劉珺碧 蔣日月 王 浩 鄧 傾 周 青

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cells，ADSCs）源性外泌體（ADSCs derived exosomes，ADSCs-Exos）富含蛋白質(zhì)、信使RNA和微小RNA（miRNA）等細(xì)胞特異性分子，介導(dǎo)細(xì)胞間通訊，在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域具有重要價(jià)值。然而其提取過程繁瑣，產(chǎn)量低，導(dǎo)致促進(jìn)血管生成的效果不理想。低強(qiáng)度脈沖超聲（low-intensity pulsed ultrasound，LIPUS）可在顯著降低熱效應(yīng)對機(jī)體傷害的同時，將機(jī)械刺激信號傳導(dǎo)至生物體內(nèi)轉(zhuǎn)變?yōu)樯飳W(xué)信號，發(fā)揮多種生物學(xué)效應(yīng)。既往研究［1］證實(shí)LIPUS治療可促進(jìn)缺血心肌的血管生成，減輕心肌組織纖維化程度?；诖?，本實(shí)驗(yàn)擬使用LIPUS聯(lián)合ADSCs-Exos作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs），觀察二者聯(lián)合對血管生成能力的影響，進(jìn)而為缺血性疾病的治療提供研究基礎(chǔ)。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)動物及主要實(shí)驗(yàn)材料、儀器

1.實(shí)驗(yàn)動物：SPF級SD雄性大鼠10只，體質(zhì)量234~256 g，由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供，倫理批準(zhǔn)文號：WDRM動（福）第20210210號。

2.主要實(shí)驗(yàn)材料：HUVECs、胎牛血清（FBS，美國Sciencell公司）；DMEM低糖培養(yǎng)基（美國Hyclone公司）；CD29-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD90-PE直標(biāo)抗體（美國eBioscience公司）；CD9、Tsg101、GAPDH、Calnexin單克隆抗體（美國Proteintech公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁公司）；Matrixgel基質(zhì)膠（美國BD公司）；血管生成載玻片（81506，德國ibidi公司）。

3.主要實(shí)驗(yàn)儀器：流式細(xì)胞儀（FASCCalibur，美國BD公司）；聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）電泳槽（MINI，美國BIO-RAD公司）；透射電子顯微鏡（HT7700，日本日立公司）；納米顆粒跟蹤分析儀（Zeta View PMX 110，德國Particle Metrix公司）；倒置顯微鏡（IX51，日本Olympus公司）；超速低溫離心機(jī)（Coulter XPN-100，美國Beckman公司）；酶聯(lián)免疫檢測儀（EnSight，美國Perkin Elmer公司）；多通道超聲輻照儀（RS232，重慶醫(yī)科大學(xué)超聲影像學(xué)研究所）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.ADSCs的培養(yǎng)、分離及鑒定：無菌條件下取SD大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪，PBS漂洗、剪碎，加入適量0.1%Ⅰ型膠原酶在37℃下消化40 min，然后加入等量含有10%FBS的DMEM低糖培養(yǎng)基中和膠原酶，1300r/min離心10min，再加入DMEM低糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以105個/cm2的密度接種于培養(yǎng)瓶中，放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d換液一次，至貼壁細(xì)胞長滿瓶底后消化，傳代接種。取第3~6代ADSCs，使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表面蛋白CD29、CD34、CD45、CD90。

2.ADSCs-Exos的提取及鑒定：取第3代ADSCs進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長匯合達(dá)80%左右時更換為無血清的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d，收集上清液，利用超速離心法提取ADSCs-Exos，并用PBS重懸沉淀后，于-80℃凍存?zhèn)溆谩ＨDSCs-Exos混懸液滴加于載樣銅網(wǎng)上，室溫靜置1 min，用濾紙輕輕吸去銅網(wǎng)邊緣殘余液體，滴加磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染，使用透射電子顯微鏡觀察ADSCs-Exos形態(tài)。將ADSCs-Exos用適量PBS稀釋，使用納米顆粒跟蹤分析儀檢測其粒徑。取適量ADSCs-Exos，用細(xì)胞裂解液裂解后，通過SDS-PAGE凝膠電泳檢測標(biāo)志性蛋白CD9和Tsg101的表達(dá)。

3.LIPUS輻照：使用多通道超聲輻照儀，參照既往研究［2］設(shè)置輻照參數(shù)，即超聲頻率1.5 MHz，輸出聲強(qiáng)0.1 W/cm2，調(diào)制頻率1.0 kHz，占空比20%，輻照時間40 min。輻照時將超聲探頭用鐵架臺固定，置于細(xì)胞培養(yǎng)板下方，仔細(xì)涂抹耦合劑使探頭與板充分接觸，保證探頭面積充分覆蓋細(xì)胞培養(yǎng)板面積。

4.CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測HUVECs增殖能力：取對數(shù)生長期HUVECs，根據(jù)處理方法不同將其分為對照組、LIPUS組、外泌體組及LIPUS+外泌體組。其中外泌體組和LIPUS+外泌體組加入10μl濃度為100μg/ml ADSCs-Exos后分別進(jìn)行假輻照和輻照處理；LIPUS組和對照組均加入等量PBS后分別進(jìn)行輻照和假輻照處理，各組HUVECs培養(yǎng)24 h后，以每孔5000個的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁后吸出舊培養(yǎng)液，加入10%的CCK-8培養(yǎng)液110μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h后，使用酶聯(lián)免疫檢測儀對HUVECs在波長450 nm處的吸光度值（OD值）進(jìn)行檢測。

5.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測HUVECs遷移能力：取對數(shù)生長期HUVECs，以每孔5×105個的密度接種于6孔板，待細(xì)胞完全貼壁后棄取舊培養(yǎng)液，更換為無FBS的培養(yǎng)液饑餓過夜后，用200μl移液槍進(jìn)行劃痕，PBS洗滌脫落細(xì)胞后，按CCK-8實(shí)驗(yàn)分組方法將細(xì)胞分為4組分別進(jìn)行處理，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后于倒置顯微鏡下拍照，應(yīng)用Image J軟件測量劃痕面積，計(jì)算HUVECs的遷移率，公式為：遷移率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%［3］。

6.小管形成實(shí)驗(yàn)檢測HUVECs成管能力：取對數(shù)生長期HUVECs，接種于3.5 cm2培養(yǎng)皿上，待細(xì)胞貼壁后吸出舊培養(yǎng)液，更換為無FBS的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜，按CCK-8實(shí)驗(yàn)分組方法將細(xì)胞分為4組分別進(jìn)行處理，將細(xì)胞消化接種于血管生成載玻片上，培養(yǎng)4~8 h后于倒置顯微鏡下拍照，應(yīng)用Image J軟件測量管腔周長并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、ADSCs和ADSCs-Exos的特征

倒置顯微鏡下見ADSCs形態(tài)呈梭形（圖1）；流式細(xì)胞儀測得ADSCs細(xì)胞表面蛋白CD34和CD45為陰性，CD29、CD90為陽性。透射電子顯微鏡下見ADSCs-Exos呈雙層膜結(jié)構(gòu)的茶托樣囊泡；納米顆粒跟蹤分析儀測得粒徑97.8%集中在（118.8±80.8）nm；蛋白免疫印跡法測得ADSCs-Exos表達(dá)標(biāo)志性蛋白CD9、Tsg101。見圖2。

圖1 倒置顯微鏡下觀察第3代ADSCs形態(tài)（×100）

圖2 ADSCs-Exos的形態(tài)、粒徑及標(biāo)志性蛋白表達(dá)檢測

二、各組HUVECs增殖能力比較

CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示，外泌體組、LIPUS組及LIPUS+外泌體組OD值分別為0.646±0.034、0.631±0.027及1.882±0.138，均高于對照組0.462±0.036，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；其中LIPUS+外泌體組OD值最高，與其余各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。

三、各組HUVECs遷移能力比較

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，0 h時各組劃痕面積基本保持一致；24 h時外泌體組、LIPUS組及LIPUS+外泌體組細(xì)胞遷移率分別為（43.0±5.1）%、（34.7±2.3）%、（87.7±4.5）%，均高于對照組（25.1±2.0）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；其中LIPUS+外泌體組細(xì)胞遷移率最高，與其余各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見圖3。

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測各組不同時間細(xì)胞遷移能力

四、各組HUVECs成管能力比較

小管形成實(shí)驗(yàn)顯示，對照組形成管腔的能力有限，外泌體組、LIPSU組及LIPUS+外泌體組形成管腔的數(shù)量明顯增多，且管腔周長也變大，與對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）；其中LIPUS+外泌體組形成管腔數(shù)量最多，管腔周長最大，結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，與外泌體組、LIPUS組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05）。見表1和圖4。

圖4 小管形成實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞成管能力

表1 各組HUVECs成管能力比較（±s）

表1 各組HUVECs成管能力比較（±s）

與對照組比較，*P<0.05

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討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)治療性血管生成是目前缺血性疾病治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，研究者對其改善組織血供、促進(jìn)器官功能恢復(fù)的潛能寄予厚望［4］。然而動物實(shí)驗(yàn)及臨床實(shí)踐均顯示間充質(zhì)干細(xì)胞移植后存活率低下，促血管生成的療效不顯著，極大地限制了其在臨床的應(yīng)用［5］。近期研究［6-8］發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞的治療效應(yīng)主要通過旁分泌效應(yīng)介導(dǎo)，而外泌體正是干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的關(guān)鍵功能物質(zhì)，其是一種單層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞外小囊泡，直徑約30~150 nm。ADSCs-Exos的治療效應(yīng)與干細(xì)胞相當(dāng)，且避免了干細(xì)胞植入機(jī)體后存活率低及免疫相關(guān)的問題，有望為治療性血管生成提供一條“非細(xì)胞治療”的新途徑。雖然ADSCs-Exos展示了較好的促血管生成潛力，但提取過程繁瑣，產(chǎn)量較低，成本高昂。而LIPUS治療可促進(jìn)缺血心肌的血管生成，減輕心肌組織纖維化程度。因此本實(shí)驗(yàn)引入LIPUS作為提高ADSCs-Exos療效的一種輔助方法，旨在尋求促進(jìn)血管新生的有效方法。

ADSCs較骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的增殖分化能力，其分泌的外泌體可能更高效。此外，自體干細(xì)胞來源的外泌體可有效避免體內(nèi)實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)生免疫相關(guān)的問題。基于此，本實(shí)驗(yàn)從大鼠腹股溝區(qū)提取ADSCs，通過體外培養(yǎng)后，成功提取ADSCs-Exos。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，外泌體組HUVECs的增殖、遷移能力均明顯提高，成管能力提高2倍左右，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），說明ADSCs-Exos可增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成。目前，干細(xì)胞源性外泌體促血管生成的機(jī)制尚不十分明確，大多研究［9-11］認(rèn)為與干細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)富含多種促血管生成的生物活性物質(zhì)相關(guān)，如miRNA-21、miRNA-210、miRNA-132等，可促進(jìn)下游通路中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）、基質(zhì)衍生因子、血小板衍生生長因子等蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成。ADSCs-Exos通過膜融合的方式將上述生物活性物質(zhì)帶入HUVECs的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，在一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞增殖、遷移及成管的能力。

LIPUS作為一種強(qiáng)度較低的機(jī)械能，可以在保持聲能向靶組織傳遞的同時，盡可能地降低熱效應(yīng)對機(jī)體的損害。既往研究［12］顯示，LIPUS能夠增加細(xì)胞內(nèi)一氧化氮（NO）合酶活性，通過提高NO水平，上調(diào)VEGF基因的表達(dá)，從而達(dá)到生成血管的目的。亦有研究［13］認(rèn)為這種積極作用是LIPUS通過激活促使血管生成的PI3K/Akt關(guān)鍵信號通路所實(shí)現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，輸出聲強(qiáng)為0.1 W/cm2、輻照時間為40 min的LIPUS輻照對于促進(jìn)血管生成有一定的積極作用，可將HUVECs的成管能力提高1.8倍。基于LIPUS和ADSCs-Exos的生物學(xué)效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)將二者聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其促血管生成的能力有了顯著提高，且高于單獨(dú)ADSCs-Exos和LIPUS的生物效應(yīng)之和。初步推測原因?yàn)長IPUS聯(lián)合ADSCs-Exos應(yīng)用后可能存在協(xié)同作用機(jī)制，從而實(shí)現(xiàn)促血管生成效應(yīng)。LIPUS可通過增加HUVECs內(nèi)NO合酶的活性，提高NO水平，而NO作為VEGF基因啟動子的激活劑，可增強(qiáng)外泌體中VEGF的功能表達(dá)，從而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。此外，研究［14］證實(shí)LIPUS作用于細(xì)胞時所產(chǎn)生的空化效應(yīng)可促使細(xì)胞膜表面出現(xiàn)可逆性小孔，從而使細(xì)胞膜的通透性增強(qiáng)，LIPUS在細(xì)胞周圍形成的微激流也可以增加外泌體與細(xì)胞的接觸，這些均有利于HUVECs攝入更多外泌體，從而進(jìn)一步提高血管生成的能力。

本實(shí)驗(yàn)的局限性：作為體外實(shí)驗(yàn)，未考慮外泌體輸入生物體后可能會誘導(dǎo)其他器官血管生成的問題，后期本課題組將進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，探索一種能將外泌體靶向遞送至缺血器官的方法。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過體外模擬血管生成的過程，發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用LIPUS或ADSCs-Exos均可一定程度增強(qiáng)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及成管能力，二者聯(lián)合應(yīng)用可顯著提高血管生成的能力，有望為缺血性疾病的治療提供一種新思路。