黃生祥，梅海波，劉昆，唐進，伍江雁

(湖南省兒童醫(yī)院小兒骨科，湖南 長沙 410008)

骨肉瘤是好發(fā)于兒童和青少年的原發(fā)性骨惡性腫瘤，惡性程度較高，腫瘤細胞具有較強的侵襲能力，容易早期發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[1]。目前，臨床上治療骨肉瘤的主要手段是手術(shù)切除聯(lián)合化療，雖然患者的5年生存率有所提高，但化療耐藥發(fā)生率高、腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風險大，整體預(yù)后情況仍不理想。目前，骨肉瘤的發(fā)病機制未完全闡明，臨床上也缺乏有效的靶向治療手段，因此探究骨肉瘤的發(fā)病機制、發(fā)現(xiàn)骨肉瘤新的治療靶點是相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點。

微小RNA(microRNAs，miR)是一類在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮基因表達調(diào)控作用的非編碼小分子RNA，通過調(diào)控原癌基因或抑癌基因的表達參與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-133a是一種具有抑癌活性的miR，在骨肉瘤[2]、肺癌[3]、肝癌[4]、前列腺癌[5]等多種惡性腫瘤中均呈低表達趨勢。Wang等[6]研究證實miR-133a靶向抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-14的表達并抑制肺癌細胞的侵襲。MMP-14在骨肉瘤的侵襲中發(fā)揮重要作用，但目前miR-133a在骨肉瘤中調(diào)控作用尚缺乏直接證據(jù)，miR-133a是否在骨肉瘤的發(fā)病中靶向調(diào)控MMP-14也不清楚。因此，本實驗將以骨肉瘤細胞株為實驗對象，分析miR-133a在骨肉瘤細胞中表達的變化并分析miR-133a靶向MMP-14抑制骨肉瘤細胞侵襲的作用。

1 資料與方法

1.1 細胞 正常成骨細胞株hFOB1.19及骨肉瘤細胞株MG63、U2OS、SAOS2均購自ATCC公司，液氮中保存。

1.2 試劑 miR-133a mimic及陰性對照(negative control，NC)mimic購自上海吉瑪公司，pcDNA3.1質(zhì)粒及過表達MMP-14的pcDNA3.1質(zhì)粒購自上海生工公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000購自Thermo公司，miRNA提取分離試劑盒、miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒、miRNA熒光定量檢測試劑盒購自北京天根公司，結(jié)晶紫購自Sigma公司，含有MMP-14野生型3’UTR的雙熒光素酶報告基因、含有MMP-14突變型3’UTR的雙熒光素酶報告基因、雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)均購自Promega公司，ripa裂解液、聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶公司，MMP-14一抗購自Abcam公司。

1.3 儀器 細胞培養(yǎng)箱、高速離心機購自上海一恒儀器公司，顯微鏡購自日本Nikon公司，電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能儀器公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 正常成骨細胞株hFOB1.19及骨肉瘤細胞株MG63、U2OS、SAOS2均在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，待細胞密度達到80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶進行消化，按照1︰3的比例傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4.2 細胞分組 消化后傳代的MG63細胞進行分組，根據(jù)不同檢測目的接種在不同規(guī)格的培養(yǎng)板中，按照下列方法分組干預(yù)。(1)miR-NC組：轉(zhuǎn)染NC mimic；(2)miR-133a組：轉(zhuǎn)染miR-133a mimic；(3)pcDNA3.1組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒；(4)pcDNA3.1-MMP-14組：轉(zhuǎn)染過表達MMP-14的pcDNA3.1質(zhì)粒；(5)pcDNA3.1+miR-NC組：同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒及NC mimic；(6)pcDNA3.1+miR-133a組：同時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒及miR-133a mimic；(7)pcDNA3.1-MMP-14+miR-133a組：同時轉(zhuǎn)染過表達MMP-14的pcDNA3.1質(zhì)粒及miR-133a mimic。

1.4.3 miR-133a表達的熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測 MG63細胞接種在12孔培養(yǎng)板中，按照1.4.2的方法轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)基，用miRNA提取試劑盒提取細胞中的miR，用miRcDNA第一鏈合成試劑盒將miR反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用miR熒光定量PCR檢測試劑盒配置反應(yīng)體系后在熒光定量PCR儀中進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序設(shè)置為95℃預(yù)變性3 min后重復(fù)95℃ 15 s及60℃ 34 s的循環(huán)40次，反應(yīng)完成后生成循環(huán)曲線及循環(huán)閾值(Ct)，以U6為內(nèi)參、按照公式2-ΔΔCt計算miR-133a的表達水平。

1.4.4 細胞侵襲的Transwell檢測 在Transwell上室內(nèi)加入基質(zhì)膠，將MG63細胞接種在Transwell上室內(nèi)，在下室內(nèi)加入500 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，按照1.4.2的方法轉(zhuǎn)染24 h后，取出上室并在磷酸鹽緩沖液中漂洗3遍，而后用棉簽擦去上室內(nèi)未侵襲的細胞，用4%多聚甲醛固定后用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機觀察3個高倍視野，并對侵襲細胞進行計數(shù)。

1.4.5 MMP-14表達的western blot檢測 MG63細胞接種在12孔培養(yǎng)板中，按照1.4.2的方法轉(zhuǎn)染24 h后，棄去培養(yǎng)基，用ripa裂解液提取細胞中的蛋白，用BCA試劑盒檢測蛋白含量，取含有30 μg蛋白的樣本與上樣緩沖液混合后加入十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，電泳分離蛋白后電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中、室溫封閉1 h，而后將PVDF膜放入1︰1 000稀釋的MMP-14一抗或1︰5 000稀釋的β-actin一抗中、4℃孵育過夜，再將PVDF膜放入1︰2 000稀釋的二抗中、室溫孵育1 h，最后加入電化學發(fā)光(electro-chemi luminescence，ECL)顯影液并在凝膠成像儀中曝光，根據(jù)蛋白條帶的灰度值計算MMP-14的表達水平。

1.4.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?MG63細胞接種在24孔培養(yǎng)板中，將雙熒光素酶報告基因與NC mimic或miR-133a mimic共同轉(zhuǎn)染進入細胞，24 h后棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗2遍后，用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測細胞中螢火蟲熒光活力及海腎熒光活力，按照公式(螢火蟲熒光活力/海腎熒光活力)計算雙熒光素酶報告基因的熒光素酶活力。

2 結(jié) 果

2.1 骨肉瘤細胞株中miR-133a表達的變化 hFOB1.19、MG63、U2OS、SAOS2細胞中miR-133a的表達水平分別為(0.83±0.22)、(0.41±0.08)、(0.55±0.06)、(0.57±0.06)。不同細胞中miR-133a表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=6.172，P=0.001)。與正常成骨細胞株hFOB1.19比較，骨肉瘤細胞株MG63、U2OS、SAOS2中miR-133a表達均明顯降低(t值分別為4.012、2.746、2.550，P值分別為0.004、0.025、0.034)；并且MG63細胞中miR-133a表達降低最為顯著。后續(xù)將以MG63細胞進行miR-133a生物學功能的驗證。

2.2 過表達miR-133a對細胞侵襲的調(diào)節(jié)作用 與miR-NC組比較，miR-133a組細胞中miR-133a的表達水平明顯增加(t=9.099、P<0.001，見圖1a)，細胞侵襲數(shù)目明顯減少(t=4.420、P=0.002，見圖1b～c)。

a miR-133a表達的比較 b 侵襲細胞的結(jié)晶紫染色(結(jié)晶紫染色，×400) c 細胞侵襲數(shù)目的比較

2.3 過表達miR-133a對細胞中MMP-14表達的調(diào)節(jié)作用 與miR-NC組比較，miR-133a組細胞中MMP-14的表達水平明顯減少(t=4.588、P=0.002，見圖2a)；經(jīng)Targetscan分析，miR-133a靶向結(jié)合MMP-14基因mRNA 3’UTR(見圖2b)；經(jīng)雙熒光素酶報告基因驗證，與miR-NC組比較，miR-133a組野生型雙熒光素酶報告基因的熒光活力明顯降低(t=5.194、P=0.001，見圖2c)，突變型雙熒光素酶報告基因的熒光活力無明顯變化(t=1.828、P=0105，見圖2d)。

a MMP-14表達的比較

2.4 過表達MMP-14對miR-133抑制細胞侵襲作用的影響 與pcDNA3.1+miR-NC組比較，pcDNA3.1+miR-133a組細胞中MMP-14的表達水平明顯減少(t=7.726，P<0.001)；與pcDNA3.1+miR-133a組比較，pcDNA3.1-MMP-14+miR-133a組細胞中MMP-14的表達水平明顯增加(t=7.752、P<0.001，見圖3a)。

與pcDNA3.1+miR-NC組比較，pcDNA3.1+miR-133a組的細胞侵襲數(shù)目明顯減少(t=5.824、P<0.001)；與pcDNA3.1+miR-133a組比較，pcDNA3.1-MMP-14+miR-133a組的細胞侵襲數(shù)目明顯增加(t=4.911、P=0.001，圖3b～c)。

a MMP-14表達的比較

3 討 論

骨肉瘤的發(fā)病涉及多基因、多步驟、多因素，但具體的分子機制尚未闡明。骨肉瘤惡性程度高、容易早期發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，而骨肉瘤細胞極強的侵襲能力是造成骨肉瘤遠處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵生物學行為，因此研究骨肉瘤細胞侵襲的調(diào)控機制有助于深入認識骨肉瘤的發(fā)病機制。

近些年，miR在骨肉瘤侵襲中的調(diào)控作用受到了越來越多的關(guān)注，miR-96、miR-181a、miR-320a等多種miR均被證實能夠促進或抑制骨肉瘤細胞的侵襲[7-9]。miR-133a是一種具有抑癌作用的miR，在骨肉瘤、乳腺癌、胃癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤中均呈低表達趨勢[2，10-12]。本實驗檢測了3種骨肉瘤細胞株中miR-133a的表達水平，與正常成骨細胞株hFOB1.19比較，骨肉瘤細胞株中miR-133a的表達水平均明顯降低。與既往其他研究在骨肉瘤臨床樣本中發(fā)現(xiàn)的miR-133a低表達結(jié)果一致，提示miR-133a低表達可能參與骨肉瘤的發(fā)生發(fā)展，但目前仍缺乏miR-133a調(diào)控骨肉瘤細胞侵襲的相關(guān)研究報道。本實驗還發(fā)現(xiàn)，在3種骨肉瘤細胞株中MG63細胞中miR-133a表達降低最顯著，因此后續(xù)將在此細胞株中研究miR-133a對侵襲的調(diào)控作用。

在MG63細胞中，通過轉(zhuǎn)染miR-133a mimic的方式增加miR-133a的表達后，MG63細胞的侵襲數(shù)目明顯減少，表明miR-133a對骨肉瘤細胞的侵襲具有抑制作用。miR-133a與其他miRs相似，并不直接發(fā)揮調(diào)控生物學行為的作用，而是通過結(jié)合靶基因mRNA 3’UTR的方式來抑制基因表達，進而調(diào)控細胞的生物學行為。肺癌的相關(guān)研究表明，miR-133a抑制細胞侵襲的作用與靶向抑制MMP-14的表達有關(guān)[6]；本實驗在Targetscan中進行生物信息學分析也證實，MMP-14基因mRNA 3’UTR中有miR-133a的結(jié)合位點。在此基礎(chǔ)上，本實驗觀察了miR-133a對骨肉瘤細胞中MMP-14表達的靶向調(diào)節(jié)作用，在轉(zhuǎn)染miR-133a mimic后，細胞中MMP-14的表達水平明顯降低，含有MMP-14野生型3’UTR的雙熒光素酶報告基因的熒光活力也降低。根據(jù)Targetscan生物信息學預(yù)測結(jié)果將MMP-14的3’UTR進行突變后，miR-133a不影響雙熒光素酶報告基因的熒光活力。以上結(jié)果表明miR-133a能夠靶向結(jié)合MMP-14基因mRNA的3’UTR并抑制基因表達，并且其靶向結(jié)合位點與Targetscan的預(yù)測一致。

MMP-14是MMPs家族中介導(dǎo)細胞外基質(zhì)及細胞基底膜水解的重要成員之一，對胃癌、宮頸癌、肺癌等多種惡性腫瘤細胞的侵襲具有促進作用[13-15]。Ho[16]和Wu[17]的研究也證實MMP-14在骨肉瘤中表達上調(diào)。本實驗在觀察到miR-133a抑制MG63細胞侵襲及細胞中MMP-14表達后，進一步驗證了MMP-14在miR-133a抑制MG63細胞侵襲中的作用。在轉(zhuǎn)染miR-133a mimic的同時，將過表達MMP-14的pcDNA3.1質(zhì)粒也轉(zhuǎn)染進入MG63細胞，通過轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的方式過表達MMP-14后觀察到：miR-133a抑制MG63細胞侵襲的作用明顯減弱，表明miR-133a抑制MG63細胞侵襲的作用與其靶向抑制MMP-14的表達有關(guān)，因為過表達MMP-14能夠削弱miR-133a抑制MG63細胞侵襲的作用。

綜上所述，miR-133a在骨肉瘤細胞中表達下調(diào)，過表達miR-133a能夠抑制骨肉瘤MG63細胞侵襲、抑制MMP-14表達，靶向MMP-14基因mRNA 3’UTR是相關(guān)的分子機制，未來miR-133a可能成為闡明骨肉瘤發(fā)病機制的新靶點。