周建新，鄧哲，陳蒙，肖蘇萍，周海燕，杜杰，王繼永

中國中藥有限公司，北京 102600

白術(shù)是菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，可用于治療脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動不安等證[1]，主產(chǎn)地有安徽亳州、河北安國、湖北來鳳、重慶秀山、湖南邵陽、四川雅安、四川樂山等[2]。

2020 年國家中醫(yī)藥管理局首次公布古代經(jīng)典名方關(guān)鍵信息[3-4]，其中白術(shù)處方用藥為生白術(shù)。白術(shù)中含有揮發(fā)油、內(nèi)酯類、多糖、皂苷、酚酸等多種成分，炮制后，化學(xué)成分會有一定的變化。近年來對白術(shù)炮制前后的化學(xué)成分研究偏重于其所含的多糖和內(nèi)酯類成分。研究發(fā)現(xiàn)，白術(shù)經(jīng)炒制后多糖類成分和白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量均有不同程度的升高，但蒼術(shù)酮含量明顯下降[4-5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，綠原酸類成分具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[6-7]，是白術(shù)發(fā)揮藥效的關(guān)鍵成分之一，監(jiān)測炮制前后白術(shù)中綠原酸類成分含量的變化很有意義。2021年國家藥品監(jiān)督管理局正式發(fā)布了白術(shù)配方顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，首次將綠原酸類成分作為其含量測定的指標(biāo)成分。目前，對炮制前后白術(shù)中綠原酸類成分的含量變化相關(guān)研究較少，建立的含量測定方法單一[8]。以“白術(shù)”“含量研究”為關(guān)鍵詞，在中國知網(wǎng)檢索到295篇文獻(xiàn)，其中對白術(shù)藥材中的新綠原酸和綠原酸同時測定的文獻(xiàn)僅有1篇，其采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器法（UPLC-DAD）建立了白術(shù)中綠原酸類成分的含量測定方法[9]。但用UPLC建立含量測定方法的成本較高。為全面評價白術(shù)藥材及生白術(shù)飲片的質(zhì)量，探索白術(shù)炮制前后新綠原酸和綠原酸的含量變化，降低含量測定成本，本研究建立用高效液相色譜法（HPLC）同時測定白術(shù)中的新綠原酸和綠原酸含量的方法，研究兩者在炮制過程中的轉(zhuǎn)移情況，為白術(shù)藥材及生白術(shù)飲片的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

XM-500UGF型雙頻超聲波清洗儀（小美超聲儀器有限公司）；BX-808 型多功能中藥切片機(jī)（浙江瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司）。

1.2 試藥

對照品新綠原酸（批號：P30N10L104575，純度：98.0%，上海源葉生物科技有限公司）；綠原酸（批號：110753-202018，純度：96.1%，中國食品藥品檢定研究院）；水為娃哈哈純凈水；乙腈、磷酸為色譜級。

15 批白術(shù)藥材經(jīng)中國中藥有限公司陳彥琳研究員鑒定為菊科植物白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.的干燥根莖，均符合《中華人民共和國藥典》2020年版規(guī)定（表1）。

表1 15批白術(shù)藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 15批白術(shù)藥材炮制

將每批白術(shù)藥材揀去雜質(zhì)及非藥用部位，按大小分檔。凈制后，加水沒過，根據(jù)不同大小，浸泡8～16 h，中間可翻動數(shù)次，至水量降低為加水量的1/2，取出，稍晾至表皮微干，堆潤12 h。使用刨片機(jī)中速切制成厚度為2～4 mm 的片，50 ℃鼓風(fēng)干燥6～8 h，收集裝袋，備用。

2.2 色譜條件

CAPCELL PAK C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）梯度洗脫（0～25 min，8%～13%A）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測波長：325 nm；進(jìn)樣量：10 μL，色譜圖見圖1。

圖1 白術(shù)中新綠原酸和綠原酸HPLC圖

2.3 溶液的制備

2.3.1混合對照品溶液的制備 取新綠原酸對照品適量于100 mL 量瓶中，加甲醇溶解后定容，備用；取綠原酸對照品適量于25 mL量瓶中，加甲醇溶解后定容，備用；分別吸取新綠原酸和綠原酸對照品溶液1 mL 于10 mL 量瓶中，加甲醇定容，制得質(zhì)量濃度分別為9.75、40.44 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3.2供試品溶液的制備 稱取白術(shù)藥材粉末（過三號篩）約1 g置50 mL錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流提取60 min，冷卻，用50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，0.45 μm濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系考察 分別取混合對照品溶液2、4、6、8、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，吸取10 μL 注入高效液相色譜儀。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得新綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=2 299 295.8X+3 151.80（r=0.999 0），線性范圍為1.950～9.750 μg·mL-1；得綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=2 548 975.4X+9 504.20（r=0.999 5），線性范圍為8.088～40.440 μg·mL-1。

2.4.2精密度試驗(yàn) 取樣品（批號：JBZ06）粉末，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸峰面積RSD 分別為1.18%、0.27%，均低于2%，表明儀器精密度良好。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取樣品（批號：JBZ06）粉末，按2.3.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件分別在0、4、8、12、24 h 進(jìn)樣1 次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸的峰面積RSD 分別為1.74%、0.52%，均低于2%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。

2.4.4重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品（批號：JBZ06）粉末，按2.3.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積并計算含量。結(jié)果顯示，新綠原酸、綠原酸的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.009%、0.036%，RSD 分別為2.11%、2.24%，表明該測定方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的白術(shù)藥材，按1∶1 分別加入新綠原酸、綠原酸對照品，平行制備6 份供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測定，計算回收率及RSD，結(jié)果見表2。

表2 白術(shù)藥材中新綠原酸和綠原酸加樣回收率考察結(jié)果

2.5 不同產(chǎn)地白術(shù)藥材和飲片中新綠原酸和綠原酸含量測定結(jié)果

取15批不同產(chǎn)地白術(shù)樣品，各稱取藥材和飲片粉末（過三號篩）約1 g置50 mL 錐形瓶中，精密加入50%甲醇10 mL，稱定質(zhì)量，水浴回流提取60 min，冷卻，用50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，計算2 個成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（表3）。15 批不同產(chǎn)地白術(shù)藥材中綠原酸和新綠原酸含量最高的分別為河北和浙江，其中河北產(chǎn)地白術(shù)中的綠原酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.216 3%，浙江產(chǎn)地白術(shù)中的新綠原酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.010 8%，結(jié)果見圖2～3。通過GraphPad Prism 8軟件對各產(chǎn)地藥材和飲片炮制前后新綠原酸和綠原酸含量進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA），去除轉(zhuǎn)移率異常情況，結(jié)果見圖4。轉(zhuǎn)移率最高的是浙江產(chǎn)白術(shù)，新綠原酸和綠原酸平均轉(zhuǎn)移率分別為55.68%、55.05%。

表3 15批白術(shù)藥材和飲片中新綠原酸和綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖2 各產(chǎn)地白術(shù)藥材中的新綠原酸和綠原酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=5）

圖3 各產(chǎn)地白術(shù)飲片中的新綠原酸和綠原酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)（,n=5）

圖4 各產(chǎn)地白術(shù)炮制前后新綠原酸和綠原酸的轉(zhuǎn)移率（,n=5）

3 討論

3.1 色譜條件優(yōu)化

分別考察了不同梯度、流動相、柱溫、色譜柱對色譜峰分離效果的影響，最終確定色譜條件。

3.1.1起始梯度的選擇 分別考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液（5∶95、8∶92、10∶90），其中起始梯度乙腈-0.1%磷酸水溶液為5∶95 條件下分析時間過長，起始梯度乙腈-0.1%磷酸水溶液為10∶90 條件下，新綠原酸保留時間短，考慮該色譜峰容易與雜質(zhì)峰重疊未分離，故選擇起始梯度乙腈-0.1%磷酸水溶液（8∶92）。

3.1.2流動相的選擇 分別考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸水溶液條件下各色譜峰均能達(dá)到很好分離，但乙腈-0.1%磷酸水溶液條件下色譜峰峰形較好，故選擇其為洗脫流動相。

3.1.3柱溫的選擇 分別考察了柱溫30、35、40 ℃的分離效果，結(jié)果表明柱溫對新綠原酸、綠原酸分離無影響，但是隨著柱溫升高，新綠原酸、綠原酸色譜峰保留時間相對提前。結(jié)合實(shí)際情況，選擇柱溫30 ℃為宜。

3.1.4色譜柱的選擇 分別考察了色譜柱CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、X-Bridge（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hpresil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）的分離效果，結(jié)果顯示色譜柱CAPCELL PAK C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、X-Bridge（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Hpresil ODS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）均有較好的分離度，表明不同色譜柱的耐用性均較好。

3.2 提取條件的優(yōu)化

分別考察了不同提取溶劑（甲醇、乙醇、水）、提取溶劑體積分?jǐn)?shù)（25%甲醇、50%甲醇、75%甲醇）、提取方式（超聲、回流）、提取時間（30、60、120 min）對白術(shù)中新綠原酸和綠原酸提取效果的影響，結(jié)果顯示50%甲醇回流提取60 min效果最佳。

3.3 炮制前后新綠原酸和綠原酸含量變化

通過比較不同產(chǎn)地的白術(shù)炮制前后新綠原酸和綠原酸的含量，發(fā)現(xiàn)兩者含量均有不同程度的下降趨勢，分別計算浙江和安徽產(chǎn)白術(shù)新綠原酸和綠原酸轉(zhuǎn)移率，結(jié)果表明白術(shù)在藥材炮制為飲片的過程中成分含量損失50%左右。新綠原酸和綠原酸在植物體內(nèi)分布廣泛，來源于苯丙氨酸代謝途徑，兩者為同分異構(gòu)體，分子結(jié)構(gòu)均具鄰位酚羥基，易在多酚氧化酶的作用下氧化發(fā)生縮合反應(yīng)[10]。同時，植物中的苯丙酸類及其衍生物大多具有一定的水溶性[11]，炮制過程中，白術(shù)藥材需要浸泡8～16 h，撈出堆潤12 h，此過程會溶出部分新綠原酸和綠原酸，降低兩者在飲片中的含量。另外，烘干溫度也會影響多酚氧化酶的活性，低溫可抑制該酶活性，隨著溫度升高酶活性逐漸增強(qiáng)，達(dá)到80 ℃時，酶活性喪失[12]。本研究中，干燥溫度設(shè)定為50 ℃，酶活性較強(qiáng)，催化白術(shù)中酚酸成分的分解，造成新綠原酸和綠原酸轉(zhuǎn)移率下降。

此外，還比較了各產(chǎn)地白術(shù)中新綠原酸和綠原酸的轉(zhuǎn)移率，河北產(chǎn)地的白術(shù)經(jīng)過炮制后新綠原酸和綠原酸的轉(zhuǎn)移率顯著低于浙江和安徽產(chǎn)白術(shù)。本研究中，河北產(chǎn)白術(shù)大小明顯小于浙江和安徽，推測可能是浸泡和堆潤的時間過長導(dǎo)致，后續(xù)炮制工藝改進(jìn)需要調(diào)整浸泡和堆潤時間。

4 結(jié)語

本研究以白術(shù)中的新綠原酸和綠原酸作為指標(biāo)成分建立的含量測定方法可為白術(shù)及其炮制品的質(zhì)量評價提供參考，初步揭示了白術(shù)炮制前后新綠原酸和綠原酸含量的變化情況，可為進(jìn)一步優(yōu)化白術(shù)炮制工藝提供參考。