張紹麗 常培培 張祿祺 段青青 王靜靜 張自坤

導(dǎo)讀：十字花科蕓薹屬作物種類繁多，各有優(yōu)勢(shì)，為了轉(zhuǎn)移和整合不同種作物的優(yōu)勢(shì)性狀，創(chuàng)造出更符合現(xiàn)代農(nóng)業(yè)需求的新品種，需要一定的制種技術(shù)來克服種間雜交障礙。本文對(duì)十字花科蕓薹屬種間遠(yuǎn)緣雜交制種技術(shù)進(jìn)行了總結(jié)，包括親本的選擇、雜交授粉、胚搶救、雜種鑒定與利用等方面，希望能為其他研究者提供一定的參考。

授粉套袋

蕓薹屬是十字花科中最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的屬[1]，包含40余個(gè)種，中國(guó)境內(nèi)有15個(gè)種和1個(gè)變種、1個(gè)變型。常見的作物如蕪菁、甘藍(lán)、白菜、芥菜分別屬于蕓薹屬下的蕓薹種、甘藍(lán)種、白菜種和芥菜種。蕓薹屬不同種作物有各自的優(yōu)勢(shì)，例如大白菜和蕪菁抗根腫病[2~4]，白菜型油菜具有營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)旺盛、早熟、抗寒、黃籽等優(yōu)點(diǎn)[5]?？梢酝ㄟ^種間遠(yuǎn)緣雜交實(shí)現(xiàn)性狀轉(zhuǎn)移，解決當(dāng)前生產(chǎn)上的問題。例如將抗根腫病、抗寒基因轉(zhuǎn)移到甘藍(lán)、油菜等作物中，能有效達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增收的目的。大部分蕓薹屬作物遠(yuǎn)緣雜交可以形成胚，但自然條件下，雜交種的胚珠會(huì)變黑、萎縮、退化，不能形成種子，因此需要進(jìn)行特定的制種操作，確保出現(xiàn)雜交后代。本文將相關(guān)技術(shù)總結(jié)如下。

1 父、母本的選擇

根據(jù)育種目標(biāo)，選擇生長(zhǎng)健壯，抗性強(qiáng)，花期可遇，具有明顯目標(biāo)性狀的品種作為父、母本。母本要求柱頭長(zhǎng)勢(shì)好，易結(jié)實(shí)。父本要求雄蕊發(fā)育正常，花粉活力強(qiáng)，且花粉量大。

2 雜交

2.1 套袋

授粉前1天，將父本植株上已經(jīng)開放的花朵全部去除，并選擇未開放的花蕾套上育種袋，用繩子扎緊，防止混合雜粉。

2.2 采集花粉

授粉當(dāng)天，選擇育種袋內(nèi)開放或者未完全開放的花朵，用鑷子將其花藥輕輕取下，放入提前準(zhǔn)備好的容器中待用?？芍糜陉帥龈稍锾?，適當(dāng)搖晃使其更好散粉。

2.3 去雄雜交

花粉采集完成后，先用鑷子將母本植株上已經(jīng)開放的花朵全部去除，再將鑷子消毒，選擇母本上已經(jīng)膨大但尚未開放的花蕾用鑷子剝開，輕輕摘除花藥，并確保柱頭干凈完整。用毛筆蘸取提前準(zhǔn)備好的花粉涂抹于柱頭上，重復(fù)2~3次，套上育種袋，掛上標(biāo)簽，記錄雜交組合和日期。

2.4 去袋

授粉4~5天后觀察，待有子房長(zhǎng)出，果莢結(jié)出，即表示授粉成功，可將育種袋去掉，使其自然生長(zhǎng)。生長(zhǎng)期間，時(shí)刻關(guān)注胚珠生長(zhǎng)情況。

3 胚搶救

3.1 取材

從授粉后第8天開始，每天挑選生長(zhǎng)健壯、發(fā)育良好的子房摘下，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行胚搶救。直至約授粉后15天，子房中的胚珠全部變黑、萎縮、退化后停止采摘。

3.2 處理培養(yǎng)

將取回的子房置于超凈工作臺(tái)上，并進(jìn)行以下操作：將子房置于無菌瓶中，用75%酒精消毒1 min，期間不停晃動(dòng)；后用無菌水沖洗1 min，用0.1%HgCl2液消毒9~12 min（根據(jù)子房大小和來源不同而有所差別）；再用無菌水沖洗3~5次，每次2~3 min，將消毒好的子房置于無菌濾紙上，用鑷子和解剖針剝離出胚珠，放入裝有1/2 MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，記錄雜交組合、子房發(fā)育時(shí)間（從授粉到胚搶救間隔時(shí)間）等，將培養(yǎng)皿放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃/23℃（白天/黑夜），不需光照。每天定時(shí)觀察胚珠發(fā)育情況，有污染的及時(shí)處理，將萌發(fā)的胚珠及時(shí)轉(zhuǎn)入MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

胚搶救

MS培養(yǎng)基中的胚珠長(zhǎng)至一定大小后，切取莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基（MS+3 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA）中進(jìn)行擴(kuò)繁，視生長(zhǎng)狀況每20~30天繼代培養(yǎng)1次。達(dá)到一定數(shù)量后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（MS+0.3 mg/L NAA）上進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)條件均為溫度25℃/23℃（白天/黑夜），光照16 h/天，光照強(qiáng)度為5 000 lx。當(dāng)根系1~2 cm長(zhǎng)時(shí)煉苗，先在培養(yǎng)瓶中加入1~2 cm深的自來水，開蓋放置2~3天，之后洗凈根部，移栽至營(yíng)養(yǎng)缽中（基質(zhì)為草炭∶蛭石∶珍珠巖=2∶1∶1），待幼苗長(zhǎng)出新根新葉，即可定植于大田中。

4 雜種后代的鑒定

4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

通過觀察雜交后代的形態(tài)學(xué)特征，包括葉片顏色，大小，有無刺毛、蠟粉，花蕾大小，花瓣顏色，植株高度等，與父、母本進(jìn)行比較，排除母本自交或與其他雜粉雜交的后代。

4.2 細(xì)胞學(xué)鑒定

通過鑒定雜種后代體細(xì)胞中染色體數(shù)量來確定是否為真雜種。于晴天9：00～10：00采取雜種植株上較小的花蕾。用0.002 mol/L 8-羥基喹啉液在常溫下避光預(yù)處理4 h，置于卡諾氏固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）中固定24 h，4℃冰箱保存，期間不定時(shí)更換固定液，直至液體清亮為止。固定后用清水清洗2~3次，用1 mol/L HCl液在60℃水浴鍋內(nèi)解離6.5 min（根據(jù)花蕾大小調(diào)整時(shí)間），再用卡寶品紅染色2 min后進(jìn)行壓片鏡檢。挑選形態(tài)較好，較為分散的分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。

5 雜種后代的利用

將篩選鑒定后的真雜種定植到大田后，依據(jù)育種目標(biāo)篩選性狀優(yōu)異的雜交后代。需要注意的是，由于是遠(yuǎn)緣雜交獲得的后代，植株的花粉很可能沒有活性或者活性較低，若需要大量繁殖，也可以通過組織培養(yǎng)進(jìn)行無性繁殖。組織培養(yǎng)幾代后就要進(jìn)行定植，防止長(zhǎng)期繼代培養(yǎng)造成基因突變和性狀退化。