周 游，王夢軍，曹崇江,,*

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇 南京 210023；2.中國藥科大學工學院，江蘇 南京 211198）

果蔬因含有豐富的營養(yǎng)物質而容易滋生細菌，腐爛變質，從而喪失食用和商品價值，造成巨大的經濟損失。因此，為延長果蔬貨架期，開發(fā)新型抗菌保鮮包裝材料具有重要意義。目前普遍使用的抗菌包裝材料多以聚乙烯基為主要成分，通過添加不同的抗菌劑以達到抗菌效果。常用的抗菌劑有無機抗菌劑、有機抗菌劑和天然抗菌劑[1]。這種包裝在給人們生活提供便利的同時，也帶來較多白色污染[2]。為迎合我國綠色可持續(xù)發(fā)展理念，開發(fā)環(huán)境友好且抗菌性能良好的包裝材料是目前主要的研究方向。

殼聚糖又稱脫乙酰甲殼素，具有良好的生物相容性、抗微生物活性、成膜性等[3]特點，且安全無毒。這些特性使殼聚糖被廣泛應用于食品保鮮領域。近年來研究表明，殼聚糖膜可以延長草莓[4]、黃瓜[5]、天麻[6]等果蔬的貨架期。張承等[7]研究發(fā)現，殼聚糖復合膜可以有效防止獼猴桃軟腐病，抑制率達60%以上，同時能降低丙二醛含量，提高抗氧化酶活性，增強抗病性，且能夠顯著提高獼猴桃營養(yǎng)物質的含量。雖然已有研究表明殼聚糖復合膜具有一定的保鮮性能，但當其單獨使用時，尚存在一些缺點，比如抗菌性能有限等[8]。

無機納米材料由于具有較大的特異性表面積和較高的生物活性，被認為是抗菌劑的良好候選材料[9]。量子點屬于無機納米材料，一般由IV、II-VI、IV-VI或III-V族元素組成，多應用于生物醫(yī)學領域，例如光熱療法治療腫瘤[10]、體內熒光成像[11]等。此外，與傳統(tǒng)無機納米材料不同的是，量子點是一種在黑暗條件下抑菌效果較差，而光照條件下抑菌效果顯著的材料。量子點在光的激發(fā)下可以產生活性氧，而活性氧過度累積引起的氧化應激則被認為是量子點發(fā)揮抗菌活性的主要機制[12]。一般原理是，當量子點被光能大于帶隙的光照射時，量子點中的電子被推進穿過帶隙到導帶，從而在價帶中產生空穴。導帶中的電子和價帶中的空穴分別表現出高的還原能力和氧化能力。電子可與氧分子發(fā)生反應，通過還原過程生成超氧陰離子?？昭梢詮乃?或羥基離子中提取電子，通過氧化過程生成羥自由基。單線態(tài)氧主要是由超氧陰離子的水溶液反應間接產生的[13]。

本實驗以殼聚糖為成膜基材，以ZAISe/ZnS量子點為光敏材料，制備量子點/殼聚糖抗菌復合膜。殼聚糖和過渡金屬離子具有良好的螯合能力，殼聚糖上的氨基和羥基是量子點優(yōu)良的封頭基團，且殼聚糖的高黏性還可以防止量子點團聚[14]。此外，殼聚糖和量子點都有一定抑菌作用，兩者復合將會發(fā)揮協(xié)同抑菌效果。鑒于量子點在光照條件下優(yōu)異的抑菌效果，該復合膜有望成為超市等光照充足場所中果蔬保鮮新材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌（ATCC 25922）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538） 上海魯微科技有限公司；人結腸癌細胞（HCT116、SHBCC E00078） 上海保藏生物技術中心。

醋酸鋅（CH3COO)2Zn）、醋酸銦（In(C2H3O2)3）、十八烯（1-octadecene，ODE）、十二硫醇（1-dodecanethiol，DDT）、油酸（oleic acid，OA）、三巰基丙酸（3-mercaptopropionic acid，MPA）、硝酸銀（AgNO3）、硒（Se）、硫（S）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；殼聚糖（脫乙酰度不低于85%）薩恩化學技術（上海）有限公司；醋酸、甲醇 上海阿達瑪斯試劑有限公司；甘油 上海麥克林生化科技有限公司；蛋白胨、酵母提取物、氯化鈉（NaCl）、瓊脂 生工生物工程（上海）股份有限公司；無水氯化鈣（CaCl2）、硝酸鎂（Mg(NO3)2）、四氯化碳（CCl4）、溴化鉀（KBr） 國藥集團化學試劑有限公司；3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT） 上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

ZNCL-TS100ML磁力攪拌器 上海羌強儀器設備有限公司；TU-1810PC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Cary Eclipse熒光分光光度計美國Varian公司；HT7700透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM） 日本日立公司；TAXT plus型食品物性測定儀 英國Stable Micro Systems公司；MC-PF300B氙燈光源系統(tǒng) 北京鎂瑞臣科技有限公司；SpectraMax190全波長酶標儀 南京百奧生物科技有限公司；S-3000N臺式掃描電子顯微鏡 日本日立公司；CM-5色差儀 日本柯尼卡美能達公司。

1.3 方法

1.3.1 ZAISe/ZnS量子點的制備及表征

1.3.1.1 ZAISe/ZnS量子點的制備

取18.348 mg (CH3COO)2Zn、6.798 4 mg AgNO3和29.196 mg In(C2H3O2)3于三頸燒瓶中，加入4 mL ODE、0.5 mL DDT和50 μL OA，劇烈攪拌，N2條件下緩慢加熱至175 ℃，10 min內形成透明溶液。向其中迅速注入Se溶液（將21.319 2 mg Se溶于0.5 mL OLA和0.2 mL DDT的混合溶液中），175 ℃下反應30 min。取18.348 mg (CH3COO)2Zn、3.206 5 mg S，溶于0.1 mL OLA和0.4 mL ODE的混合溶液中，充分溶解后，注入三頸燒瓶，175 ℃反應30 min[15]。

1.3.1.2 水溶性MPA@ZAISe/ZnS量子點的制備

將上述所得量子點溶液用甲醇沉淀兩次，真空干燥。取10 mg干燥的ZAISe/ZnS量子點和0.919 g MPA，加入10 mL CCl4磁力攪拌6 h，加入10 mL H2O，對混合物進行渦流振蕩、超聲、離心。取沉淀，去離子水洗滌，凍干，制得干燥的MPA@ZAISe/ZnS量子點備用[16-17]。

1.3.1.3 量子點的表征

采用紫外可見光光度計、熒光光譜儀和TEM對量子點進行表征。

1.3.1.4 量子點的細胞毒性測定

采用Shan Jingyang等[18]的方法并稍作修改。將懸浮在DMEM培養(yǎng)基中的2×104個HCT116細胞（100 μL）接種于96 孔板中，37 ℃培養(yǎng)24 h后，再與不同質量濃度的MPA@ZAISe/ZnS量子點（0、31.25、62.5、125、250、500 μg/mL）在DMEM培養(yǎng)基中（150 μL）孵育24 h，之后每孔加入5 mg/mL MTT（20 μL），繼續(xù)孵育4 h，移除上清液，加入DMSO（100 μL），室溫下振蕩15 min，用酶標儀在495 nm波長處測定OD值。細胞活力按式（1）計算。

式中：OD空白為只有培養(yǎng)基組光密度值；OD對照為不加量子點組光密度值；OD樣品為添加不同質量濃度量子點組光密度值。

1.3.2 量子點/殼聚糖復合膜的制備及表征

1.3.2.1 MPA@ZAISe/ZnS量子點殼聚糖復合膜的制備

殼聚糖膜的制備：稱取1 g殼聚糖，溶于1%（體積分數）的冰醋酸溶液，加入甘油1 g，90 ℃低速攪拌20 min，用8 層紗布過濾除去不溶物，超聲處理30 min后，將150 mL經上述步驟制得的膜溶液倒入模具（d≈250 mm）中，在（40±1）℃條件下干燥約48 h，保存?zhèn)溆肹19]。

MPA@ZAISe/ZnS量子點殼聚糖復合膜的制備方法同殼聚糖膜的制備。待殼聚糖溶液攪拌完畢，加入75 mg MPA@ZAISe/ZnS量子點，攪拌、超聲至完全溶解，用8 層紗布過濾除去不溶物，后續(xù)步驟同上。

1.3.2.2 膜的物理性能測定

厚度測定：在膜上選取5 個測量點，中間和四周各一個，用螺旋測微儀測定膜厚度。

抗拉伸強度、斷裂伸長率測定：參照張璇等[20]的方法。將膜裁剪成長100 mm、寬15 mm長條形試樣，初始夾距為80 mm，拉引速率為5 mm/min。

水蒸氣透過率測定：參照張小涵[21]的方法。在潔凈干燥的40 mm×25 mm稱量瓶內，加入3 g無水氯化鈣粉末，將待測膜覆蓋在稱量瓶瓶口，置于干燥器（底部加入飽和硝酸鎂溶液，維持干燥器內的相對濕度為50%）內。平衡2 h后，每隔1 h測定一次稱量瓶的質量，連續(xù)測定6 h。水蒸氣透過率按式（2）計算。

式中：WVP為水蒸氣透過率/（g·mm/（m2·h·kPa））；m為稱量瓶增加的質量/g；d為膜的厚度/mm；t為測量時間/h；S為樣品膜實驗面積/m2；Δp為試樣兩側的蒸汽壓差（1.583 kPa）。

1.3.2.3 色差和透光率測定

采用色差儀對膜進行色差測定，以L*、a*和b*值表示，進行3 次測定。其中L*值為明度指數，0為黑色，100為白色；a*值為紅綠度指數，從綠色（-）到紅色（+）；b*值為黃藍度指數，從藍色（-）到黃色（+）。

透光率測定：將膜剪成1 cm×4 cm的矩形長條，將其緊密貼在比色皿壁上，以空氣為對照，用紫外-可見光光度計在400～700 nm波長處測定透光率。

1.3.2.4 傅里葉變換紅外光譜測定

將膜烘干剪碎后，與KBr混合研磨，均勻壓片，在4 000～400 cm-1波數范圍內掃描傅里葉變換紅外光譜。

1.3.2.5 膜的掃描電子顯微鏡觀察

利用掃描電子顯微鏡觀察添加了MPA@ZAISe/ZnS量子點殼聚糖復合膜的表面形貌。將樣品干燥，用導電雙面膠帶固定于不銹鋼載物臺上，濺射噴金后，殼聚糖膜和量子點/殼聚糖復合膜在10 kV加速電壓下進行觀察。

1.3.2.6 膜溶液的抑菌性測定

參照李迪等[22]的方法，將牛津杯鋪平在培養(yǎng)皿上。吸取大腸桿菌/金黃色葡萄球菌細菌培養(yǎng)液于LB培養(yǎng)基中混勻，使菌液濃度為106CFU/mL，倒入培養(yǎng)皿，待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯，加入膜溶液。每組測試均設立3 個平行。將已制備好的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌實驗組分為光照組和黑暗組，光照組用氙燈照1 h，黑暗組避光1 h，然后放入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱，24 h后觀察抑菌圈大小。使用十字交叉法記錄抑菌圈直徑的變化，并分析抗菌復合膜的抑菌性能。

1.4 數據處理與分析

所有實驗重復3 次，結果以平均值±標準差表示。數據結果使用SPSS 20.0軟件進行分析，采用獨立性t檢驗法分析數據顯著性，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 量子點表征及毒性分析結果

2.1.1 量子點表征

由圖1A可知，水溶性量子點的紫外-可見吸收光譜和初始的油溶性量子點的基本一致，而水溶性量子點的熒光強度與油溶性量子點相比較弱（圖1B）。水溶性量子點的發(fā)射峰（700 nm）較初始量子點的發(fā)射峰（690 nm）發(fā)生輕微紅移。通過透射電子顯微鏡對量子點的形貌進行分析，由圖1C可知，油溶性量子點的尺寸在10 nm左右，均勻分散，而轉水相后的量子點發(fā)生聚集，這是因為MPA分子鏈段短，并且沒有去質子化，容易在兩個-COOH之間產生氫鍵[23-24]（圖1D）。

圖1 采用MPA和配體交換相轉移前后ZAISe/ZnS量子點表征Fig.1 Characterization of ZAISe/ZnS quantum dots before and after ligand exchange phase transfer using MPA

2.1.2 量子點的細胞毒性分析結果

食品包裝的安全性是開發(fā)新型食品包裝的首要前提，因此必須保證食品包裝材料安全無毒。通過MTT法測定了MPA@ZAISe/ZnS量子點對HCT116人結腸癌細胞的毒性作用，細胞活力與吸光度成正相關。如圖2所示，MPA@ZAISe/ZnS量子點的質量濃度為500 μg/mL時，細胞活力仍可達87.11%，根據細胞毒性反應分級，80%～99%樣品毒性分級為1級，細胞毒性反應極輕微，表明該量子點安全無毒，具有良好的生物安全性。因此，該量子點可以作為抑菌劑與殼聚糖混合，制備安全無毒的復合膜。

圖2 MPA@ZAISe/ZnS量子點對人結腸癌細胞（HCT116）活力的影響Fig.2 Effect of MPA@ZAISe/ZnS quantum dots on the viability of human colon cancer cells (HCT116)

2.2 膜的表征及抑菌效果

2.2.1 膜的物理性能

殼聚糖膜和量子點/殼聚糖復合膜的理化性質如表1所示。量子點的添加沒有對殼聚糖膜的厚度產生顯著影響，均為47 μm左右。殼聚糖膜的拉伸強度為3.24 MPa，復合膜的拉伸強度為3.97 MPa，相對有所提高。殼聚糖膜的斷裂伸長率為2.56%，復合膜是2.82%，有一定程度的增加。殼聚糖膜和復合膜的水蒸氣透過率分別為0.40 g·mm/（m2·h·kPa）和0.37 g·mm/（m2·h·kPa），量子點的加入相對降低了殼聚糖膜水蒸氣的透過能力。

表1 膜的物理性質Table 1 Physicochemical properties of the films

2.2.2 膜的色差和透光度

由表2可知，殼聚糖膜的L*值為88.29，量子點/殼聚糖復合膜為66.95，L*值極顯著下降；殼聚糖膜a*值為2.43，復合膜為5.06，a*值極顯著上升；b*值則由殼聚糖膜的偏藍變?yōu)閺秃夏さ钠S。由于量子點本身呈棕褐色，因此復合膜的顏色發(fā)生了改變，而量子點/殼聚糖復合膜的透光率與殼聚糖膜相比也顯著降低。量子點的加入使殼聚糖膜的顏色加深，深色膜可能會影響感官評價效果，但是有研究報道，深色膜能夠提高馬鈴薯和洋蔥等農產品的貯藏品質[25]。

表2 膜的色差和透光度Table 2 Color parameters and transmittance of the films

2.2.3 膜的傅里葉變換紅外光譜分析結果

通過傅里葉變換紅外光譜對膜的官能團進行分析，從圖3中可以看出，兩種膜在3 400 cm-1處都有一個較明顯的峰，這是-OH和-NH的伸縮振動吸收峰[26]。殼聚糖中存在分子內和分子間氫鍵，但由于氫鍵的長短和強弱不同，使得伸縮峰范圍較寬。而量子點/殼聚糖復合膜中對應的峰相對較窄，則是由于量子點的加入影響了殼聚糖中分子間氫鍵。2 900 cm-1附近是C-H的兩個伸縮振動峰，復合膜在3 000 cm-1處有一個峰，這是由于量子點的加入導致C-H的伸縮振動峰發(fā)生偏移。復合膜在2 560 cm-1的峰是-SH的伸縮振動峰[27]，這個特征峰在MPA@ZAISe/ZnS量子點中同樣存在，因為MPA中有-SH的存在。1 650 cm-1和1 590 cm-1分別是酰胺I帶吸收峰和酰胺II帶吸收峰[28]，復合膜中酰胺I帶吸收峰消失，酰胺II帶吸收峰加強，歸因于MPA中羰基的作用。

圖3 膜的傅里葉變換紅外光譜Fig.3 Fourier transform infrared spectra of the films

2.2.4 膜的掃描電子顯微鏡觀察結果

如圖4A所示，純殼聚糖膜分子內和分子間氫鍵較多，所以結構相對規(guī)整，其表面均勻光滑沒有雜質。量子點/殼聚糖復合膜的掃描電子顯微鏡圖像（圖4B）中白色部分為量子點，可以看出量子點在膜上分布較為均勻。這歸因于殼聚糖網狀分子結構上含有大量-NH3和-OH，可以和量子點表面的-SH相互作用，從而改變量子點的表面性質，最終改善了其在殼聚糖溶液中的分散效果[29-30]。

圖4 膜的掃描電子顯微鏡圖Fig.4 Scanning electron microscopic images of the films

2.2.5 膜溶液的抑菌性能

從圖5A可以看出，在黑暗條件下，殼聚糖膜溶液和量子點/殼聚糖復合膜溶液均對金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果。金黃色葡糖球菌是典型的革蘭氏陽性菌，據報道，殼聚糖對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優(yōu)于革蘭氏陰性菌[31]。從圖5C中也可以明顯看到，在黑暗條件下殼聚糖膜溶液和量子點/殼聚糖復合膜溶液對大腸桿菌的抑菌效果較差。從圖5B、D中可以看出，在光照條件下量子點/殼聚糖復合膜溶液對兩種菌的抑菌圈都要大于殼聚糖膜溶液的抑菌圈，并且對大腸桿菌的抑制效果更加明顯。這是由于殼聚糖本身對革蘭氏陰性菌的抑菌效果一般，而量子點是一種光敏材料，在光的激發(fā)下產生活性氧，活性氧可以氧化生物底物，從而導致不可逆的細胞損傷和酶失活，最終導致細胞死亡，發(fā)揮抑菌作用[32]。因此，復合膜在光照條件下表現出更顯著的抑菌效果[33]。總之，光照條件下的量子點/殼聚糖復合膜溶液與殼聚糖膜溶液相比，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有極顯著的抑菌效果（圖5E）?；钚匝踹€會破壞霉菌的孢子質膜的完整性，從而抑制霉菌的生長[34-35]。因此，量子點可以作為一種廣譜抗菌材料，量子點/殼聚糖復合膜對果蔬表面的霉菌有潛在的抑制作用，預期該復合膜可以達到保鮮果蔬的目的。

圖5 膜溶液的抑菌效果Fig.5 Bacteriostatic effect of the film-forming solutions

3 結 論

將光敏材料ZAISe/ZnS量子點與殼聚糖復合制備成抑菌膜，通過對膜的物理性能測定發(fā)現，量子點的加入降低了殼聚糖膜的透光性；并且該復合膜在光照條件下對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都表現出顯著的抑菌效果，而在黑暗條件下的抑菌效果不顯著。若要將該復合膜實際應用于果蔬的抗菌保鮮，其保鮮性能還有待進一步驗證?？傊?，由于該量子點在光照條件下具有顯著抑菌效果，并且這種量子點安全無毒，因此將ZAISe/ZnS量子點光敏材料加入殼聚糖等成膜基質中，有望成為果蔬保鮮方面新的發(fā)展方向。