受體的表達[32]。綜上，GABARAP蛋白與自噬體的發(fā)生、組織定位密切相關(guān)。

基于GABARAP功能的重要性，本研究克隆獲得了中華蜜蜂GABARAP基因序列，經(jīng)氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼117個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為13.99 ku，研究結(jié)果與前期報道的人源GABARAP基因基本一致[33]。Bai等[34]研究表明,在雜色鮑中克隆GABARAP基因的cDNA全長得到963 bp，具有354 bp的開放閱讀框，推導(dǎo)的蛋白分子質(zhì)量為13.9 ku，等電點為8.73，該結(jié)果與本研究中華蜜蜂GABARAP基因的克隆及推導(dǎo)結(jié)果幾乎完全相同，可見GABARAP基因在進化中高度保守，且該基因在應(yīng)對病原體感染及胚胎發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。GABARAP氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析也表明了該基因的保守性。 人源GABARAP蛋白二級結(jié)構(gòu)含有4個α-螺旋，而中華蜜蜂GABARAP蛋白僅預(yù)測到3個α-螺旋，在第4-8位的氨基酸沒有預(yù)測到α-螺旋，推測是此位置氨基酸的差異不易形成螺旋結(jié)構(gòu)[8]。中華蜜蜂GABARAP三級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與已發(fā)表的人源GABARAP蛋白的晶體結(jié)構(gòu)(PDB∶1GNU)極為相似，Jatana等[35]研究表明，人源GABARAP蛋白高度參與自噬體的發(fā)生，從而調(diào)控細胞凋亡和免疫應(yīng)答等。因此，推測中華蜜蜂GABARAP基因可能執(zhí)行類似自噬調(diào)節(jié)相關(guān)的功能。GABARAP經(jīng)原核表達并純化得到了35 ku的蛋白，Western blotting結(jié)果驗證了該蛋白的準(zhǔn)確性，為后續(xù)中華蜜蜂GABARAP多克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。人源GABARAP與其3個家族成員(GABARAPL1、GABARAPL2和GABARAPL3)相似性很高，抗體檢測易與其家族成員產(chǎn)生交叉反應(yīng)，對GABARAP抗體的進一步應(yīng)用產(chǎn)生一定影響，西方蜜蜂Atg8家族成員僅包含GABARAP和LC3，因此不存在GABARAP抗體檢測過程中的內(nèi)源性干擾[23，36-37]。GABARAP蛋白廣泛存在于多種組織中，在生物體的生長發(fā)育過程中不同程度地表達[12]。有研究證明GABARAP蛋白可以與自噬相關(guān)蛋白Atg13發(fā)生相互作用來調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生[38-39]，可見GABARAP蛋白是自噬的良好標(biāo)記，在自噬過程中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)家蠶感染核型多角體病毒(BmNPV)后可觸發(fā)自噬的發(fā)生，表現(xiàn)為Atg8基因的上調(diào)表達且免疫熒光也觀察到Atg8-GFP大量增加[40-41]。

4 結(jié) 論

本試驗克隆了中華蜜蜂GABARAP基因，其長度為354 bp,編碼117個氨基酸。氨基酸序列比對及進化樹分析表明GABARAP基因保守，二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測該蛋白主要由3個α-螺旋、4個β-折疊和6個多肽結(jié)合位點組成；成功表達出GABARAP蛋白，分子質(zhì)量為35 ku,經(jīng)Western blotting驗證了GABARAP蛋白的特異性。本研究為進一步探索中華蜜蜂GABARAP蛋白的結(jié)構(gòu)功能提供了基礎(chǔ)材料，為開展中華蜜蜂GABARAP蛋白參與自噬的研究奠定了基礎(chǔ)。