周 俊，胡 犇，戢力維，馮 露，楊 林△

（1.四川大學華西醫(yī)院藥劑科，四川 成都610041；2.四川大學華西醫(yī)院線粒體與代謝實驗室，四川 成都 610041）

微針技術近年來發(fā)展迅速，已引起醫(yī)學領域的廣泛關注。微針結合了注射劑和透皮貼劑的優(yōu)點，可做到無痛、精確、微創(chuàng)、快速、方便地給藥［1?2］，根據(jù)功能分為固體微針、中空微針、涂層微針、水凝膠微針、可溶性微針五大類［3?4］。聚合物的機械性能和生物相容性均較好，可在體內降解，不會引起機體的免疫反應，可根據(jù)不同強度和功能制作符合條件的微針［5］。透明質酸鈉（SH）是透明質酸（HA）的鈉鹽，是構成人體細胞的重要組成部分［6］。純HA制備的微針，硬度大，易脆，易斷針，且不易脫模［7］。復合HA微針柔韌性相對較好，采取真空注模和真空干燥的方法制備的微針成型效果一般，仍有斷針、空針現(xiàn)象，且制備的微針為緩釋微針［8?9］。HA微針的制備工藝需摸索制備條件，有制備工藝采取真空注模方式，真空20 min，常溫干燥24 h，微針制備耗時較長，且真空設備要求較高，在無真空設備條件下，摸索離心注模的方式和適宜的干燥方法可縮短微針制作時間，制備速溶微針。相較于HA的穩(wěn)定性差、自由基敏感、機械強度差，SH的力學強度和穩(wěn)定性均增強［10］。SH的可降解性和生物相容性均好，進入皮膚不會引起炎性反應。查閱文獻，目前尚無針對SH的離心注模方法，根據(jù)文獻中其他基質的離心注模方式：離心機4 000 r/min離心10 min［11］或3 000 r/min離心30 min［12］，SH基質全部脫離模具，進入EP管底部，無法填充模具，需尋找適合SH基質的微針制備方法。本研究中以SH為可溶性微針的基質，篩選了SH微針的最佳制備工藝，并考察了微針的機械性能和體內溶解性能，開發(fā)出一種機械性能好、可生物降解的速溶微針，為后期可溶性載藥速溶微針的開發(fā)奠定基礎?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器、試劑與動物

1.1 儀器

XTL?165型體視顯微鏡（鳳凰光學股份有限公司）；VORTEX 3型漩渦混勻器（艾卡<廣州>儀器設備有限公司）；ST16R型高速離心機、Heratherm OMS100通用型烘箱（賽默飛世爾科技<中國>有限公司）；EVO 10型小型掃描電子顯微鏡（Carl Zeiss AG）；SY?2230型恒溫水浴搖床（美國精騏有限公司）；Integra 10型超純水機（成都寶賽思科技有限公司）；聚二甲基硅氧烷（PDMS）微針模具（臺州微芯醫(yī)藥科技有限公司，模具編號為Y19，針高600 μm，15×15陣列）；100 μL移液槍、1 000 μL移液槍（法國Gilson公司）；PM?996型Parafilm封口膜（美國Poli Science公司）。

1.2 試劑

SH［相對分子質量（Mr）為200 000～400 000、批號為20121746，Mr為10 000～100 000、批號為20190107），購自華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司；水為超純水。

1.3 動物

SPF級C57BL6/J小鼠，雄性，8～10周齡，體質量為22～24 g，購自成都達碩實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（川）2020?030；飼養(yǎng)于標準清潔級環(huán)境，晝夜交替光照（12 h/12 h），標準飲食，自由進食、飲水。本研究符合美國國立衛(wèi)生研究院《實驗室動物使用指南》規(guī)定，并通過四川大學實驗動物倫理委員會審查。

2 方法與結果

2.1 SH溶液制備

取10 mL超純水，置15 mL塑料離心管中，緩慢加入稱量的SH，漩渦1 min，放入恒溫搖床（37℃，1.0 h），SH完全溶解，離心（4 500 r/min）1 min，除去氣泡，放入4℃冰箱保存，備用。按上述方法分別配制Mr為10 000～100 000和200 000～400 000的10%SH溶液。

2.2 微針制備

用移液槍吸取100μL配制好的SH溶液，作為微針針尖部分，均勻平鋪在聚二甲基硅氧烷微針模具上，放入離心機離心，使SH溶液填滿微針模具針孔，再吸取400 μL配制好的SH溶液，作為微針基底部分，均勻平鋪在微針模具上。待微針完全干燥后脫模，即得。

2.3 針尖基質和離心條件篩選

將鋪好SH溶液的微針模具放入離心機，設置離心溫度為4℃，轉速為4 200 r/min，調節(jié)每次離心時間、離心次數(shù)、針尖部分基質，觀察微針填充完整度、有無氣泡，篩選離心填充微針的最佳條件。篩選結果為針尖部分基質選取10%SH（Mr為200 000～400 000），離心溫度4℃，轉速4 200 r/min，離心3次，每次30 s，可得到填充完好的微針。針尖基質和離心條件篩選結果見表1。

2.4 基底基質和干燥條件篩選

將針槍填充完整并加入基底溶液后，置40℃恒溫干燥箱中干燥，調節(jié)基底部分基質和干燥時間（見表2）。觀察干燥情況，根據(jù)針形、表面平整度選取最佳條件。由圖1可知，基底基質選取10%SH（Mr為200 000～400 000）干燥效果不好，片基彎曲嚴重（見圖1 A和圖1 B1），針尖被拉伸嚴重（見圖1 B2）；基底基質選取10%SH（Mr為10 000～100 000）干燥均勻，片基平整（見圖1 C1），針尖成型良好（見圖1 C2）。根據(jù)圖1和表1，篩選出最佳條件：基底部分基質選取10%SH（Mr為10 000～100 000），干燥溫度40℃，干燥2.0 h。

表1 微針針尖基質和離心條件篩選Tab.1 Screening of microneedle matrix and centrifugal conditions

表2 基底基質和干燥條件篩選Tab.2 Screening of basal matrix and drying conditions

2.5 微針視覺形態(tài)評價

按最佳方法制備SH微針，分別通過視覺直觀、光學顯微鏡、掃描電鏡進行觀察，詳見圖2。制備的SH微針呈圓錐形，根據(jù)掃描電鏡圖上的比例尺可大致得出每根微針高度約600 μm，基部寬度為260 μm，針尖成型良好，針型完整，無氣泡，無拉伸現(xiàn)象，SH微針呈白色透明狀，整體上無空針、斷針現(xiàn)象。

A.基底基質為10%SH（Mr為200 000～400 000）、干燥2.0 h、微針未取下模具的正面B1?B2.基底基質為10%SH（Mr為200 000～400 000）、干燥2.0 h、微針未取下模具的側面及微針局部放大C1?C2.基底基質為10%SH（Mr為10 000～100 000）、干燥2.0 h、微針的正面直觀及微針局部放大圖1不同基底基質干燥2.0 h后SH微針直觀圖A.The front image of the microneedle with basal matrix of 10%SH（Mr is in the range of 200 000?400 000）and drying for 2.0 h before it is removed from the mold B1?B2.The side image and partial enlargement image of the microneedle with basal matrix of 10%SH（Mr is in the range of 200 000?400 000）and drying for 2.0 h before it is removed from the mold C1?C2.The front image and partial enlargement image of the microneedle with basal matrix of 10%SH（Mr is in the range of 10 000?100 000）and drying for 2.0 hFig.1 Horizontal images of SH microneedles with different basal matrixs after drying for 2.0 h

A.刺入小鼠腹部皮膚B?E.刺入小鼠皮膚后1，3，5，10 min時的針尖溶解狀態(tài)圖4 SH微針體內溶解試驗結果A.Microneedles pierced the abdominal skin of the mouse B?E.Dissolution state of microneedles at 1，3，5 and 10 min after penetrating into mouse skinFig.4 Results of the in vivo dissolution test of SH microneedles

A.正面直觀圖B.光學顯微鏡圖C.掃描電鏡圖圖2 SH微針視覺形態(tài)A.Front image B.Optical microscope image C.Scanning electron microscope imageFig.2 Visual morphology of SH microneedles

A.封口膜背面（未取出封口膜上的微針）及局部放大B.封口膜正面（取出封口膜上的微針）圖3 SH微針封口膜穿刺試驗結果A.Backside image and partial enlargement image of the parafilm（microneedles on the parafilm has not been removed）B.Front image of the parafilm（microneedles on the parafilm has been removed）Fig.3 Results of the puncture test of SH microneedle parafilm

2.6 微針機械性能測試

采用封口膜穿刺試驗，考慮到皮膚具有彈性，故選用3層Parafilm封口膜模擬皮膚。Parafilm封口膜疊加的層數(shù)代表不同厚度的皮膚，本研究中以拇指用一定的力度，將微針垂直按壓在封口膜上3 min后，顯微鏡下觀察微針是否穿過封口膜和穿過封口膜的微針數(shù)，評價微針的機械性能。微針針尖清晰可見，詳見圖3。

2.7 體內溶解試驗

取C57BL6/J小鼠腹部皮膚脫毛，取按最佳方法制備的SH微針，拇指以一定力度按壓，將SH微針垂直刺入皮膚，分別于1，3，5，10 min時拔出SH微針，并觀察其在體內的溶解狀態(tài)。由圖4可知，制備的SH微針能穿破小鼠皮膚，且刺入皮膚10 min后的針體完全溶解；根據(jù)不同時間段拔出的SH微針針尖可以看出，微針插入皮膚無斷針，柔韌性好，不易斷裂。

3 討論

3.1 針尖基質選擇

10%SH（Mr為10 000～100 000）針 尖 基 質 較10%SH（Mr為200 000～400 000）的黏度低，流動性強，離心過程中容易脫模而進入塑料離心管底部，填充效果差，故選取黏度相對更大、流動性相對更低的10%SH（Mr為200 000～400 000）作為針尖基質，填充效果好。且以10%SH（Mr為200 000～400 000）作為針尖基質制備的微針，針型完整，能100%脫模，無斷針、空針現(xiàn)象；針尖強度良好，能穿破皮膚，相較于純HA微針，SH微針插入體內無斷針，柔韌性好，不易斷裂；相較于復合HA微針，SH微針在體內10 min即可快速溶解，制備載藥微針可達到快速釋藥的目的；若裝載緩釋微球，可制備快速溶解的緩釋微針，且微針不用一直貼于皮膚表面，微針溶解后即可取下貼于皮膚表面的微針基底。僅需制備SH 1種基質即可，相較于復合基質，減少了藥物與基質間的相互作用，SH溶液配制簡便，耗時短，條件易控。

3.2 基底基質選擇

10%SH（Mr為200 000～400 000）基底基質在40℃下干燥，容易翹邊，針尖部分還未干燥就已被拉伸，造成針尖成型差，不利于微針的制備，可能是SH（Mr為200 000～400 000）分子質量過大，微針受熱不均勻造成。故選取分子量相對更小的10%SH（Mr為10 000～100 000）作為基底基質制作微針，得到片基平整、針尖成型良好的SH微針。

3.3 制備工藝

針尖填充：溫度4℃，離心轉速4 200 r/min，離心3次，每次30 s。相較于其他針尖填充方法，如離心轉速4 000 r/min、離心10 min［11］，轉速3 000 r/min、離心30 min［12］，真空注模真空20 min［13］，超聲注模超聲30 min［13］，設備要求簡單，操作簡便，耗時短，填充效果較好。篩選的干燥方法：恒溫干燥，溫度40℃，干燥2.0 h。相較于其他微針干燥方法，干燥器干燥24 h［12，14?15］，本研究中篩選的方法簡單，耗時短，干燥效果較好。

3.4 后期載藥

本研究中制備的是空白微針，SH微針可快速溶解釋藥，溶解時間為10 min。后期可裝載藥物制備載藥微針，裝載可溶性藥物，制備可溶性微針，可在刺穿皮膚后達到快速釋藥的效果；裝載緩釋微球，制備的微針可在刺穿皮膚時快速釋放微球，微球在體內又可緩慢釋藥，同時可起到緩釋給藥的作用，且微針不用一直貼于皮膚表面。

3.5 制備方法評價

該微針制備工藝僅需離心機和烘箱即可，操作簡單，且微針制備耗時短，短時間內可制備多批次。制得的微針針型完整，100%脫模，無斷針、空針現(xiàn)象；針尖韌性好，可刺穿皮膚，溶解快速。制備條件溫和，制備過程中溫度維持在4～40℃，利于載藥過程中藥物保持穩(wěn)定，為后續(xù)可溶載藥微針和中藥載藥微針的開發(fā)奠定了基礎。