吳清清,劉雯悅,王媛,官凱鋒,張慶德,劉榜,4,5,周翔,5

1.華中農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，武漢 430070； 2.農(nóng)業(yè)動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430070； 3.華中農(nóng)業(yè)大學實驗動物中心，武漢 430070； 4.生豬健康養(yǎng)殖省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070；5.湖北省地方豬品種改良工程技術(shù)研究中心，武漢 430070

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)俗稱藍耳病，是嚴重危害全球養(yǎng)豬業(yè)的傳染病之一，以母豬繁殖障礙和各年齡段豬呼吸道疾病為主要特征[1]，每年給我國生豬養(yǎng)殖帶來巨大經(jīng)濟損失[2]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)通過抑制天然免疫、延遲中和抗體產(chǎn)生等多種途徑抑制機體的免疫應答，導致病毒持續(xù)性感染，進而引起嚴重的繼發(fā)細菌感染，給其他傳染病帶來可乘之機[3]。由于PRRSV基因組具有易變性和免疫逃避能力，導致疫苗免疫效果不佳。通過抗病育種在遺傳水平增強宿主對PRRS的抗病力，是豬遺傳改良工作的重點[4]。近年來在豬PRRS抗病遺傳研究上取得了一些研究成果，如Boddicker等[5]對大白、長白雜交豬進行PRRSV人工感染試驗，通過豬基因芯片數(shù)據(jù)在4號染色體上發(fā)現(xiàn)1個影響血液病毒載量和體質(zhì)量增長的關(guān)鍵SNP 位點WUR10000125；Ser?o等[6-7]在豬7號染色體MHC區(qū)域發(fā)現(xiàn)3個SNPs可顯著影響PRRSV感染后的抗體水平。

血液指標具有非常重要的免疫應答指示作用[8]。在PRRSV感染早期，PRRSV對宿主免疫應答具有抑制作用，宿主外周血中的白細胞數(shù)、單核細胞數(shù)、淋巴細胞數(shù)、淋巴細胞百分比均顯著下降[9]。在PRRSV感染后期，機體通過激活免疫應答清除病毒，各血液參數(shù)指標逐漸恢復至正常水平[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)，中國地方品種通城豬和國外品種大白豬感染PRRSV后血液淋巴細胞數(shù)目均下降，但通城豬血液淋巴細胞百分比顯著高于大白豬，說明通城豬具有更強的免疫應答[12]。隨后以大白豬×通城豬高代橫交群體為研究對象，通過PRRSV人工感染獲取感染不同時間點的血液指標，根據(jù)PRRSV感染后第14天的個體存活情況將群體劃分為易感組和抗病組，結(jié)果顯示易感個體感染后第7天的淋巴細胞百分比極顯著低于抗病個體，且淋巴細胞百分比與血清中病毒載量顯著負相關(guān)，因此，血液中的淋巴細胞百分比可以作為PRRS抗病性的指示性狀[13]。通過檢測與血液淋巴細胞百分比顯著關(guān)聯(lián)的分子標記可在疾病發(fā)生前篩選抗病個體，為豬抗病育種提供新的分子標記。

本研究基于豬全基因組SNP芯片分型數(shù)據(jù)，與PRRSV感染前(第 0 天)和感染后第 4、7、11、14、21天淋巴細胞百分比進行關(guān)聯(lián)分析，篩選與淋巴細胞百分比顯著相關(guān)的抗病基因和分子標記，同時建立抗病性狀相關(guān)分子標記的Tetra-primer ARMS-PCR快速檢測方法，旨在為豬抗病指示性狀標記輔助選擇提供新的 SNP 分子標記和檢測方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及表型性狀檢測

試驗動物為通城縣云志生態(tài)養(yǎng)殖場的通城豬與大白豬雜交所構(gòu)建的高代(F7～F9代)橫交群體的10周齡健康斷奶仔豬，平均體質(zhì)量15 kg，共159頭，分4批次進行PRRSV人工感染試驗。感染試驗前通過前腔靜脈采血檢測豬PRRSV、圓環(huán)病毒和偽狂犬病毒抗原和抗體，所有仔豬抗原抗體均為陰性。經(jīng)過7 d預飼期后，對159頭健康仔豬按照1 mL/5 kg的劑量(滴鼻接種1 mL，余量病毒進行肌肉注射)接種HP-PRRSV病毒(PRRSV-WUH3毒株，病毒滴度為 105.0TCID50/mL)進行PRRSV人工感染試驗。在PRRSV感染前(第0天)和感染后第4、7、11、14、21天采用豬前腔靜脈采血的方法采集抗凝血(EDTA-K)和促凝血。使用南京邁瑞公司 BC-2800Vet 獸用全自動血液細胞分析儀對抗凝血進行血常規(guī)指標淋巴細胞百分比檢測[13]。促凝血用于血清分離，提取血清中病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過絕對定量PCR方法構(gòu)建標準曲線，計算血清中病毒載量，具體測定方法參見文獻[14]。其中，有72頭試驗豬(2批次)PRRSV人工感染試驗的血常規(guī)數(shù)據(jù)和病毒載量數(shù)據(jù)分別來自研究團隊中王媛等[13]和高國麗等[14]的報道。

1.2 主要試劑

2×TaqMasterMix購自深圳艾偉迪生物科技有限公司；Biowest DNA電泳瓊脂糖、Prime Script RT reagent Kit With gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；抗凝管購自山東奧塞特醫(yī)療器械公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購自Tiangen公司；氯化鈉、氯仿、異丙醇、無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 基因分型和質(zhì)量控制

利用抗凝血樣品分離白細胞，采用氯仿苯酚法提取白細胞樣品DNA，通過Thermo Scientific公司的Nanodrop 2000核酸測定儀檢測DNA濃度和純度。將質(zhì)檢合格的 DNA 樣品送至北京康普森生物技術(shù)有限公司利用“中芯一號” SNP 芯片進行基因分型。通過 PLINK v1.09 軟件對基因型數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，剔除檢出率小于95%、個體基因型缺失率大于0.1、最小等位基因頻率小于0.01以及哈代溫伯格平衡P<1×10-6的SNPs，保留37 124個SNPs進行后續(xù)分析。

1.4 抗病相關(guān)分子標記篩選及統(tǒng)計分析

根據(jù)試驗影響因素和淋巴細胞百分比進行逐步回歸分析，以批次效應、性別效應、初始體質(zhì)量作為模型協(xié)變量，可使模型AIC值最小，利用R語言的GLM軟件包中一般線性模型(general linear model，GLM)對質(zhì)控后的SNPs數(shù)據(jù)與淋巴細胞百分比使用模型(1)進行關(guān)聯(lián)分析。

Yihkl=μ+Gi+Bh+Sk+Wl+eihkl

(1)

式中，Yihkl代表性狀測定值，μ代表群體均數(shù)，Gi代表基因型效應(其中i=1，2，3)，Bh代表批次效應(其中h=1，2，3，4)，Sk代表性別效應(其中k=1，2)，Wl代表試驗感染0 d初始體質(zhì)量，eihkl代表隨機誤差。

雙基因聚合性狀關(guān)聯(lián)分析采用模型(2)進行：

Yijhkl=μ+Gi+Gj+Gi×Gj+Bh+Sk+Wl+eijhkl

(2)

式中，Yijhkl代表性狀測定值，μ代表群體均數(shù)，Gi代表第1個基因的基因型效應(其中i=1，2，3)，Gj代表第2個基因的基因型效應(其中j=1，2，3)，Gi×Gj為基因型間的互作效應，Bh代表批次效應(其中h=1，2，3，4)，Sk代表性別效應(其中k=1，2)，Wl代表試驗感染0 d初始體質(zhì)量，eijhkl代表隨機誤差。

篩選在PRRSV感染前(第0天)和感染后(第4、7、11、14、21天)6個時間點中至少有2個時間點的淋巴細胞百分比和基因型的一般線性模型顯著關(guān)聯(lián)(模型和基因型效應均顯著)的SNPs位點。利用UCSC數(shù)據(jù)庫對芯片位點在豬參考基因組Sscrofa 11.1對應位置進行轉(zhuǎn)換，并對SNPs位點所在基因及基因位置進行注釋，考慮SNPs所在基因的功能和不同基因型間的多重比較顯著性，篩選與抗病、免疫性狀相關(guān)的候選基因及分子標記。

統(tǒng)計候選SNPs在159頭PRRSV人工感染個體的基因型分布情況，利用Kruskal-Wallis檢驗方法進行多重比較分析。數(shù)據(jù)用“最小二乘均值±標準差”表示，顯著差異判斷標準為:P<0.10表示差異邊緣顯著，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。加性效應：A=(AA-BB)/2；顯性效應：D=AB-(AA+BB)/2；AA為淋巴細胞百分比均值大的純合基因型，BB為淋巴細胞百分比均值小的純合基因型，AB為雜合基因型。

1.5 引物設(shè)計及合成

根據(jù)候選SNP位點側(cè)翼500 bp序列信息，利用Tetra-primer ARMS-PCR引物在線設(shè)計程序(http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/primer1.html)進行ARMS-PCR引物設(shè)計，共設(shè)計2組引物，產(chǎn)物片段大小控制在150～600 bp[15]。針對每個SNP位點設(shè)計2條3′末端分別與SNP 2個等位基因堿基配對且延伸方向相反的內(nèi)引物和2條方向相反的外引物，同時在內(nèi)引物3′端第3位堿基引入錯配以增加擴增特異性(表1)。引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表1 ARMS-PCR引物信息 Table 1 Tetra-primer ARMS-PCR

1.6 Tetra-primer ARMS-PCR擴增

PCR反應體系20 μL：2×TaqMaster Mix 10.0 μL，2條外引物(10 μmol/L)各0.2 μL，2條內(nèi)引物(10 μmol/L)各0.8 μL，DNA模板2.0 μL(30 ng/μL)，ddH2O 6.0 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸36 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。Tetra-primer ARMS-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果并保存，根據(jù)擴增片段的大小和條帶數(shù)目區(qū)分不同基因型。

2 結(jié)果與分析

2.1 與淋巴細胞百分比顯著關(guān)聯(lián)的分子標記篩選

淋巴細胞百分比在PRRSV感染后第4天極顯著降低，并降到最低值，第4～21天逐漸回升，存活個體恢復正常水平，而死亡個體在死亡前維持較低水平。通過模型(1)對159個個體高質(zhì)量SNP芯片數(shù)據(jù)與PRRSV感染前(第0天)和感染后(第4、7、11、14、21天)6個時間點的外周血淋巴細胞百分比進行基因型和性狀的關(guān)聯(lián)分析，共篩選得到3個抗病相關(guān)候選SNPs位點(rs81257542、rs334594334、rs329240026)，其中rs334594334和rs329240026位點完全連鎖(表2)。rs81257542位點位于基因DDX17的第3內(nèi)含子，rs334594334、rs329240026位點分別位于基因BTG1的第6、7內(nèi)含子。

2.2 DDX17和BTG1單基因SNP多態(tài)性與淋巴細胞百分比的關(guān)聯(lián)分析

由于rs334594334和rs329240026位點完全連鎖，以rs334594334(BTG1)作為標簽SNP。 rs81257542(DDX17)、rs334594334(BTG1)位點多態(tài)性和PRRSV感染前(第0天)及感染后(第4、7、11、14、21天)6個時間點的淋巴細胞百分比關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表3和表4。在感染后第7天和第11天，rs81257542位點不同基因型對應的淋巴細胞百分比具有顯著差異(P<0.05)，基因型AA的表型值顯著低于基因型CA和CC個體，且3種基因型在不同時間點的淋巴細胞百分比的最小二乘均值均呈現(xiàn)基因型AATA>TT的趨勢，基因型AA對應的表型值顯著高于TA，TA顯著高于TT，等位基因A對淋巴細胞百分比具有顯著的加性效應。

表2 SNP位點基本信息 Table 2 Information of SNP loci

表3 DDX17基因rs81257542位點多態(tài)性與淋巴細胞百分比的關(guān)聯(lián)分析 Table 3 Association analysis of rs81257542 polymorphisms in DDX17 gene with lymphocyte percentage

表4 BTG1基因rs334594334位點多態(tài)性與淋巴細胞百分比的關(guān)聯(lián)分析 Table 4 Association analysis of rs334594334 polymorphisms in BTG1 gene with lymphocyte percentage

2.3 DDX17和BTG1雙基因聚合后與淋巴細胞百分比的關(guān)聯(lián)分析

通過雙基因聚合性狀關(guān)聯(lián)分析(模型(2))，DDX17和BTG1雙基因聚合基因型與PRRSV感染前(第0天)和感染后(4、7、11、14、21 d)6個時間點的淋巴細胞百分比關(guān)聯(lián)分析結(jié)果見表5。單基因模型結(jié)果顯示，C為DDX17的優(yōu)勢等位基因，A為BTG1的優(yōu)勢等位基因。根據(jù)優(yōu)勢等位基因數(shù)目，含3個及以上優(yōu)勢等位基因的基因型為優(yōu)勢合并基因型，包括CC-AA、CC-TA和CA-AA，共計63頭；含3個及以上劣勢等位基因的基因型為劣勢合并基因型，包括AA-TT、AA-TA和CA-TT，共計39頭。在感染后第7天，雙基因聚合基因型與淋巴細胞百分比顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05),其中含4個優(yōu)勢等位基因的CC-AA基因型對應的淋巴細胞百分比最小二乘均值最高(44.11%)，且與其他7種基因型均差異顯著(P<0.05)，CC-AA在其他時間點對應的淋巴細胞百分比也相對較高。劣勢合并基因型AA-TT和AA-TA對應的淋巴細胞百分比最小二乘均值最低，分別為31.83%和29.34%。

2.4 影響淋巴細胞百分比的SNPs與病毒載量關(guān)聯(lián)分析

利用本文顯著關(guān)聯(lián)的SNPs與PRRSV感染后各時間點(4、7、11、14、21 d)的病毒載量數(shù)據(jù)通過模型(1)進行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果見表6和表7。rs81257542位點的不同基因型在PRRSV感染后第4天和第7天對應病毒載量均呈現(xiàn)AA>CA>CC的趨勢，該位點等位基因C對病毒載量具有負的加性效應，與淋巴細胞百分比趨勢相反，感染后第7天不同基因型對血清中病毒載量具有顯著的基因型效應(P<0.05，表6)。rs334594334位點的不同基因型在PRRSV感染后第4天和第7天對應病毒載量均保持TT>TA>AA的趨勢，該位點等位基因A對病毒載量具有負的加性效應，與淋巴細胞百分比趨勢相反(表7)。對于感染后第4天和第7天2個時間點，2個位點的3種不同基因型對應的病毒載量表型值呈現(xiàn)的趨勢與淋巴細胞百分比趨勢相反。

表5 DDX17和BTG1雙基因聚合基因型與淋巴細胞百分比的關(guān)聯(lián)分析 Table 5 Association analysis of DDX17-BTG1 genotypes with lymphocyte percentage

表6 rs81257542位點多態(tài)性與血清病毒載量的關(guān)聯(lián)分析 Table 6 Association analysis of rs81257542 polymorphisms with viral load in serum

表7 rs334594334位點多態(tài)性與血清病毒載量的關(guān)聯(lián)分析 Table 7 Association analysis of rs334594334 polymorphisms with viral load in serum

2.5 SNP的多態(tài)性Tetra-primer ARMS-PCR快速檢測方法建立

根據(jù)Tetra-primer ARMS-PCR瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果的條帶數(shù)目和擴增片段大小可鑒定不同基因型：3種基因型均可擴增外引物目的條帶，雜合子有3條目的條帶，純合子有2條目的條帶。在rs81257542位點共檢測3種基因型：AA基因型(595/281 bp)、CC基因型(595/364 bp)、AC基因型(595/364/281 bp)；在rs334594334位點不同基因型的擴增條帶情況：AA基因型(464/194 bp)、TT基因型(464/321 bp)、TA基因型(464/321/194 bp)。擴增條帶均符合預期擴增結(jié)果，沒有非特異擴增條帶(圖1)，表明該檢測方法可以準確區(qū)分3種基因型。

A:rs81257542； B:rs334594334.圖1 rs81257542和rs334594334位點 Tetra-primer ARMS-PCR分型結(jié)果Fig.1 Genotyping results of rs81257542 and rs334594334 by Tetra-primer ARMS-PCR

3 討 論

3.1 DDX17基因多態(tài)位點與PRRS抗病指示性狀的關(guān)聯(lián)分析

DDX17是一種依賴ATP的RNA解旋酶，參與病毒mRNA合成和降解過程，在病毒入侵和復制過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。本研究通過對rs81257542位點的基因型檢測及其與PRRSV感染前(第0天)和感染后(第4、7、11、14、21天)6個時間點的淋巴細胞百分比進行關(guān)聯(lián)分析，證明了該位點多態(tài)性與PRRSV感染后第7天和第11天的淋巴細胞百分比具有顯著關(guān)聯(lián)性，且基因型效應和加性效應顯著，AA基因型個體的淋巴細胞百分比顯著低于AC和CC基因型個體。3種基因型個體在感染后第4天和第7天對應的淋巴細胞百分比和病毒載量呈現(xiàn)淋巴細胞百分比越低病毒載量越高的趨勢，這一結(jié)果與王媛等[13]的研究結(jié)果一致，其中，CC基因型個體具有最高的淋巴細胞百分比和最低的病毒載量，說明CC基因型的個體具有更強的抗病能力，該位點所含等位基因C的數(shù)目越多，抗病能力越強。

3.2 BTG1基因多態(tài)位點與PRRS抗病指示性狀的關(guān)聯(lián)分析

BTG1是抗增殖基因家族的成員之一，該基因首次在慢性B淋巴細胞性白血病上發(fā)現(xiàn)[18]，能參與細胞的增殖和分化，其抗增殖性在誘導細胞凋亡過程中具有重要的意義[19]。BTG1和BTG2下調(diào)mRNA穩(wěn)定性是T細胞靜息狀態(tài)維持的關(guān)鍵機制[20]。有研究表明B淋巴細胞的增殖活性下降可能引起PRRSV感染后期的免疫抑制和持續(xù)感染[21]。本研究中rs334594334和rs329240026位點多態(tài)性與感染前和感染后第7天的淋巴細胞百分比具有顯著關(guān)聯(lián)性，感染后第11天具有邊緣顯著的基因型效應。標簽SNP rs334594334的淋巴細胞百分比加性效應值在感染前為3.04，感染后7 d和11 d分別高達4.71和6.32，且AA基因型的淋巴細胞百分比最小二乘均值均顯著高于TA和TT基因型。AA基因型個體在PRRSV感染后第4天和第7天，具有最高的淋巴細胞百分比和最低的病毒載量，符合PRRSV感染早期淋巴細胞百分比和血清病毒載量負相關(guān)的規(guī)律[13]。以上結(jié)果說明，rs334594334位點的等位基因A為優(yōu)勢等位基因，AA為優(yōu)勢基因型，該位點所含等位基因A的數(shù)目越多，抗病能力越強，AA基因型個體具有更強抗病力。

3.3 DDX17-BTG1基因聚合效應

DDX17-BTG1基因聚合的合并基因型與PRRSV感染后第7天的淋巴細胞百分比顯著關(guān)聯(lián)，且2個SNP間的聚合效應顯著(P<0.05)。前期研究表明，PRRSV感染早期由于機體免疫抑制，會出現(xiàn)短暫的淋巴細胞減少[12-13]。感染后第7天的淋巴細胞百分比可以反映抗病和易感個體免疫應答的差異[13]。C為DDX17的優(yōu)勢等位基因，A為BTG1的優(yōu)勢等位基因，合并基因型CC-AA對應的淋巴細胞百分比的最小二乘均值最高(44.11%)，多重比較結(jié)果顯示，CC-AA與其他7種基因型具有顯著差異(P<0.05)，因此，DDX17-BTG1的最優(yōu)合并基因型為CC-AA，與單基因效應結(jié)果保持一致。劣勢等位基因較多的3種基因型(AA-TT、AA-TA和CA-TT)對應的淋巴細胞百分比均低于35%，且基因型為CA-TT的2個個體在PRRSV感染后7～11 d間陸續(xù)死亡。8種不同基因型保持優(yōu)勢等位基因越少淋巴細胞百分比越低的趨勢，優(yōu)勢的合并基因型(CC-AA、CC-TA和CA-AA)占總?cè)后w的39.6%(63/159)，劣勢的合并基因型(AA-TT、AA-TA和CA-TT)占總?cè)后w的24.5%(39/159)，可通過優(yōu)勢基因型篩選抗病個體，進一步改良群體抗病力。