張漢云，馮 琪，藍(lán)國文，張 杭，于高博，尚志祥，林瑞慶

（1.廣州市番禺區(qū)動物防疫監(jiān)督所，廣東 廣州 511400；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringen, Cp），又名魏氏梭菌，溫和厭氧，是革蘭氏陽性產(chǎn)芽孢粗大桿菌，經(jīng)常單個存在，有時可見偶鏈狀排列[1-3]。Cp可引起人類食物中毒、多種動物壞死性腸炎及腸毒血癥，是一種人畜共患病原菌[4]。Cp在自然界中廣泛分布，常見于土壤、污水、飼料、人和動物的腸道及糞便中，是人和多種動物胃腸道的常在菌群之一，在外界以芽孢存在，抵抗力強[5-7]。Cp主要通過產(chǎn)生毒素導(dǎo)致機(jī)體發(fā)病，也可以通過在形成芽孢過程中合成孢內(nèi)腸毒素而致病[5-9]。Cp嚴(yán)重影響畜禽的健康，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，同時對人和動物的健康造成了極大的威脅[5]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生多種外毒素和侵襲性酶類，根據(jù)其產(chǎn)生的4種主要毒素（α、β、ε和ι）[8-10]，Cp可分為A、B、C、D、E 5種類型，除此之外，最新的分類還依據(jù)腸毒素（CPE）和壞死性腸炎毒素B（NetB）增加了F和G型[11]，其中A型和C型Cp是導(dǎo)致畜禽發(fā)病的主要病原。

目前，在豬群各階段中廣泛流行的產(chǎn)氣莢膜梭菌病例中，一般認(rèn)為C型菌株是導(dǎo)致2周齡內(nèi)仔豬腸毒血癥和壞死性腸炎的主要病原，而A型菌株則與哺乳及肥育豬腸道疾病有關(guān)[12]。因此，豬產(chǎn)氣莢膜梭菌病主要是由A型或C型產(chǎn)氣莢膜梭菌引起各年齡階段豬發(fā)生的一種急性、致死性腸道傳染病。產(chǎn)氣莢膜梭菌除了引起仔豬發(fā)生高度致死性、壞死性腸炎外，近年來，由產(chǎn)氣莢膜梭菌引起肥育豬、后備種豬、懷孕母豬等猝死常有報道[2，13-14]。本研究對我國部分地區(qū)豬的產(chǎn)氣莢膜梭菌感染情況及菌株毒素分型進(jìn)行調(diào)查和分析。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2021年3—10月試驗收集了湖南、浙江、福建、廣東等4省8市的規(guī)?；B(yǎng)豬場各階段豬的新鮮糞便樣品74份和腸道樣品15份，以及采集了廣州某生豬屠宰場肝臟和肺臟樣各30份，置于密封袋里，4 ℃保存。

1.2 樣品處理

糞便和腸道樣品：取適量小腸和結(jié)腸段內(nèi)容物或適量糞便放置到含有20 mL PBS溶液的50 mL的離心管中，渦旋震蕩5 min，于室溫下靜置20 min。

肝臟和肺臟樣品：手術(shù)刀在酒精燈外焰上方灼燒后無菌烙燙肝臟和肺臟組織表面，在烙燙過的組織表面橫切一小口，用一次性接種環(huán)無菌蘸取組織樣，后把接種環(huán)置于含有20 mL PBS溶液的50 mL的離心管內(nèi)，渦旋震蕩5 min，于室溫下靜置20 min。

1.3 產(chǎn)氣莢膜梭菌的分離鑒定

在超凈工作臺中，取50 mL離心管中樣品稀釋液上清100 μL加入到含有5 mL FT培養(yǎng)基的10 mL滅菌試管中，40 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。參考生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢測方法中的微生物指標(biāo)的稀釋方法，梯度稀釋培養(yǎng)過夜的菌液，濃度依次為10-1、10-2、10-3、10-4。分別取10-2、10-3、10-4各100 μL到3個含有環(huán)絲氨酸的TSC卵黃平板中，40 ℃恒溫培養(yǎng)箱厭氧培養(yǎng)12～16 h。挑取目的菌落接種進(jìn)行增菌，提取DNA模板，經(jīng)16S rDNA PCR后1%瓊脂糖凝膠電泳，后測序鑒定陽性菌株。

1.4 引物合成及反應(yīng)條件

參考李昆等[15]文獻(xiàn)，使用由華大基因公司合成的細(xì)菌16S rDNA（27 F/1 492 r）通用引物（表1）。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52.0 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。參考趙鳳菊等[16-17]文獻(xiàn)的引物進(jìn)行毒素型分析，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，50～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30～32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物均用1%瓊脂凝膠電泳110 V，30 min檢測。

表1 7種毒素的特異性引物和細(xì)菌16S rDNA通用引物

2 結(jié)果與分析

TSC卵黃平板中周圍生長有乳白色渾濁的黑色菌落可能為產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落（圖1左），對菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，為兩端稍鈍圓粗大桿狀革蘭氏陽性細(xì)菌（圖1右），再進(jìn)一步進(jìn)行分子鑒定。

圖1 產(chǎn)氣莢膜梭菌菌落及革蘭氏染色

2.1 PCR檢測結(jié)果

149份樣品經(jīng)細(xì)菌分離培養(yǎng)純化后進(jìn)行16S rDNA PCR鑒定，31份（20.81%）呈陽性，其中10份（13.51%）來源于糞便，5份（33.33%）來源于腸道，16份（26.67%）來源于肝肺組織樣品。

產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rDNA PCR擴(kuò)增片段大小約為1 500 bp，部分樣品檢測結(jié)果如圖2所示。陽性產(chǎn)物送檢華大基因測序確認(rèn)為產(chǎn)氣莢膜梭菌。

圖2 產(chǎn)氣莢膜梭菌的PCR擴(kuò)增電泳

2.2 產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型分析

對分離鑒定后得到的31株產(chǎn)氣莢膜梭菌進(jìn)行毒素型鑒定（圖3），結(jié)果全部為A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（100%），且攜帶Cpb2毒素23株（74.19%）；未見其他型菌株。

圖3 代表性分離株的PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳

2.3 豬產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果統(tǒng)計

廣州某生豬屠宰場肝臟和肺臟樣本各30份，檢出陽性分別為9份和7份，總陽性率為26.67%。不同地區(qū)、不同階段豬糞便和腸道樣品產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果見表2—表4。

表2 不同地區(qū)糞便產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果

表3 不同地區(qū)腸內(nèi)容物產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測結(jié)果

表4 不同階段豬產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測結(jié)果

結(jié)果顯示，各個地區(qū)受檢樣品中產(chǎn)氣莢膜梭菌陽性率不等，糞便陽性率檢測最高的地區(qū)為廣東肇慶和福建龍巖，腸道檢測率最高的地區(qū)為湖南永州和浙江金華，其次為福建龍巖。

3 討論

產(chǎn)氣莢膜梭菌可引起多種人獸共患傳染病，慢性表現(xiàn)為臨床癥狀不明顯，但急性易引起多種動物的突然猝死[18]，已成為危害人類及影響?zhàn)B殖業(yè)健康發(fā)展的重要病原之一。產(chǎn)氣莢膜梭菌所分泌的外毒素和各種酶是其主要致病因素，多作用于胃腸道，造成感染動物的急性死亡，其中A型產(chǎn)氣莢膜梭菌易引起人和動物的氣性壞疽和食物中毒。

產(chǎn)氣莢膜梭菌是動物腸道潛在的條件性致病菌群之一，當(dāng)機(jī)體處于健康情況時該菌不會引起疾病，但當(dāng)動物處于亞健康狀態(tài)或各種原因引起腸道炎癥時，胃腸道的菌群平衡被打破，菌群失調(diào)，產(chǎn)氣莢膜梭菌會快速增殖并產(chǎn)生大量毒素，對機(jī)體造成損傷[19]。

飼料全面禁抗后養(yǎng)殖業(yè)尤其是在生產(chǎn)管理、環(huán)境控制以及防疫保健跟不上或不到位的豬場，極易導(dǎo)致產(chǎn)氣莢膜梭菌等條件性致病菌的增多，壞死性腸炎等細(xì)菌性疾病發(fā)病率增加，甚至導(dǎo)致豬只死亡，并易繼發(fā)其他疾病造成養(yǎng)殖風(fēng)險加大[20]。養(yǎng)殖戶除注意飼養(yǎng)管理外，更要采取相應(yīng)的預(yù)防控制措施[21]。

本試驗對不同地區(qū)豬場不同階段的豬群糞便樣品、腸道內(nèi)容物進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，不同地區(qū)豬場的不同階段豬群產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測陽性率有所不同，可能跟環(huán)境及豬群健康管理水平及樣本數(shù)有關(guān)。毒素分型結(jié)果表明，普遍為A型且廣泛攜帶Cpb2毒素。根據(jù)王苗利等[22]提到的感染A型產(chǎn)氣莢膜梭菌小鼠體內(nèi)α毒素的分布及定位研究，細(xì)菌在動物體內(nèi)大量繁殖后產(chǎn)生毒素，因α毒素具有磷脂酶C和鞘磷脂酶的活性，能破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，并隨血液循環(huán)系統(tǒng)到達(dá)宿主的特定臟器和全身，從而引起組織臟器的損傷。有研究證明，Cpb2毒素對某些細(xì)胞具有體外細(xì)胞毒性[23]。近年來很多文獻(xiàn)也表明Cpb2毒素與豬梭菌性腸炎有很大關(guān)系[24-26]。鑒于本試驗中屠宰場采集的肝肺樣品產(chǎn)氣莢膜梭菌的陽性檢出率比較高，可能因產(chǎn)氣莢膜梭菌增殖引致腸道菌群微生態(tài)平衡被打破，病原及毒素遷移到感染動物的肝、肺中，導(dǎo)致了全身性癥狀，既不利于動物的健康，同時也帶來食品安全問題，需引起關(guān)注。