雷蕾，張廣平，楊樂，李晗，李小陽，葉祖光*，王晰

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；

2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中藥研究所，北京 100700

中藥保健食品是指以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)的，在天然食物中加入中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會(huì)（以下簡(jiǎn)稱衛(wèi)健委）頒布的既是食品又是藥品的可食藥材，經(jīng)過適當(dāng)加工而成的具有某些調(diào)節(jié)人體生理功能、有益于健康的保健食品[1]。保健食品是一類適宜于特定人群食用，不以治療疾病為目的，并且一般認(rèn)為對(duì)人體不會(huì)產(chǎn)生急性、亞急性或者慢性危害，是具有調(diào)節(jié)機(jī)體功能的食品[2]。然而，中藥作為保健食品的原料比作為藥物的食用時(shí)間更長(zhǎng)、受用人群更廣。若中藥保健食品中的原料有不安全因素，則對(duì)人類健康影響更大。近年來，有諸多中藥保健食品原料典型風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)及其潛在毒性作用的報(bào)道，如三七含有三七總皂苷，具有肝毒性，三七總皂苷450 mg·kg-1組動(dòng)物體質(zhì)量顯著下降，肝功能指標(biāo)天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）和丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）顯著升高[3]；何首烏、決明子、番瀉葉和大黃等所含的蒽醌類成分具有肝腎毒性，大黃提取物的毒性劑量范圍10～12 g·kg-1，大黃總蒽醌的毒性劑量范圍在135～4500 mg·kg-1[4]；吳茱萸中的吳茱萸堿和吳茱萸次堿等都具有肝毒性，吳茱萸次堿使肝細(xì)胞上清液中的AST、堿性磷酸酶（ALP）和乳酸脫氫酶（LDH）水平均升高[5]。如何做到對(duì)中藥肝毒性的早期預(yù)測(cè)是亟待解決的問題。

使用計(jì)算機(jī)輔助新藥篩選方法（CADD）構(gòu)建定量構(gòu)效關(guān)系（QSAR）已經(jīng)應(yīng)用在中藥保健食品評(píng)價(jià)中[6]。QSAR 通過使用數(shù)學(xué)模型來描述分子結(jié)構(gòu)和分子的某種生物活性特別是毒性效應(yīng)之間的聯(lián)系，用來預(yù)測(cè)其他已知結(jié)構(gòu)化合物的潛在毒性，有效節(jié)省時(shí)間、資金和人力。然而，目前中藥肝毒性預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確率普遍不高，葉立等[7]構(gòu)建了3 種樹形算法模型，內(nèi)部交叉驗(yàn)證準(zhǔn)確率為78%～85%。He 等[8]建立了由1254個(gè)化合物組成的大規(guī)模多樣的DⅠLⅠ數(shù)據(jù)集，通過集成方法獲得最佳模型，準(zhǔn)確度（ACC）為78.3%。Zhao 等[9]基于已發(fā)表的數(shù)據(jù)和美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）的肝毒性知識(shí)庫（LTKB）構(gòu)建了QSAR模型，準(zhǔn)確率為80.2%。

本研究充分考慮中藥分子的化學(xué)空間，將訓(xùn)練集先進(jìn)行聚類分析，然后針對(duì)不同的聚類構(gòu)建中藥化學(xué)成分的肝毒性QSAR 預(yù)測(cè)模型，并對(duì)衛(wèi)健委公布的113 個(gè)中藥保健食品原料成分可能的肝毒性進(jìn)行了預(yù)測(cè)，為中藥保健食品安全性評(píng)價(jià)提供參考，技術(shù)路線見圖1。

圖1 中藥保健食品原料肝毒性預(yù)測(cè)技術(shù)路線

1 材料

1.1 構(gòu)建訓(xùn)練集

本研究使用的肝毒性數(shù)據(jù)以He 等[8]發(fā)表的建立肝毒性預(yù)測(cè)模型的1254 個(gè)化合物數(shù)據(jù)集（該數(shù)據(jù)集收集了DⅠLⅠrank、LiverTox、LTKB 等14個(gè)肝毒模型訓(xùn)練集數(shù)據(jù)并使用機(jī)器學(xué)習(xí)的方法進(jìn)行優(yōu)化）為基礎(chǔ)，增加了Zhao 等[9]用來建立和驗(yàn)證肝毒性預(yù)測(cè)模型的31 個(gè)中藥成分。同時(shí)在中國知網(wǎng)、萬方和維普數(shù)據(jù)庫中以“中藥”“肝毒”為檢索詞檢索2010 年以來的文獻(xiàn)，收集了43 個(gè)中藥成分肝毒性數(shù)據(jù)。合并以上數(shù)據(jù)，刪除重復(fù)項(xiàng)以后，共得到1271 個(gè)化合物作為訓(xùn)練集，其中具有肝毒性的化合物653 個(gè)、無肝毒性的化合物618 個(gè)。從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載分子2D 結(jié)構(gòu)，保存為.sdf格式文件。

1.2 構(gòu)建待預(yù)測(cè)中藥化學(xué)成分集

中藥保健食品原料目錄來自《衛(wèi)生部關(guān)于進(jìn)一步規(guī)范保健食品原料管理的通知》（衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2002〕51 號(hào)），共113 個(gè)中藥[10]。中藥化學(xué)成分庫來自中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)（TCMSP，https://tcmsp-e.com/tcmsp.php）[11]、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫（ETCM，http：//www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/）[12]、中藥化學(xué)數(shù)據(jù)庫TCMD（https://www.neotrident.com/）[13]3個(gè)數(shù)據(jù)庫。采集113個(gè)中藥包含的化學(xué)成分，合并查重后得到3540個(gè)化合物。同樣從PubChem下載分子2D結(jié)構(gòu)，保存為.sdf格式文件。

2 方法

2.1 訓(xùn)練集分子聚類及性質(zhì)的主成分分析

使用Discovery Studio 4.5 中的Small Molecules-Property Calculation-Calculate Molecular Properties 計(jì)算了分子的ALogP、Molecular_Weight、Num_H_Donors、Num_H_Acceptors、Num_Rotatable Bonds、Num_ Rings、Num_Aromatic Rings、Molecular_Fractional Polar Surface Area 8 個(gè)性質(zhì)，使用Small Molecules-Cluster-Cluster Ligands 對(duì)1271 個(gè)化合物進(jìn)行了聚類；使用Small Molecules-Analyze-Calculate Principal Component 進(jìn)行了主成分分析，并使用Origin 2018進(jìn)行了分類結(jié)果的可視化。如果沒有特殊說明，均采用系統(tǒng)默認(rèn)值。

2.2 描述符的篩選

本研究使用FDA 公布的Mold2 軟件[14]對(duì)每個(gè)化合物的2D 結(jié)構(gòu)計(jì)算777 個(gè)分子描述符。在建立QSAR 模型時(shí)，對(duì)描述符的挑選是非常重要的。使用Python按以下步驟進(jìn)行篩選：1）去掉全零和零占比超過80%的數(shù)列；2）篩選出皮爾遜相關(guān)系數(shù)＞0.8 的數(shù)列，保留1 個(gè)數(shù)列；3）計(jì)算歐氏距離，取距離最大的前60 個(gè)；4）計(jì)算余弦相似度，取夾角最小的前60 個(gè)；5）將第3 步和第4 步篩選的數(shù)列取并集。

2.3 建立QSAR預(yù)測(cè)模型

在預(yù)測(cè)模型構(gòu)建階段，對(duì)于2.1項(xiàng)下聚類得到的每一類，均使用9 種算法，包括樸素貝葉斯（NB）、邏輯回歸（LR）、鄰近算法（KNN）、隨機(jī)森林（RF）、支持向量機(jī)（SVM）、交叉驗(yàn)證的支持向量機(jī)（SVMCV）、梯度提升迭代決策樹（GBDT）、自適應(yīng)增強(qiáng)（AdaBoost）、布袋法（Bagging）分別構(gòu)建模型，并利用交叉驗(yàn)證方法對(duì)模型構(gòu)建方法進(jìn)行內(nèi)部評(píng)估，使用準(zhǔn)確率、精度和召回率評(píng)價(jià)模型。

2.4 對(duì)中藥保健品原料包含的化學(xué)成分進(jìn)行預(yù)測(cè)

計(jì)算113 個(gè)中藥保健食品原料包含3540 個(gè)化學(xué)成分的ALogP、Molecular_Weight、Num_H_Donors、Num_H_Acceptors 等8 個(gè)分子性質(zhì)，然后根據(jù)這些性質(zhì)按公式（1）計(jì)算每個(gè)成分到聚類中心化合物的歐式距離（d）。根據(jù)距離遠(yuǎn)近，判斷待預(yù)測(cè)的化合物屬于哪類，進(jìn)而使用這個(gè)類對(duì)應(yīng)的QSAR 模型進(jìn)行中藥成分的肝毒性預(yù)測(cè)。

式中x和y為每個(gè)化學(xué)成分性質(zhì)投映到到多維空間后的坐標(biāo)值。

3 結(jié)果

3.1 QSAR模型的構(gòu)建和評(píng)價(jià)

3.1.1模型訓(xùn)練集的主成分分析和聚類分析 對(duì)QSAR模型訓(xùn)練集的1271個(gè)化合物進(jìn)行聚類分析，得到3個(gè)聚類，每一類的有毒成分?jǐn)?shù)量、無毒成分?jǐn)?shù)量、成分總數(shù)、聚類的中心化合物及結(jié)構(gòu)詳細(xì)信息見表1。對(duì)1271 個(gè)化合物進(jìn)行主成分分析，結(jié)果得到4個(gè)主成分表達(dá)式（表2）。以PC1、PC2 和PC3 分別為坐標(biāo)軸來構(gòu)建化學(xué)空間，進(jìn)一步可視化聚類結(jié)果（圖2）。第1 類和第3 類的化合物數(shù)量分別為1080、181 個(gè)，在化學(xué)空間中顯示聚類效果較好，可以用于下一步構(gòu)建QSAR 模型。第2 類化合物數(shù)量較少，在化學(xué)空間上也比較分散，不利于構(gòu)建模型。

圖2 肝毒性預(yù)測(cè)模型訓(xùn)練集化合物的聚類結(jié)果

表1 肝毒性預(yù)測(cè)模型訓(xùn)練集聚類分析詳細(xì)信息

表2 肝毒性預(yù)測(cè)模型訓(xùn)練集化學(xué)成分主成分分析

3.1.2第1 類訓(xùn)練集和第3 類訓(xùn)練集QSAR 模型的構(gòu)建和評(píng)價(jià) 使用Mold2 軟件分別對(duì)第1 類訓(xùn)練集（1080 個(gè)成分）和第3 類訓(xùn)練集（181 個(gè)成分）進(jìn)行了分子描述符計(jì)算，然后根據(jù)2.2項(xiàng)下方法對(duì)描述符進(jìn)行了初步篩選，分別得到170、106 個(gè)分子描述符。使用2.3項(xiàng)下方法分別構(gòu)建了2 個(gè)QSAR 模型，得到的模型準(zhǔn)確率、精確度和召回率見表3。從均值可以看出第3 類的QSAR 模型準(zhǔn)確率和精確度均高于第1類的QSAR模型。

表3 肝毒性預(yù)測(cè)模型第1類訓(xùn)練集和第3類訓(xùn)練集構(gòu)建的QSAR模型

3.2 對(duì)中藥保健食品原料成分的肝毒性預(yù)測(cè)

根據(jù)2.4項(xiàng)下方法，通過比較每個(gè)成分到類中心的歐式距離，將這些成分歸到了QSAR 模型第1類（2767 個(gè)化學(xué)成分）和第3 類（783 個(gè)化學(xué)成分）中。第3 類的QSAR 模型優(yōu)于第1 類的QSAR 模型，因此，對(duì)使用第3類QSAR 模型預(yù)測(cè)的783個(gè)成分的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

為了更加合理地表達(dá)預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究使用多模型加權(quán)預(yù)測(cè)方法，按公式（2）計(jì)算加權(quán)平均概率。

在783 個(gè)成分中，肝毒性加權(quán)平均概率排列前5位的化合物見表4，中藥保健食品原料成分肝毒性預(yù)測(cè)加權(quán)平均概率分布見圖3。

圖3 中藥保健食品原料成分肝毒性預(yù)測(cè)加權(quán)平均概率分布

表4 中藥保健食品原料中的肝毒性加權(quán)平均概率排列前5位的化合物

預(yù)測(cè)結(jié)果中有肝毒性成分比例較大的10 個(gè)中藥和預(yù)測(cè)無肝毒性成分比例較大的10 個(gè)中藥見圖4。可以看到茜草包含了14 個(gè)預(yù)測(cè)有肝毒性的成分和7個(gè)預(yù)測(cè)無肝毒性的成分。

圖4 部分中藥成分的肝毒性預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

3.3 文獻(xiàn)驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證QSAR 模型的準(zhǔn)確率，采用文獻(xiàn)驗(yàn)證的方法，即從預(yù)測(cè)的結(jié)果中找出目前有文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果進(jìn)行比較，得出一致結(jié)果的比例。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在預(yù)測(cè)的783 個(gè)化合物中，有文獻(xiàn)報(bào)道毒理性質(zhì)的很少。經(jīng)過逐一檢索，具有肝保護(hù)作用的成分有10個(gè)，包括白芍苷[15]、人參皂苷人參皂苷Rb2[17]、野漆樹苷[18]、連翹酯苷[19]、山茱萸新苷[20]、絞股藍(lán)皂苷[21]、木犀草素[22]、芍藥苷[23]、芒柄花苷[24]，表明這些成分均無肝毒性，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。本研究預(yù)測(cè)阿魏酸的肝毒性概率0.566 9，為有肝毒，與實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反[25]。

在113 種中藥中，肝毒性所占比例較高的中藥有茜草、番瀉葉、當(dāng)歸、大黃、丹參、厚樸、川芎、桑枝、桑白皮、五味子等，其中實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)具有肝毒性的有5 味藥，包括番瀉葉可引起胃腸、肝膽、神經(jīng)、泌尿等多系統(tǒng)損害，其中肝膽系統(tǒng)損害以黃疸為主，臨床表現(xiàn)為頭昏不適、發(fā)熱、尿黃等癥狀[26]，大黃中的大黃蒽醌具有潛在的肝腎毒性和致癌性[4]。茜草的70%乙醇提取物長(zhǎng)期給藥劑量≥5 g·kg-1時(shí)具有輕微的肝、腎毒性[27]。當(dāng)歸提取物對(duì)正常小鼠無明顯急性肝毒性，但不同濃度劑量的提取液可能引起肝功能異常，在一定范圍內(nèi)呈劑量正相關(guān)[28]。厚樸葉、厚樸皮和厚樸花對(duì)大鼠的食物利用率、腎功能都有所影響，也影響肝、卵巢、睪丸的臟體系數(shù)[29]。

4 結(jié)論與討論

肝毒性是指藥物在肝臟代謝時(shí)，藥物本身或其代謝產(chǎn)物對(duì)肝臟造成的損害。在藥物開發(fā)和使用過程中，藥物肝毒性往往是導(dǎo)致新藥研發(fā)失敗或者撤市的主要原因之一。中藥在我國臨床上已經(jīng)使用了幾千年，隨著中藥現(xiàn)代化的發(fā)展，中藥不良反應(yīng)逐漸被人們重視。對(duì)中藥肝毒性的預(yù)測(cè)將會(huì)成為輔助以中藥為原料的保健食品毒性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要途徑。QSAR 是化藥新藥研發(fā)階段的毒性預(yù)測(cè)的常用方法之一，其可以在沒有實(shí)驗(yàn)信息的情況下，利用已知毒性的化合物，對(duì)未知化合物進(jìn)行初步預(yù)測(cè)。然而，目前構(gòu)建QSAR 模型來預(yù)測(cè)中藥肝毒性的例子不多[4,9]，同時(shí)由于中藥化合物與化藥分子結(jié)構(gòu)的差異，基于化藥結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的預(yù)測(cè)模型預(yù)測(cè)中藥準(zhǔn)確率也不高。

本研究考慮到QSAR 主要基于分子結(jié)構(gòu)和分子特性與毒性效應(yīng)之間的聯(lián)系來建立機(jī)器學(xué)習(xí)模型，因此首先在訓(xùn)練集的化學(xué)空間上做了聚類分析，使得每一類的內(nèi)部化合物化學(xué)空間性質(zhì)比較相似，類之間的化合物化學(xué)空間性質(zhì)差異較大，然后對(duì)每一個(gè)類分別建模，可以提高模型準(zhǔn)確率。通過研究發(fā)現(xiàn)，本研究將訓(xùn)練集在化學(xué)空間上分為3類，第3類模型的準(zhǔn)確率為85%～91%，相比之前的報(bào)道有大幅度的提高。

在模型構(gòu)建上為了使預(yù)測(cè)的結(jié)果更加合理，本研究還提出了多模型加權(quán)預(yù)測(cè)方法，充分考慮到機(jī)器學(xué)習(xí)模型預(yù)測(cè)的概率性，綜合考慮多個(gè)模型的準(zhǔn)確率和預(yù)測(cè)概率，加權(quán)平均后得到總體值。最后，本研究對(duì)113種中藥保健食品原料的成分計(jì)算到第1類中心和第3類中心的歐式距離，選擇與第3類中心較近的783 個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)加權(quán)平均概率最終預(yù)測(cè)得到肝毒性化合物48 個(gè)，不具有肝毒性的化合物735 個(gè)，肝毒性預(yù)測(cè)概率為0.15～0.30。為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果，筆者進(jìn)行了相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)查。文獻(xiàn)數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)中藥成分共有10 個(gè)，其肝毒性均與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

綜上所述，本研究在傳統(tǒng)的QSAR 建模方法上進(jìn)行了2 點(diǎn)改進(jìn)，其一是對(duì)訓(xùn)練集化合物進(jìn)行了聚類分析，然后對(duì)每一類分別使用NB、LR、KNN 等9種機(jī)器學(xué)習(xí)的方法構(gòu)建QSAR模型，并利用交叉驗(yàn)證方法對(duì)模型構(gòu)建方法進(jìn)行評(píng)估，得到了準(zhǔn)確率為85%～91%的最優(yōu)模型。其二是建立多模型加權(quán)預(yù)測(cè)方法，并預(yù)測(cè)了113 種中藥保健食品原料包含的783個(gè)化學(xué)成分的肝毒性，丹參、川芎、桑枝、桑白皮、五味子等預(yù)測(cè)肝毒性成分比重較高，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。