李 丹， 楊紀(jì)琛， 孫煒鈞， 李 瀟， 雷浩俊， 韋新蓉， 陳紅星， 謝凌天

(1. 上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)， 上海 201418； 2. 華南師范大學(xué)環(huán)境研究院/廣東省化學(xué)品污染與環(huán)境安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/華南師范大學(xué)環(huán)境理論化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510006； 3. 華南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院， 廣州 510006)

硒是人體生理必需的14種微量元素之一，在維持免疫、刺激生長和繁殖等各種功能上具有重要作用[1-2]。硒在地殼中含量很低且分布不均[3]，但工農(nóng)業(yè)活動(dòng)(如廢棄物排放、礦業(yè)開采、冶煉、加工運(yùn)輸、施肥及灌溉等)可能導(dǎo)致硒被大量排放到受納水體中，主要以高可溶性無機(jī)硒(即亞硒酸鹽(Se(Ⅳ))和硒酸鹽(Se(Ⅵ)))和有機(jī)硒(硒代蛋氨酸 (Se-Met)、硒代半胱氨酸 (Se-Cys) 和其他有機(jī)硫化合物的硒取代類似物)形態(tài)存在[4-5]。硒被排放到水環(huán)境后，容易吸附在沉積礦物質(zhì)和有機(jī)物的表面上[6]，使沉積物成為硒的主要源和匯[7]。

天然沉積物中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.08～39 μg/g范圍，其平均值約1.0 μg/g[8-11]，而美國Belews湖和Kesterson水庫沉積物中硒的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)100 μg/g和210 μg/g，主要以Se(Ⅳ)形態(tài)存在[8,12]。硒在沉積物中可以通過底棲生物的攝食行為進(jìn)入食物鏈，在更高營養(yǎng)級(jí)的水生生物體內(nèi)累積并造成毒性效應(yīng)，包括致畸性[13]、神經(jīng)毒性[14]、氧化應(yīng)激[15]和異常行為[16]等。前期研究表明底棲無脊椎動(dòng)物具有富集硒的能力，某些類群最高硒積累可達(dá)370 μg/g dw[8]，從而使水體中其他攝食底棲生物的高營養(yǎng)級(jí)生物受到硒的危害。但目前對(duì)于沉積物中硒在底棲生物中的富集及對(duì)其產(chǎn)生毒性效應(yīng)的機(jī)制研究較少。

本文主要研究：(1)沉積物中最常見的無機(jī)硒形態(tài)Se(Ⅳ)在環(huán)境相關(guān)濃度下對(duì)底棲模式生物夾雜帶絲蚓(Lumbriculusvariegatus)的生物有效性；(2)沉積物中Se(Ⅳ)的暴露對(duì)夾雜帶絲蚓體內(nèi)硒形態(tài)分布的影響；(3)沉積物中Se(Ⅳ)的暴露對(duì)夾雜帶絲蚓的Na+/K+-ATP酶、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及消化系統(tǒng)的影響。本研究結(jié)果可為底棲環(huán)境中硒污染的預(yù)防和檢測提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

亞硒酸鈉(Se(Ⅳ)，純度>99%)購買自沈陽瑞豐精細(xì)化工有限公司，其他所有試劑均購自廣州化學(xué)試劑廠。所有玻璃器皿均用50%硝酸清洗、去離子水漂洗3次，70 ℃下烘干后使用。

夾雜帶絲蚓由華南師范大學(xué)水生毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)得到，每天飼喂1次約100 mg的孔雀魚飼料(硒的背景值見表1)。在實(shí)驗(yàn)開始之前，隨機(jī)選擇大約300條大小相近(濕質(zhì)量(4.0±0.5) mg，體長(22.0±2.0) mm)的夾雜帶絲蚓成體，在光照14 h與黑暗10 h的光暗循環(huán)和(26±1) ℃的溫度下，將夾雜帶絲蚓 (Lumbriculusvariegatus，硒的背景值見表1) 培養(yǎng)在放有沉積物(深度約2 cm)和經(jīng)過碳過濾的脫氯自來水(體積為12 L)的玻璃容器(容積為18 L)中，在沒有食物和曝氣的情況下馴化7 d。

表1 曝氣水、沉積物、魚飼料和夾雜帶絲蚓中不同形態(tài)硒的背景值Table 1 The background concentrations of different Se species in the exposure medium,sediments,fish food and L. variegatus

1.2 硒沉積物暴露

沉積物取自黑龍江省松花江上游(45.8oN，126.5oE)，在-20 ℃下儲(chǔ)存數(shù)周以上，以消除所有不可見的底棲生物。在加標(biāo)前，去除上覆水，在室溫(25 ℃)下解凍后對(duì)沉積物進(jìn)行濕篩(500 μm)[17]。沉積物的有機(jī)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(6.2±0.1)%，粉砂/粘土質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(76.8±1.3)%，砂質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(15.4±0.7)%，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(51.7±0.2)%(平均值±SE，n=3)。

實(shí)驗(yàn)前，通過電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)對(duì)松花江沉積物中總硒的背景值進(jìn)行了定量(表1)。沉積物中不同Se形態(tài)的背景值通過高效液相色譜(HPLC)結(jié)合ICP-MS進(jìn)行鑒定(表1)。

將100 g烘干過篩后的沉積物分配到酸洗過的玻璃燒杯中(容積為500 mL)，根據(jù)硒在沉積物中的環(huán)境相關(guān)濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，全文同)，分別設(shè)置低濃度組、中濃度組、高濃度組(即3個(gè)處理組)，為了表述方便，稱其為低、中、高濃度組。Se的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3、10、30 μg/g，在攪拌下將Se(Ⅳ)添加到每個(gè)容器中，加入約150 mL的曝氣水作為上覆水，放置24 h達(dá)到平衡。每個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)加入25條夾雜帶絲蚓，在加入到沉積中物之前對(duì)25條帶絲蚓統(tǒng)一稱其質(zhì)量并記錄。實(shí)驗(yàn)期間監(jiān)測溫度、氧飽和度、pH以及總氨質(zhì)量濃度。在加入硒的第1、2、3、4、5、6、7、14、21 d從4個(gè)容器中取出3份沉積物(每份沉積物40 mg)和上覆水(每份上覆水樣品2 mL)樣品，測定沉積物和上覆水中的硒在20 d內(nèi)的形態(tài)和總量的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)生物從沉積物中篩選出，稱其質(zhì)量并記錄數(shù)量，其他所有樣品在-80 ℃冷凍保存，用于后續(xù)相關(guān)生化分析。

1.3 總硒及硒形態(tài)的檢測

上覆水樣品用微孔聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(孔徑0.22 μm，ANPEL，上海)過濾，并使用微波消解儀(型號(hào) MARS6 240/50，CEM公司，美國北卡羅來納州)在HNO3中165 ℃下消解30 min。將沉積物樣品凍干約24 h至恒定質(zhì)量，然后加入10 mL混合酸(5 mL HF、3 mL HNO3和2 mL HCl)中消解，在微波消解儀中190 ℃下消解40 min。解凍的夾雜帶絲蚓樣品(無干燥過程)加入8 mL HNO3后在微波消解儀中消化，190 ℃下消解40 min。消化物用超純水進(jìn)一步稀釋至最終體積為50 mL，用微孔PVDF膜過濾后，使用ICP-MS測定總硒。ICP-MS 的操作參數(shù)：射頻功率為1 200 W，等離子氣體流量15 L/min，載氣流量1 L/min，氦氣流量5 mL/min，采樣深度6 mm，八極桿偏置-18 V，能量鑒別5 V，單位質(zhì)量積分時(shí)間0.3 s，監(jiān)測的同位素包括78Se和82Se。標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)(SRM)(GBW10024，GBW07309，國家有證參考物質(zhì)研究中心，中國北京)用于測定總硒的回收率，SRM中硒的回收率分別為101%和99%。其他QA/QC包括加標(biāo)樣品和酸空白。以每5個(gè)樣品中取1個(gè)的比率分析空白。

將每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中約20.0 mg的沉積物樣品轉(zhuǎn)移到裝有20 mL EDTA(4 mmol/L，pH 7.5)的容積為50 mL的離心管中，并在40 ℃下以100 r/min 的轉(zhuǎn)速在振蕩器上振搖10 h，隨后在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，上清液用微孔PVDF膜過濾[18]，使用HPLC-ICP-MS分析樣品中的硒形態(tài)。在每個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，取3條夾雜帶絲蚓(約10 mg)樣品在1 mL Tris-HCl緩沖液(30 mmol/L，pH 7.5,含1.4 mmol尿素和2 mg脂肪酶)中勻漿后，搖動(dòng)1 h。加入4 μL 0.5 mol二硫蘇糖醇和16.5 μL 0.5 mol碘乙酰胺后，將溶液在25 ℃下避光孵育。1 h后，加入22.5 μL二硫蘇糖醇溶液，振蕩1 h。加入2 mg型蛋白酶，將樣品在轉(zhuǎn)速為60 r/min的搖床上37 ℃避光孵育20 h。經(jīng)過酶水解后，提取物以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min[19]。上清液用微孔PVDF濾膜過濾，使用HPLC-ICP-MS分析樣品中的硒形態(tài)。使用Agilent 1260 Infinity Ⅱ Ultra Performance LC系統(tǒng)(Agilent,USA)在Hamilton PRP-X100+色譜柱(4.1×250 mm,10 μm,Hamilton,USA)上分離樣品中不同形態(tài)的硒。流動(dòng)相為6 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液 (pH 5.0)，流速為1.5 mL/min，溫度25 ℃。ICP-MS的條件與測定總硒的條件相同。進(jìn)樣量為50 μL。本研究的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.04和0.05 μg/L。水樣的回收率為102%，沉積物樣品的回收率為96%，生物樣品的回收率為87%。

1.4 生化指標(biāo)檢測

每個(gè)重復(fù)取3條夾雜帶絲蚓混合，用20 mmol Tris-HCl緩沖液(0.5 mol蔗糖，0.075 mol KCl，1 mmol MDTT，1 mmol EDTA，pH 7.6)勻漿。在4 ℃ 3 000g條件下，離心15 min，按照試劑盒用酶標(biāo)儀測定過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)與胰蛋白酶、糜蛋白酶的活性以及總蛋白、丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)的含量。試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，并通過 Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)檢查正態(tài)性，通過Levene 檢驗(yàn)檢查方差的同質(zhì)性。未檢測到與正態(tài)性或同方差性的顯著偏差。進(jìn)行單向方差分析 (ANOVA)，然后進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)，以檢測處理之間的差異。在P<0.05時(shí)接受統(tǒng)計(jì)顯著性。使用 SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與討論

在對(duì)照組、低濃度組、中濃度組和高濃度組中，沉積物初始總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.25±0.00、3.25±0.00、10.25±0.00、30.25±0.00 μg/g干質(zhì)量，上覆水中初始總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.81±0.01、52.6±1.39、225.7±5.25、614.9±3.22 μg/L。在不同處理組中Se(Ⅳ)、Se(Ⅵ)、Se-Met和Se-Cys的質(zhì)量分?jǐn)?shù)見表2。在暴露21 d后，并無生物死亡。

表2 不同處理組沉積物中不同形態(tài)硒的初始實(shí)測值Table 2 The initial concentrations of different Se species in all treatments

2.1 硒的形態(tài)分布

2.1.1 沉積物和上覆水中的硒 在Se(Ⅳ)處理的沉積物中，總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)在前7 d急速下降(范圍-23.53%～-36.00%，負(fù)號(hào)表示下降，下同)，后續(xù)下降緩慢并趨于穩(wěn)定(圖1A)。在Se(Ⅳ)處理的沉積物上覆水中，總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢與沉積物中的相似，在前7 d急劇下降，尤其是高濃度組(圖1B)。Se(Ⅳ)處理的在沉積物和上覆水中主要以Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)為主，而且Se(Ⅳ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化趨勢和總硒的相似(圖2)。有趣的是，在中、高濃度組，Se(Ⅵ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在前3 d急速增加，然后快速下降至第7 d后平緩下降(圖2C、D)。而上覆水中Se(Ⅵ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)于沉積物呈延遲效應(yīng)，在前6 d上升，第7 d開始下降，至21 d干質(zhì)量接近于0 μg/g(圖2G、H)。

圖1 沉積物及上覆水中總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨時(shí)間的變化Figure 1 The variations of total Se concentrations in the sediments and overlying water with time注：分析中n=3，全文同。

圖2 沉積物及上覆水中硒形態(tài)的變化Figure 2 The variations of Se species in the sediments and overlying

硒在天然水體中的沉積物或上覆水系統(tǒng)中約占98%，其中硒在沉積物中約占90%[7]，因此，硒在沉積物或上覆水中的動(dòng)態(tài)平衡不可忽視。Se(Ⅳ)對(duì)沉積物中的有機(jī)質(zhì)、粘土礦物和鐵氧化物具有較高的吸附性[20]，是沉積物中主要的無機(jī)硒形態(tài)，且具有適中的氧化還原電位[21]。在中、高濃度組中，在前3 d Se(Ⅵ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升可能由于夾雜帶絲蚓受高質(zhì)量分?jǐn)?shù)Se的脅迫作用而在沉積物中頻繁攪動(dòng)，進(jìn)而提升上覆水中Se(Ⅵ)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，同時(shí)沉積物中的含氧量增加，導(dǎo)致Se(Ⅳ)被氧化成Se(Ⅵ)。第3 d以后，帶絲蚓適應(yīng)暴露環(huán)境后，Se(Ⅵ)質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降而減小?？偽|(zhì)量分?jǐn)?shù)的下降可能由于隨著暴露時(shí)間的延長，沉積物中Se(Ⅳ)被還原成元素硒或者氣態(tài)硒化物[1,22]。

2.1.2 夾雜帶絲蚓中的硒 當(dāng)暴露在Se(Ⅳ)環(huán)境21 d后，夾雜帶絲蚓體內(nèi)總硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨著暴露質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增大，在體內(nèi)主要以Se-Met和Se-Cys這2種硒形態(tài)為主(圖3)。結(jié)果表明：Se(Ⅳ)進(jìn)入生物體內(nèi)可以迅速發(fā)生生物轉(zhuǎn)化生成Se-Met和Se-Cys，這可能是由于無機(jī)硒可以迅速與體內(nèi)的蛋氨酸和半胱氨酸結(jié)合[23]，但是具體轉(zhuǎn)化機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

圖3 夾雜帶絲蚓中總硒和硒形態(tài)的變化Figure 3 The variations of total Se concentrations and Se species in the L. variegatus

帶絲蚓對(duì)沉積物中硒的BAF數(shù)值在低、中、高濃度組中分別為8.00±1.11、7.89±0.90和4.59±0.41(圖4)。有趣的是，低、中濃度組中夾雜帶絲蚓對(duì)沉積物中硒的BAF數(shù)值是高濃度組中的2倍。

圖4 夾雜帶絲蚓體內(nèi)硒的生物富集系數(shù)Figure 4 Bioaccumulation factors of Se in the L. variegatus

對(duì)比BAF數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，夾雜帶絲蚓在沉積物中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于10 μg/g時(shí)富硒能力相似，但是當(dāng)沉積物中硒質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)可能損傷夾雜帶絲蚓體內(nèi)的一些生化指標(biāo)(如離子通道、氧化應(yīng)激和消化系統(tǒng)等相關(guān)酶)。因此，沉積物中高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的硒會(huì)降低底棲生物對(duì)硒的富集能力。例如，在沉積物中硒暴露正顫蚓(1.2 μg/g Se(Ⅳ))、夾雜帶絲蚓(20 μg/g Se(Ⅳ))和霍甫水絲蚓(40 μg/g Se(Ⅳ))14 d后，其對(duì)沉積物中硒的BAF分別為5.92、0.55和0.70[1,17,24]。

2.2 硒暴露對(duì)夾雜帶絲蚓體內(nèi)Na+/K+-ATP酶的影響

當(dāng)暴露在Se(Ⅳ)中21 d后，夾雜帶絲蚓體內(nèi)Na+/K+-ATP酶的活性隨著Se(Ⅳ)暴露質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0～30 μg/g (Se))逐漸降低(-14.62%、-24.55%、-54.24%)(圖5)。與前期研究結(jié)果相似，夾雜帶絲蚓在含Se質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20 μg/g的Se(Ⅳ)中暴露14 d，Na+/K+-ATP酶的活性也顯著下降[17]。也有研究表明，Se(Ⅳ)抑制小鳉魚體內(nèi)Na+/K+-ATP酶的活性[25]。此外，高濃度組中Na+/K+-ATP酶的活性與低、中濃度組具有顯著差異性，與BAF的變化趨勢相同。重金屬通過主動(dòng)運(yùn)輸進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部需要消耗三磷酸腺苷(ATP)酶來提供逆濃度運(yùn)輸所需要的能量，而硒能夠氧化ATP酶分子中的巰基，抑制ATP酶的活性[17,26]。因此，沉積物中高濃度Se(Ⅳ)可能損傷帶絲蚓的Na+/K+-ATP酶，進(jìn)而影響帶絲蚓對(duì)硒的吸收能力。

圖5 硒暴露對(duì)夾雜帶絲蚓Na+/K+-ATP酶的影響Figure 5 The effect of Se on the Na+/K+-ATP enzyme activities of L. variegatus

2.3 硒暴露對(duì)夾雜帶絲蚓抗氧化系統(tǒng)的影響

當(dāng)暴露在Se(Ⅳ)中21 d后，夾雜帶絲蚓體內(nèi)過氧化氫酶的活性不受影響(圖6 A)，而帶絲蚓體內(nèi)的谷胱甘肽和脂質(zhì)過氧化水平(丙二醛的質(zhì)量分?jǐn)?shù))隨著Se(Ⅳ)暴露質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0～30 μg/g Se)逐漸升高，如圖6B(5.25%、36.58%、42.1%)和圖6D(7.96%、135.10%、500.29%)，谷胱甘肽過氧化物酶隨著Se(Ⅳ)暴露質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大而逐漸降低(44.17%、75.42%和91.80%，圖6C)。研究表明：霍甫水絲蚓和夾雜帶絲蚓暴露于20 μg/g Se(Ⅳ)中14 d后，體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平也均顯著升高[17,27]。

圖6 硒暴露對(duì)夾雜帶絲蚓抗氧化系統(tǒng)的影響Figure 6 The effect of Se on the oxidative stress of L. variegatus

2.4 硒暴露對(duì)夾雜帶絲蚓消化系統(tǒng)的影響

Se(Ⅳ)暴露帶絲蚓21 d后，相對(duì)于空白對(duì)照組，夾雜帶絲蚓的肥滿度在低、中濃度組中輕微升高，而在高濃度組中下降，但并沒有顯著差異性(圖7A)，與夾雜帶絲蚓體內(nèi)胰蛋白酶的活性和糜蛋白酶的活性呈現(xiàn)趨勢相似(圖7B～C)。在高濃度組中，硒顯著降低了夾雜帶絲蚓體內(nèi)胰蛋白酶的活性(-12.47%)(圖7B)。對(duì)于糜蛋白酶，高濃度的硒增加了夾雜帶絲蚓體內(nèi)糜蛋白酶的活性(+122.51%)；而在中、高濃度組中，夾雜帶絲蚓體內(nèi)糜蛋白酶的活性顯著降低了75.53%和91.03%，呈現(xiàn)“低促-高抑”現(xiàn)象(圖7C)。

圖7 硒暴露對(duì)夾雜帶絲蚓肥滿度及消化系統(tǒng)的影響Figure 7 The effect of Se on the condition factor and the digestive system of L. variegatus

胰蛋白酶和糜蛋白酶都是可以參與蛋白質(zhì)氨基酸代謝的活化酶，通過把生物消化道內(nèi)的蛋白質(zhì)分解為氨基酸，使蛋白質(zhì)被機(jī)體吸收和利用[28]。一些研究表明重金屬可以降低水生生物體內(nèi)的胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。例如：鎘(10 μg/L)暴露48 h后，大型溞體內(nèi)胰蛋白酶活力明顯降低[29]；鎘(1.45 mg/L)暴露河南華溪蟹21 d后，腸道內(nèi)胰蛋白酶活力顯著降低[30]。此外，硒可能導(dǎo)致體內(nèi)產(chǎn)生過量的ROS，進(jìn)而降低糜蛋白酶的活性[31]。夾雜帶絲蚓體內(nèi)消化酶活力的降低會(huì)直接影響大分子物質(zhì)的分解，消化能力變?nèi)鯐?huì)降低機(jī)體對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而影響其生長發(fā)育，間接反映重金屬對(duì)底棲生物的危害程度。因此，高濃度硒明顯抑制夾雜帶絲蚓體內(nèi)的胰蛋白和糜蛋白酶活力，對(duì)機(jī)體消化系統(tǒng)造成損傷，降低其肥滿度。

3 結(jié)論

硒在環(huán)境相關(guān)濃度下可以在夾雜帶絲蚓體內(nèi)有效累積，在體內(nèi)主要以Se-Met和Se-Cys為主。隨著沉積物中硒的濃度增加，增加帶絲蚓體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、降低Na+/K+-ATP酶以及消化系統(tǒng)相關(guān)酶活性，從而抑制帶絲蚓的肥滿度以及對(duì)沉積物中硒的生物富集能力。此外，本研究結(jié)果可以為硒在底棲生物中的累積及其形態(tài)的分布，以及毒性效應(yīng)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為水生生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)、水產(chǎn)品的食品安全及水環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)完善提供重要的理論依據(jù)。