歐人豪 曾 金 韋祖巧 李 萍

廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院（柳州市婦產(chǎn)醫(yī)院、柳州市兒童醫(yī)院）藥學(xué)部，廣西柳州 545001

茵芩合劑為廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院在研制劑，由綿茵陳、黃芩、熟大黃、甘草四味中藥按傳統(tǒng)工藝制得，具有清熱利濕、退黃作用，主要用于防治新生兒黃疸。處方中綿茵陳、黃芩分別為君藥和臣藥，熟大黃為佐藥，甘草為使藥。綠原酸、咖啡酸均為綿茵陳的活性成分[1-2]，綠原酸具有保肝利膽、清除自由基等作用[3]，咖啡酸也具有一定的抗氧化、抗炎等保肝作用[4]；黃芩苷、黃芩素為黃芩的主要有效成分[5]，具有抗菌[6]、抗炎、抗氧化[7－9]和保肝利膽[10－11]等作用。為控制制劑質(zhì)量，本研究采用微乳薄層色譜法對(duì)其中綿茵陳、黃芩和熟大黃同時(shí)進(jìn)行鑒別，采用高效液相色譜法梯度洗脫對(duì)綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素同時(shí)測(cè)定，建立簡便可行的質(zhì)量控制方法。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 高效液相色譜儀（日本島津）；ZF-1 三用紫外分析儀（上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；FA1004 電子分析天平（上海天平儀器廠）；KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDZ4-WS 臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺(tái)州市路橋四甲生化塑料廠）。

1.2 試藥

綠原酸（批號(hào)：110753-201716）、大黃素（批號(hào)：110756-201512）對(duì)照品購于中國食品藥品檢定研究院；黃芩苷（批號(hào)：AF20022601）、黃芩素（批號(hào)：AF906 1605）、咖啡酸（批號(hào)：AF9060905）對(duì)照品購于成都埃法生物科技有限公司；綿茵陳（批號(hào)：121555-201602）、黃芩（批號(hào)：120955-201309）、大黃（批號(hào)：120984-201202）對(duì)照藥材購于中國食品藥品檢定研究院；綿茵陳（批號(hào)：20190519）、黃芩（批號(hào)：20190817）、熟大黃（批號(hào)：20190609）、甘草（批號(hào)：20190824）購于廣西柳州百草堂藥業(yè)有限公司中藥飲片廠；茵芩合劑為廣西壯族自治區(qū)柳州市婦幼保健院制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 溶液制備

2.1.1.1 供試品1 溶液 取樣品10 ml，3500 r/min 離心5 min，取其上清液在水浴中蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解即得。

2.1.1.2 供試品2 溶液 取樣品10 ml，3500 r/min 離心5 min，取其上清液，乙酸乙酯萃取2 次（10 ml/次），萃取液在水浴中蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解即得。

2.1.1.3 對(duì)照藥材溶液 分別取綿茵陳1 g、黃芩0.2 g、大黃0.5 g，加甲醇20 ml，超聲，濾過，濾液在水浴中蒸干至適量，得各對(duì)照藥材溶液。

2.1.1.4 對(duì)照品溶液 稱取綠原酸、黃芩苷和大黃素等標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，分別加甲醇5 ml 溶解，得各對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度均為0.2 mg/ml）。

2.1.1.5 陰性對(duì)照溶液 按處方比例稱取缺黃芩的各味藥材，照制劑制備工藝制得黃芩陰性樣品，同法分別制得綿茵陳和大黃陰性樣品。按“2.1.1.1”項(xiàng)下方法制得綿茵陳和黃芩陰性對(duì)照溶液；按“2.1.1.2”項(xiàng)下方法制得大黃陰性對(duì)照溶液。

2.1.2 微乳液制備

按質(zhì)量比稱取十二烷基硫酸鈉∶正丁醇∶環(huán)已烷∶水=2.7∶6.3∶1.0∶30.0，超聲10 min，靜置24 h 備用。

2.1.3 薄層層析

取“2.1.1”項(xiàng)下各溶液約3 μl，分別點(diǎn)樣于聚酰胺薄膜板上，取微乳液適量，按體積比9∶1 加入甲酸作為展開劑，展開7.0 cm，取出晾干。大黃素及其他大黃成分在日光下顯黃色斑點(diǎn)；置紫外線（365 nm）下綠原酸顯藍(lán)紫色熒光斑點(diǎn)；噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，日光下黃芩苷顯墨綠色斑點(diǎn)。結(jié)果顯示供試品色譜中顯示有與對(duì)照藥材和對(duì)照品位置和顏色相同的斑點(diǎn)，而各陰性對(duì)照無干擾。見圖1～3。

圖1 茵芩合劑中綿茵陳薄層色譜圖

圖2 茵芩合劑中黃芩薄層色譜圖

圖3 茵芩合劑中大黃薄層色譜圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

Diamonsil C18（2）柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈（A）-0.25%磷酸水溶液（B），梯度洗脫；流速1.0 ml/min；波長310 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μl。梯度洗脫程序：0 min，10%A；0～25 min，10%→35%A；25～35 min，35%→55%A；35～40 min，55%→10%A。

2.2.2 溶液制備

2.2.2.1 混合對(duì)照品溶液 取綠原酸、咖啡酸、黃芩素各適量，精密稱定，分別置容量瓶中，加50%甲醇制成濃度分別為綠原酸2.980 mg/ml、咖啡酸0.300 mg/ml和黃芩素0.248 mg/ml 的單一對(duì)照品貯備液；另取黃芩苷適量，精密稱定，置容量瓶中，以含1.0 μmol/L 氫氧化鈉的50%甲醇（pH 值約為6.0）制成0.510 mg/ml的黃芩苷貯備液。取以上各貯備液于50 ml 容量瓶中，加50%甲醇（不含堿）制成綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素濃度分別為59.60、6.00、408.00、19.84 μg/ml的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液 取茵芩合劑0.25 ml 于25 ml 容量瓶中，50%甲醇定容，密塞，超聲10 min，3600 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按處方比例分別制備缺茵陳和黃芩的陰性對(duì)照樣品，再按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法制得綿茵陳陰性樣品溶液和黃芩陰性樣品溶液。

2.2.3 專屬性考察

取“2.2.2”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，分別進(jìn)樣。結(jié)果顯示，四種檢測(cè)成分的色譜峰分離度較好，其他成分對(duì)測(cè)定無干擾。見圖4。

圖4 高效液相色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取混合對(duì)照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml 至5 ml 容量瓶中，以50%甲醇定容，制成系列混合對(duì)照品溶液，進(jìn)樣。以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積的1/1000（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.2.5 精密度試驗(yàn)

取同一濃度供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果顯示綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素峰面積的平均RSD 分別為0.25%、1.29%、0.10%和1.00%，提示儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一濃度供試品溶液，置室溫下，分別于0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣測(cè)定峰面積，結(jié)果顯示綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素12 h 內(nèi)峰面積的平均RSD 分別為0.42%、1.36%、0.23%和2.49%，提示供試品溶液在室溫放置12 h 內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同批次茵芩合劑6 份（批號(hào)：201021），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，進(jìn)樣，結(jié)果顯示綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素的峰面積的平均RSD 分別為1.94%、2.10%、1.72%和2.22%，提示該方法重復(fù)性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取同批次已知含量樣品6 份（批號(hào)：201021），每份0.25 ml，分別置于50 ml 容量瓶中，每份加入綠原酸對(duì)照品貯備液160 μl、咖啡酸對(duì)照品貯備液120 μl、黃芩素對(duì)照品貯備液400 μl 和黃芩苷對(duì)照品貯備液7.20 ml，以50%甲醇定容，余下操作同“2.2.2”項(xiàng)下方法，進(jìn)樣，結(jié)果見表2。

表2 茵芩合劑4 種成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.9 樣品含量測(cè)定

取3 批茵芩合劑樣品，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，結(jié)果見表3。

表3 3 批茵芩合劑樣品含量檢測(cè)結(jié)果（mg/ml）

3 討論

微乳液為微乳薄層色譜展開劑，是由表面活性劑、助表面活性劑、油和水按適當(dāng)比例自發(fā)形成的澄清透明、各向同性、低黏度的熱力學(xué)穩(wěn)定體系[12]，為達(dá)到最佳效果，必要時(shí)可加入一些改性劑如甲酸[13-14]、丙酮等[15]。微乳薄層色譜可用于鑒別黃酮類[13,16]、有機(jī)酸類、醌類[15]、酚類[17]等中藥有效成分，具有分離成分多，特別是對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物也能很好分離的特點(diǎn)。本研究使用該方法同時(shí)鑒別茵陳、黃芩和大黃3 種成分，樣品處理簡單，較傳統(tǒng)薄層色譜鑒別方法[18-20]可節(jié)省時(shí)間和試劑成本。

前期研究發(fā)現(xiàn)，配制含量測(cè)定所需的對(duì)照品溶液時(shí)，使用50%甲醇比100%或70%甲醇效果好，綠原酸峰形對(duì)稱，無肩峰出現(xiàn)。另外，由于黃芩苷在中藥材或中藥制劑中以鎂鹽的形式存在[21]，其醇溶性和水溶性均較好，而黃芩苷對(duì)照品未成鹽，難溶于甲醇，幾乎不溶于水[22]。增加黃芩苷的方法有多種[23-24]，本研究在甲醇水溶液中加入微量氫氧化鈉使黃芩苷成鈉鹽，使其完全溶解，經(jīng)考察所配制的對(duì)照品溶液在20℃左右放置12 h 或在2～8℃放置4 d 黃芩苷和其他成分含量下降只有1%左右，說明加入微量氫氧化鈉對(duì)各目標(biāo)成分的測(cè)定結(jié)果無明顯影響。

本研究采用梯度洗脫法測(cè)定綠原酸、咖啡酸、黃芩苷和黃芩素，方法簡單，重復(fù)性好，相較于以往類似處方制劑的有效成分含量測(cè)定[19-20,25]，具有檢測(cè)有效成分更多，更節(jié)約成本的優(yōu)勢(shì)，可用于優(yōu)化類似處方制劑的質(zhì)量控制。