趙艷爭 陳凱 王學菊 天津市北辰醫(yī)院 （天津 300134）

內容提要：目的：探究兩種免疫檢驗方法檢測乙肝病毒感染血清標志物的應用效果，為臨床實踐提供理論依據(jù)。方法：以200例乙肝病毒感染患者為對象，研究時間為2019年12月～2020年12月，分為參照組100例、研究組100例，參照組應用酶聯(lián)免疫吸附法酶聯(lián)免疫吸附法診斷，研究組應用化學發(fā)光免疫分析法檢測，對比診斷結果。結果：研究組乙肝e抗體陽性率、乙肝表面抗原陽性率均高于參照組，差異P<0.05。研究組乙肝e抗原陽性率、乙肝核心抗體陽性率、乙肝e抗原陽性率與參照組比較，差異P>0.05。結論：乙肝病毒感染患者可采用化學免疫發(fā)光法檢測乙肝標志物，有效提高診斷準確率，可及時檢出疾病，促進疾病的治療。

乙型病毒性肝炎即乙肝，是感染乙肝病毒而引起的傳染病，廣泛流行，具有較高發(fā)病率，對人們的身體健康產生嚴重危害。研究數(shù)據(jù)表明[1]，我國乙肝病毒表面抗原攜帶者發(fā)病率約為7.18%，且患者數(shù)量逐年增多。乙肝在早期癥狀不明顯，極易發(fā)展為慢性感染、肝硬化、原發(fā)性肝癌，威脅患者的生命健康。當前，臨床在診斷乙肝患者時多采用乙肝病毒血清標志物，聯(lián)合五項診斷，即抗-HBc、抗-HBe、HBeAg、抗-HBs、HBsAg，依據(jù)診斷結果組合模式，判斷體內HBV復制情況與傳染性大小，在疾病的治療與臨床分期中均具有重要意義。酶聯(lián)免疫法可對血清乙肝抗體進行測定，具有較高敏感度，且特異性很高，為乙肝重要的診斷依據(jù)之一[2]?；瘜W發(fā)光免疫法是一種通過檢測抗體標記物質發(fā)光的技術，檢測乙肝抗體標志物具有較高靈敏度，且選擇性良好[3]。當前，臨床缺乏兩種不同免疫檢驗方法檢測乙型肝炎病毒感染血清學標志物有關研究，基于此，本文將以近年來（2019年12月～2020年12月）200例乙肝患者為對象，探究兩種不同免疫檢驗方法檢測乙型肝炎病毒感染血清學標志物的臨床效果。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

研究對象為200例乙肝確診患者，研究時間自2019年12月～2020年12月，分為參照組100例、研究組100例。納入標準：以《病毒性肝炎防治方案》有關診斷標準為依據(jù)，確診疾??；資料完整；認知功能正常；熟知本研究的過程及目的并自愿參加。排除標準：合并脂肪肝、酒精肝等肝炎病毒感染者；精神異常；資料不全；依從性差；不配合研究者。參照組中男性患者34例，女性患者66例；年齡19～76歲，平均（49.59±5.83）歲。研究組中男性患者33例，女性患者67例；年齡20～75歲，平均（49.62±5.75）歲。兩組患者的數(shù)據(jù)資料對比，P>0.05，具有可比性。

1.2 方法

參照組采用酶聯(lián)免疫吸附法檢驗，設備為：全自動酶標儀（生產廠家及型號：澳斯邦Asubio）和低速離心機（生產廠家及型號：白洋160C型臺式），以及配套洗板機等。晨起空腹，抽取靜脈血3mL，實施離心操作，取得血清，使用酶聯(lián)免疫法對血清乙肝抗體進行測定，依照有關標準進行。

研究組采用化學發(fā)光免疫分析法檢驗：設備為全自動化學發(fā)光免疫分析儀（生產廠家及型號：深圳邁瑞公司CL-1000i）。在檢驗前1d，患者需禁食與禁飲8h，晨起空腹，抽取3mL靜脈血，實施離心操作，轉速為3000r/min，持續(xù)10min，分離出的新鮮血清，進行檢測。

1.3 觀察指標

對比兩組患者乙肝血清標志物，包括乙肝e抗體陽性率、乙肝e抗原陽性率、乙肝核心抗體陽性率、乙肝表面抗原陽性率、乙肝e抗原陽性率，使用統(tǒng)計學軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 21.0對本次研究的檢測數(shù)據(jù)進行對比分析，計數(shù)資料使用χ2檢驗（%表示），P<0.05為具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 兩組試驗者診斷結果比較

研究組乙肝e抗體陽性率、乙肝表面抗原陽性率均高于參照組，差異P<0.05。研究組乙肝e抗原陽性率、乙肝核心抗體陽性率、乙肝e抗原陽性率與參照組比較，差異P>0.05。見表1。

表1.兩組患者檢測陽性率比較(n/%)

3.討論

3.1 乙肝發(fā)病現(xiàn)狀

乙肝病毒性肝炎即乙肝，是感染乙肝病毒而引起的傳染病，廣泛流行，具有較高發(fā)病率，對人們的身體健康產生嚴重危害。乙肝主要癥狀為嘔吐、惡心、食欲減退等，部分患者出現(xiàn)乏力、腹部不適等癥狀。乙肝患者需及時診斷疾病，并給予有效治療[4]。乙肝病原學診斷往往是使用酶聯(lián)免疫吸附試驗法對HBV-M水平進行檢驗，操作簡單，且基本滿足診斷要求。然而，大量臨床實踐表明[1]，此診斷方式存在一定漏診與誤診，影響治療。近年來，化學發(fā)光免疫法廣泛應用于臨床，在乙肝患者的診斷中具有顯著效果，可及時檢出血清標志物，提高診斷準確率[5]。

3.2 乙肝病毒診斷方式

乙肝為臨床常見慢性傳染病，危害性大，且傳播廣泛，部分患者肝功能存在長時間異常，且血清HBV-DNA診斷可見病毒具傳染性、復制活躍。乙肝病原學診斷往往是使用酶聯(lián)免疫吸附試驗法對HBV-M水平進行檢驗，操作簡單，且基本滿足診斷要求。酶聯(lián)免疫法具有特異性強、敏感度高、早期檢出抗體等優(yōu)點，在臨床廣泛應[6]。酶聯(lián)免疫法檢測是以包被抗原作為合成多肽抗原、基因工程抗原，在包被抗原反應孔中置入血清，實施孵育，若血清標本中有乙肝抗體，則將與微孔中抗原共同合成抗原抗體復合物，加入酶結合物可連接抗體抗原復合物，發(fā)生顯色反應。然而，酶聯(lián)免疫法檢測血清乙肝抗體時存在假陽性現(xiàn)象，影響診斷準確率[7]?；瘜W發(fā)光免疫法為臨床常見檢驗方式，具有較高靈敏度、特異性，廣泛應用于臨床，使用設備與材料簡單，具有較高應用價值。大量臨床實踐表明[8,9]，化學發(fā)光免疫法在檢測乙肝標志物時，具有顯著應用效果，可有效診斷乙肝，在疾病的治療與預后評估中均具有顯著治療效果。本次研究結果可見，研究組乙肝e抗體陽性率、乙肝表面抗原陽性率均高于參照組，差異P<0.05，有統(tǒng)計學意義。研究組乙肝e抗原陽性率、乙肝核心抗體陽性率、乙肝e抗原陽性率與參照組比較，差異P>0.05。

杜晨光[10]選取200例乙型肝炎病毒感染患者進行研究，采用抽簽法進行分組，分為兩組，100例患者是對照組，應用酶聯(lián)免疫吸附法，100例患者是研究組，應用電化學發(fā)光法，對比分析兩組患者的抗-HBs、-HBsAg、抗-HBc陽性率研究結果顯示，觀察組患者的抗-HBs陽性率是40.0%，HBsAg陽性率是35.0%，抗-HBs陽性率是30.0%，對照組患者各陽性率分別是31.0%、30.0%、25.0%，數(shù)據(jù)差異比較為P<0.05，統(tǒng)計學意義存在。觀察組患者的檢出率是95.0%，對照組是70.0%，差異P<0.05，統(tǒng)計學意義存在。由此可見，乙型肝炎病毒感染患者在檢測血清標志物時，可使用電化學發(fā)光法、酶聯(lián)免疫吸附法，其中電化學發(fā)光法具有顯著優(yōu)勢。

趙小平[11]的研究中，選擇本院行乙型肝炎病毒檢查的患者100例，按照入院時間先后分為試驗組（采用電化學發(fā)光法檢測，n=100）與對照組（采用酶聯(lián)免疫吸附法，n=100），對比后發(fā)現(xiàn)，兩組患者HBsAg、HBeAg、抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc檢出率對比差異為P>0.05，統(tǒng)計學意義不存在；而試驗組診斷準確率為96.00%（96/100），顯著高于對照組的82.00%（82/100），數(shù)據(jù)差異比較為P<0.05，統(tǒng)計學意義存在。該研究結果則提示，電化學發(fā)光法檢測乙型肝炎較酶聯(lián)免疫吸附法檢測的準確率更高?；瘜W發(fā)光免疫分析法為先進檢測技術方法，主要是化學氧化反應，不僅可有效提高臨床檢驗準確率，還可自動重復、自動稀釋檢測，使得檢測時間有效縮短，提高檢測效果[12]?；瘜W發(fā)光免疫分析法技術操作方便且簡單，無污染，具有較高靈敏度，且特異性良好，檢驗結果受樣本影響很小，廣泛應用于病毒、腫瘤標志物、心臟疾病、免疫系統(tǒng)疾病的監(jiān)測中，應用價值高[13]。

3.3 酶聯(lián)免疫吸附法測定乙肝血清標志物的影響因素分析

在酶聯(lián)免疫吸附法測定乙肝血清標志物中的影響因素較多，所以有時會出現(xiàn)一些假陰性或假陽性，現(xiàn)總結酶聯(lián)免疫吸附法在測定乙肝血清標志物中的影響因素如下。

3.3.1 采集樣本與處理樣本時的影響

3.3.1.1 溶血嚴重的樣本會導致紅細胞進入被檢測的血清中而使樣本分層沉淀或粘附在聚乙烯孔內壁上，不易被清洗。留在孔內壁的血紅蛋白是具有過氧化物酶樣活性的，可以通過催化底物而顯色導致假陽性。所以禁止使用溶血嚴重的樣品。

3.3.1.2 標本未完全凝固，一般情況下血液在采集0.5～2h后就開始凝固，18～24h后血塊收縮完成。而在檢測過程中，有時為了獲得更快檢測的時間，在血液完全凝固前就強制離心提取血清，使一部分纖維蛋白原殘存在血清中，在酶聯(lián)免疫吸附法測定過程中容易形成纖維蛋白塊，且肉眼可見，這就造成了假陽性的結果；因此，必須在采集血樣完全凝固后，然后再分離提取血清，或者在采集血樣時在采集血管中加入適當凝固劑或者使用帶有分離膠的采集血管。

3.3.2 檢測試劑的影響

3.3.2.1 現(xiàn)在市場上有許多生產乙肝血清標志物的廠家。不同制造商生產的試劑在特異性和靈敏度方面存在一些差異。結果表明，不同制造商生產試劑的靈敏度和特異性分別為78%～89%和89.4%～99.3%。部分制造商酶標板孔間A值差異在15%以上；標記酶活性差，顯色液穩(wěn)定性也差。因此使用劣質試劑將不可避免地導致假陰性或假陽性結果。因此選擇高質量的試劑是檢測結果準確的關鍵保證。

3.3.2.2 不同方法檢測乙型肝炎病毒感染血清標志物也是存在差異的。例如，在臨床檢測中，電化學發(fā)光檢測HBsAg的結果為陽性，而ELISA檢測HBsAg的結果卻為陰性。除了方法的靈敏度外，多克隆抗體試劑和單克隆抗體試劑的差異也會影響檢測結果。單克隆抗體在檢測亞型乙型肝炎標志物和變異抗原上存在差異。建議試劑制造商應考慮類型濃度和亞型的問題。

3.3.3 檢測技術的影響

3.3.3.1 加樣時吸入量的準確性及吸嘴的潔凈度都會影響到檢測結果。因為特殊結構的吸嘴很難被清潔，所以增加了交叉污染的風險。建議使用一次性的無菌塑料吸嘴。而且進樣器也應經常被清潔并定期校準。

3.3.3.2 溫浴的影響，酶標板具有特殊的結構；易出現(xiàn)邊緣效應，抗原抗體結合及酶促進反應對溫度都很敏感，當發(fā)生邊緣效應時酶標板中心部位孔和周圍邊緣孔的溫度上升和冷卻速率不同，導致中心部位孔和周圍邊緣孔的檢測結果不同；尤其是干浴的檢測結果差異的明顯，所以水浴應優(yōu)先被選擇，并要求將酶標板浸入水中，防止不均勻的加熱，并粘貼密封膜，以防止污染。

3.3.3.3 清洗是酶聯(lián)免疫吸附法操作的一個關鍵環(huán)節(jié)。手動清洗的一致性較差，這對檢測結果有很大影響。全自動和半自動洗板機的操作不當也會影響檢測效果。血清中殘存的纖維蛋白絲或洗滌液中沉淀的晶體容易半堵塞或完全堵塞洗板機針小孔，導致未結合的標記酶洗脫不完全，造成“花板”的假陰性或假陽性；所以，在運行洗板機過程中，應定時觀察洗滌液在洗板機針小孔內的流暢情況，一旦流動異常要及時糾正。不使用洗板機時，應使用去離子水徹底清洗數(shù)次。

3.3.3.4 當判斷結果時，如果有較淺顯色不明顯，肉眼就難以確認，影響到最終結果的準確性。必須使用酶標儀以確保檢測結果的一致性。

3.3.4 HooK效應影響

當酶聯(lián)免疫一步法被采用時，因為部分樣品中抗原含量過高，會導致HooK效應。結果表明，當采用線性范圍高的乙肝病毒（HBV）感染檢測血清標志物定量法或同步稀釋測定時可減少HooK反應。

3.3.5 干擾物質的影響

有研究表明5個人血清樣本中就約有2個含有非特異性干擾物質，會對檢測結果準確性造成不同程度上的影響；常見干擾物質包括：嗜靶抗原自身抗體、類風濕因子、嗜異性抗體、醫(yī)源性誘導的交叉反應物質、抗鼠Ig(s)抗體、補體和其它物質等。如果RF因子與二抗標記的FC片段結合而造成假陽性，則激活補體C1q，產生使酶標一抗和酶標二抗的抗體分子的變構反應，而且FC的C1q分子結合點也會被暴露，補體C1q可與結合點連接造成假陽性。補體在56°C下滅活30min可以降低假陽性率，儲存過程高濃度的AFP（如孕婦）可能會形成二聚體，導致檢測背景加深，影響檢測結果。

3.3.6 藥物的影響

3.3.6.1 HBsAg會與高效價的乙肝免疫球蛋白形成復合物，從而使HBsAg不易被檢出，所以在注射乙肝免疫球蛋白后，一些HBsAg陽性的患者HBsAg檢測結果卻為陰性，導致乙肝血清標志物的罕見模式。例如有的孕婦患有乙肝大三陽，為阻斷乙肝病毒傳播到胎兒，在妊娠的8、9、10個月常規(guī)注射乙肝免疫球蛋白200mg，這時孕婦血清中的HBsAg就不能被檢出；此外，她們生產的新生兒往往也具有罕見的模式，如HBeAg陽性，HBsAg陰性和HBcAb陽性等，這是乙肝免疫球蛋白的IgG抗體可能通過胎盤進入了胎兒，并與胎兒血液中的HBsAg反應形成復合物。所以新生兒的HBsAg檢測結果陰性；為提高檢出率可以用0.5M鹽酸處理樣品1h。

3.3.6.2 接種乙肝疫苗是預防乙型肝炎有效手段，因為乙肝疫苗的主要成分是HBsAg，所以在完成接種乙肝疫苗后1～2周內，一些HBsAg陰性人群也可以在血清中使用電化學發(fā)光法檢測到HBsAg成分，形成一過性HBsAg陽性，因此不建議在接種后1個月內用電化學發(fā)光法檢測HBsAg。

3.4 化學發(fā)光免疫測定乙肝血清標志物的影響因素分析

化學發(fā)光免疫分析技術結合了化學發(fā)光檢測技術的高靈敏度和免疫反應的高特異性，用于檢測和分析各種半抗原、抗原、抗體、酶、激素、維生素、脂肪酸和藥物。主要具有靈敏度高、特異性強、試劑穩(wěn)定且有效期長、方法穩(wěn)定快速、檢測范圍廣、操作簡單、自動化程度高等優(yōu)點而被臨床普遍接受?，F(xiàn)對化學發(fā)光免疫臨床操作中可能出現(xiàn)的影響因素做如下分析。

3.4.1 標本的影響

應注意避免樣本嚴重溶血。因為血紅蛋白中的血紅素基團具有過氧化物活性。因此，在以HRP為標記酶的化學發(fā)光測定溫育過程中，高濃度血紅蛋白會導致血紅素基團容易吸附到固相，從而誘發(fā)HRP底物反應值較高，導致假陽性。在樣品采集和血清分離提取過程中，應注意盡量避免細菌污染。首先，細菌生長分泌的一些酶可能分解抗原和抗體等蛋白質；其次，某些細菌的內源性酶，如大腸桿菌β-半乳糖苷酶本身，會對相應酶標記的測定方法造成非特異性干擾。新鮮標本的檢測結果更能準確反映機體的真實情況，應在采血后24h內完成檢測。血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使一些纖維蛋白原殘留在血清中，這很容易導致假陽性結果。如果無法及時進行檢測（取樣后24h內），則應分離血清并將其妥善儲存在-20°C的冰箱中，做好原始記錄，標本管上最好標上待檢者姓名、日期，反復凍融，容易造成假陽性。

3.4.2 試劑影響

市場上化學發(fā)光免疫分析試劑的品牌很多良莠不齊，在特異性和靈敏度上存在一定差異。使用不合格的劣質試劑將導致錯誤的檢測結果。因此，選擇質量好的試劑是檢測結果準確的關鍵保證。實驗前，檢測試劑和樣本需要從冰箱中取出，25°C下復溫1h以上才可使用。在使用后，開封試劑的試劑盒應及時放回冰箱中2～8°C保存。開封后試劑有效期為1個月，逾期不再使用。不同批號試劑盒中組分不能混用，混用造成重復性差。

3.4.3 操作技術的影響

吸取量不準確，導致測定的重復性差，直接影響檢測結果，因此加樣器要經常清洗，定期校準。加樣過快容易造成孔間污染。應避免加錯樣本。加樣本及試劑時，避免加在孔壁上部非包被區(qū)，造成重復性差；溫浴影響，弱陽性樣本檢測不出，溫育的時間或溫度不夠。所以盡量使用水浴，避免使用干浴造成不均勻加熱。使用水浴時將固相板放入水中并粘貼密封膜，防止污染；振蕩影響，室溫振蕩，實驗室的室內溫度應控制在25°C，振蕩器的振蕩頻率應相對固定；洗板的影響，配制洗板液的蒸餾水要合格，量筒要干凈，否則造成假陰性，洗板不干凈，儀器針孔堵塞，容易造成假陽性：發(fā)光值的影響，洗板后，發(fā)光液A、B要等量混勻，并將混合的發(fā)光溶液添加到每個孔中，以避免遺漏。發(fā)光液變質容易造成假陰性。準確發(fā)光反映時間，發(fā)光反應時間太短，造成結果假陰性。

4.總結

綜上所述，酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法在乙肝血清標志物檢測中均存在影響因素，但化學發(fā)光法影響因素要相對少一些，且易于控制。兩相比較化學發(fā)光法靈敏度更高、特異性更強、試劑穩(wěn)定且有效期長、方法穩(wěn)定快速，所以乙肝病毒感染患者采用化學免疫發(fā)光法檢測乙肝標志物，可有效提高診斷準確率，可及時檢出疾病，促進疾病的治療。