楊 瑩， 賈冰怡， 張錫梅， 呂金鵬， 宋國強

(常州大學(xué) 藥學(xué)院， 江蘇 常州 213164)

人類皮膚色素合成十分復(fù)雜，在黑色素的合成過程中酪氨酸酶(TYR)的作用最為重要，是黑色素合成過程中的限速酶[1]。酪氨酸酶氧化羥化酪氨酸得到多巴醌[2-3]，多巴醌被進(jìn)一步合成為褐黑素和多巴色素。大部分多巴色素經(jīng)過多步催化形成黑色真黑素，少部分催化形成棕色真黑素，人體不同膚色也由此而來。

LED光療廣泛應(yīng)用于皮膚領(lǐng)域。光的波長不同，人體皮膚受影響的程度不同。人體組織將光能吸收后，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為各種形式的能，從而引發(fā)體內(nèi)一系列的物理和化學(xué)變化[4]。

當(dāng)前主要有LED紅、黃、藍(lán)光3種光源。紅光(630～650 nm)光療、黃光(570～590 nm)光療通過誘導(dǎo)皮膚新膠原的合成，降低基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)[5]，可起到嫩膚的作用。紅光還可通過降低局部PEG-2起到抑制炎癥的作用[6-8]。藍(lán)光(400～450 nm)可用于治療痤瘡。痤瘡丙酸桿菌會合成并儲存內(nèi)源性卟啉，這是一種內(nèi)源性的光敏劑，暴露于藍(lán)光下[9-11]，受光能激發(fā)后轉(zhuǎn)為高能量不穩(wěn)定的卟啉，與三態(tài)氧結(jié)合形成不穩(wěn)定的單態(tài)氧，誘導(dǎo)細(xì)菌死亡。藍(lán)光光療在臨床上還用于促進(jìn)白癜風(fēng)病人的色素合成，但其機(jī)制尚未明確。在黑色素的合成和代謝中，MAPK信號通路家族極為重要[12]，其中包括ERK1/2，JNK和p38，可通過Western blot檢測ERK1/2，JNK和p38的表達(dá)以及磷酸化水平。有報道指出選用B16F10細(xì)胞進(jìn)行LED紅光處理[13-15]，可降低Mitf和酪氨酸酶(TYR)的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)ERK磷酸化觸發(fā)Mitf降解[16]，最終減少了黑色素的合成[17-19]。因此本課題設(shè)計實驗探討LED藍(lán)光光療對小鼠皮膚黑色素瘤細(xì)胞(B16F10)黑色素合成的影響并研究相關(guān)機(jī)制。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(gibco，美國)、B16F10 小鼠黑色素瘤細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞所，中國)、磷酸鹽緩沖液(Biofroxx，德國)、BCA蛋白定量試劑盒、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(H+L)(碧云天生物有限公司，中國)、β-actin抗體、TYR抗體、p-ERK/ERKMTS抗體、p-p38/p38抗體(Abcam，美國)、Masson-Fontana黑色素胺銀染色試劑盒(南京森貝伽生物科技有限公司，中國)。

二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)、多功能酶標(biāo)儀(BioTek，美國)、化學(xué)發(fā)光成像儀(Tannon，中國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.1 細(xì)胞復(fù)蘇

從-80 ℃冰箱中取出B16F10 黑色素細(xì)胞，于37 ℃水浴中快速搖晃至完全溶解。取15 mL離心管，加入全部懸液和10倍以上的高糖培養(yǎng)基(其中含10% FBS)。以1 000 r/min，離心3 min。取離心后沉淀，加入含10%FBS的高糖培養(yǎng)基，反復(fù)吹打。取一培養(yǎng)皿，加入全部細(xì)胞懸液，靜置于恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5% CO2)培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將生長至80%的復(fù)蘇細(xì)胞傳至3代以上，進(jìn)行給藥實驗。為研究LED藍(lán)光劑量與黑色素降解的相互關(guān)系，將細(xì)胞分為對照組、LED藍(lán)光光療處理組(1，5，10，20，40，50，60 J/cm2)。進(jìn)一步研究LED藍(lán)光光療影響黑色素降解的具體機(jī)制，選取同一LED藍(lán)光光療照射強度(40 J/cm2)，處理細(xì)胞的時間分別為0，30，60，120，180，360 min。

1.3 MTT法測定細(xì)胞活力

取一個96孔板，消化處于生長細(xì)胞對數(shù)期的B16F10細(xì)胞并種板，每板用6孔，每孔200 μL細(xì)胞懸液(含10% FBS)，細(xì)胞濃度為 1×105個/mL，靜置培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行LED藍(lán)光光療處理。吸出上層液體，每孔加入2 mL無菌1× PBS，進(jìn)行不同強度的LED藍(lán)光光療照射(1，5，10，20，40，50，60 J/cm2)。照射結(jié)束后吸出PBS，加入含2.5% FBS的DMEM培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)24 h。用同樣的方法照射3次，最后一次照射結(jié)束后靜置培養(yǎng)24 h。吸出孔中液體，每孔加入110 μL的混合溶液(V(DMEM)∶V(MTT)=10∶1)，于37 ℃的培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)4 h。吸出上層液體，每孔加入150 μL的DMSO，搖床振搖10 min。于多功能酶標(biāo)儀中測定每孔的吸光度值(波長570 nm)，并計算細(xì)胞相對抑制率。

1.4 NaOH 裂解法測定黑色素含量

取一個6孔板，消化處于生長細(xì)胞對數(shù)期的B16F10細(xì)胞并種板，每孔2 mL細(xì)胞懸液(含10% FBS)，細(xì)胞濃度為1×105個/mL，于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中靜置培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行LED藍(lán)光光療處理。吸出孔中上層液體，每孔加入2 mL無菌1× PBS，進(jìn)行不同強度的LED藍(lán)光光療照射(1，5，10，20，40 J/cm2)。照射結(jié)束后吸出PBS，加入培養(yǎng)基(含2.5% FBS)，靜置培養(yǎng)24 h。照射3次，最后一次照射結(jié)束后靜置培養(yǎng)24 h。吸出上層液體，PBS沖洗兩次，于冰上裂解20 min，刮下細(xì)胞于1.5 mL離心管中，離心(4 ℃，13 000 r/min，15 min)。吸出上清液于另一離心管中，4 ℃保存。向每支沉淀離心管中加入100 μL 0.1% NaOH裂解液，吹打均勻后于金屬浴中加熱(80 ℃，1 h)，渦旋。將混合液加入96孔板，每孔20 μL，每個樣品制備3個復(fù)孔，在多功能酶標(biāo)儀中測定每孔的吸光度值(波長405 nm)。

1.5 Masson-Fontana 黑色素胺銀染色

選用10%甲醛水溶液進(jìn)行固定，提前接種細(xì)胞于玻片并進(jìn)行LED光療處理。將玻片置于蒸餾水中，取出后加入Fontana 氨銀溶液，避光浸染12～24 h。蒸餾水反復(fù)沖洗(5，6次為宜)。選用硫代硫酸鈉溶液處理 1～5 min，蒸餾水處理3～5 min，加入中性紅染色液，復(fù)染5 min，蒸餾水沖洗，95% 乙醇、無水乙醇脫水，最后用二甲苯透明封固。

1.6 Western blot檢測黑色素相關(guān)蛋白表達(dá)

LED藍(lán)光光療處理細(xì)胞后，裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，總蛋白質(zhì)(40 μg)在SDS-PAGE凝膠上分離，使用電泳轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上(NC)。將膜在常溫下用含有5% 奶粉的TBST封閉1.5 h，4 ℃下與抗體一起孵育過夜，二抗在常溫下孵育1 h，通過增強化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)，檢查特征蛋白表達(dá)及其下游信號通路激活情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism統(tǒng)計軟件處理所有實驗數(shù)據(jù)。本研究的所有數(shù)據(jù)采用SPSS進(jìn)行檢驗，P<0.05 表明數(shù)據(jù)間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(數(shù)據(jù)結(jié)果來自3次重復(fù)實驗)。

2 結(jié) 果

2.1 對B16F10細(xì)胞活力的影響

通過 MMT 法采用不同強度的LED藍(lán)光光療照射(1，5，10，20，40，50，60 J/cm2)對B16F10細(xì)胞進(jìn)行處理。由圖1可見，與空白對照組相比，LED藍(lán)光光療照射1，5，10，20，40 J/cm2處理B16F10細(xì)胞對細(xì)胞的增殖和凋亡無明顯影響。以劑量依賴的方式繼續(xù)進(jìn)行LED藍(lán)光光療，照射超過40 J/cm2后，即LED藍(lán)光光療照射強度為50 J/cm2和60 J/cm2時，可觀察到細(xì)胞的凋亡的增加、活力顯著下降。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究LED藍(lán)光光療照射(1，5，10，20，40 J/cm2)對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。

圖1 LED藍(lán)光光療對 B16F10 細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effects of LED blue on the viability of B16F10 cells

2.2 對B16F10細(xì)胞黑色素合成的影響

為研究LED藍(lán)光光療對B16F10細(xì)胞黑色素合成的影響，選取對數(shù)生長期的B16F10細(xì)胞，進(jìn)行不同強度的LED藍(lán)光光療照射給藥處理，最后一次照射后于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中靜置培養(yǎng)24 h。NaOH 裂解法測定不同強度的LED藍(lán)光光療照射(1，5，10，20，40 J/cm2)對B16F10細(xì)胞黑色素合成的影響。由圖2可見，給藥后，相較于空白組，給藥組的黑色素含量呈劑量依賴性上升，說明LED藍(lán)光光療對黑色素合成起促進(jìn)作用，隨著給藥強度的增大，促進(jìn)黑色素生成效果越顯著，呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖2 NaOH裂解法測定不同劑量LED藍(lán)光對黑色素合成的影響Fig.2 Effect of different dosages of LED blue on melanin synthesis by NaOH pyrolysis method

通過Masson-Fontana黑色素胺銀染色方法觀察不同強度的LED藍(lán)光光療照射(1，5，10，20，40 J/cm2)B16F10細(xì)胞的黑色素合成情況。由圖3可見，隨著LED藍(lán)光光療劑量的增加，B16F10細(xì)胞中黑色素積累變多，細(xì)胞相鄰樹突間傳遞的黑色素增加，LED藍(lán)光促進(jìn)黑色素合成以及傳遞。

圖3 Masson-Fontana 胺銀染色法測定不同劑量LED藍(lán)光對黑色素合成的影響Fig.3 Effect of different dosages of LED blue on the synthesis of melanin by Masson-Fontana amine silver staining

2.3 對 B16F10 細(xì)胞中黑色素合成相關(guān)蛋白 TYR，TRP-1，DCT 表達(dá)的影響

采用Western blot研究幾種黑色素生成酶在蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)。由圖4可見，與對照組相比，不同強度的LED藍(lán)光光療照射(1，5，10，20，40 J/cm2)后，酪氨酸酶(TYR)、相關(guān)蛋白(TRP-1)表達(dá)顯著提高，相關(guān)蛋白(DCT)表達(dá)沒有發(fā)生明顯變化。關(guān)鍵因子小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(Mitf)的表達(dá)則發(fā)生了顯著上調(diào)。這些結(jié)果表明LED藍(lán)光光療通過上調(diào)酪氨酸酶和Mitf的蛋白水平誘導(dǎo)黑色素合成，并呈劑量依賴性。

圖4 不同劑量LED藍(lán)光對酪氨酸酶和Mitf蛋白水平的影響Fig.4 Effects of different dosages of LED blue on tyrosinase and Mitf protein levels

2.4 對 B16F10 細(xì)胞中黑色素合成 MAPK 通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步闡明LED藍(lán)光光療在黑色素合成中的具體作用機(jī)制，以Mitf為最終靶向目標(biāo)，檢測上游信號通路激活情況。選取劑量為40 J/cm2的LED藍(lán)光處理不同時間(0，30，60，120，180，360 min)。由圖5可見，MAPK通路被激活。LED藍(lán)光激活p38信號通路，抑制ERK信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，p38信號通路激活后可促進(jìn)Mitf的表達(dá)，相反ERK信號通路被激活后可促進(jìn)Mitf的降解。這表明：LED藍(lán)光通過激活p38信號通路，抑制ERK信號通路促進(jìn)Mitf的表達(dá)、抑制降解導(dǎo)致黑色素合成增多。

圖5 LED藍(lán)光光療對 MAPK 通路蛋白活性的影響Fig.5 Effect of LED blue on MAPK pathway protein activity

3 結(jié) 論

本研究確定了LED藍(lán)光光療處理B16F10細(xì)胞促進(jìn)細(xì)胞黑色素合成。其特征表現(xiàn)在：與空白對照組相比，不同劑量LED藍(lán)光照射后黑色素合成相關(guān)蛋白TYR，TRP-1顯著上升，呈現(xiàn)劑量依賴性。小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(Mitf)表達(dá)明顯上升，與之相關(guān)的MAPK家族激活，其中p38通路被明顯激活、ERK通路降解促進(jìn)Mitf的表達(dá)、抑制降解最終導(dǎo)致黑色素合成增多。

本研究中LED藍(lán)光光療激活p38信號通路，抑制ERK信號通路。這可能是因為各條MAPK信號通路之間存在內(nèi)在的負(fù)反饋調(diào)節(jié)。有文獻(xiàn)[20]報道，燒傷后大鼠給予微量的H2S使p-ERK 蛋白相對表達(dá)量升高，p-JNK和p-p38蛋白相對表達(dá)量下降。關(guān)于藍(lán)光照射后，p38被激活，ERK被抑制的原因尚需要進(jìn)一步深入研究。同時在后續(xù)的研究中可選取特定抑制劑進(jìn)一步證實MAPK通路對LED藍(lán)光誘導(dǎo)的黑色素合成的作用。

當(dāng)前，LED光療已廣泛應(yīng)用于臨床。以LED藍(lán)光為例，可用于治療白癜風(fēng)，但機(jī)制尚不明確。本實驗檢測LED藍(lán)光對黑色素合成轉(zhuǎn)運作用的影響及信號通路狀態(tài)，對藍(lán)光調(diào)控黑色素的機(jī)制進(jìn)行深入討論可進(jìn)一步推廣LED藍(lán)光光療在臨床上的應(yīng)用。