李 蘭，張棵實(shí)，白文鳳，劉乃青，金 麗*，張建坡*

(1.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉化北方龍山助劑有限公司，吉林 吉林 132022；3.吉林石化公司研究院，吉林 吉林 132022)

亞甲基藍(lán)是一種常見的吩噻類染料，又名美藍(lán)、品藍(lán)等，廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物實(shí)驗(yàn)室染色劑和醫(yī)療藥物等領(lǐng)域.但過量使用亞甲基藍(lán)會(huì)導(dǎo)致人體出現(xiàn)亨氏小體貧血、紅細(xì)胞形態(tài)改變以及壞死膿腫等癥狀.雖然對(duì)不同動(dòng)物的毒性略有差異，但是當(dāng)亞甲基藍(lán)濃度過量時(shí)，會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物的死亡[1].美國(guó)、歐盟、日本等已相繼限制亞甲基藍(lán)的濫用并制訂了亞甲基藍(lán)殘留量的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，日本規(guī)定最大殘留限量為10 μg·kg-1，歐盟規(guī)定其用于消毒使用的終濃度不能超過0.4 mg·kg-1[2]，因此檢測(cè)水中的亞甲基藍(lán)殘留對(duì)環(huán)境監(jiān)測(cè)、生態(tài)環(huán)境保護(hù)、綠色養(yǎng)殖具有重要意義[3].目前亞甲基藍(lán)的檢測(cè)方法主要有表面增強(qiáng)拉曼法(SERS)[4]、高效液相色譜法(HPLC)[5-6]、免疫法[7]、電化學(xué)法[8]、比色法[9]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法[10-11]、分光光度法[12-13].但存在需要復(fù)雜的前處理過程、儀器昂貴、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、靈敏度低等問題，因而需要探索更為便捷、快速、靈敏度高的檢測(cè)方法.

比率熒光體系[14]采用雙發(fā)射的強(qiáng)度比作為檢測(cè)信號(hào)，可以提供針對(duì)外部干擾的內(nèi)置校正，并消除儀器引起的負(fù)面影響，顯著提高方法的靈敏度.與單波長(zhǎng)信號(hào)的傳統(tǒng)熒光分析相比[15]，比率熒光探針具有靈敏度高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn).基于石墨烯量子點(diǎn)的比率型熒光探針作為比率型熒光體系的后起之秀，其具備了熒光納米探針的高光學(xué)穩(wěn)定性與熒光效率,并結(jié)合了比率熒光探針的優(yōu)點(diǎn)，在定量和可視化分析中得到了廣泛的應(yīng)用.

以石墨烯量子點(diǎn)與CdTe量子點(diǎn)混合溶液建立比率熒光檢測(cè)體系(簡(jiǎn)稱CG體系)，討論了亞甲基藍(lán)與該CG體系的相互作用，并基于亞甲基藍(lán)濃度與CG體系熒光強(qiáng)度的變化呈正比例關(guān)系，建立了一種可用于亞甲基藍(lán)定量分析的檢測(cè)方法.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

亞甲基藍(lán)購(gòu)自天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠，其他所有試劑均為分析純，使用前未做任何處理.水為雙蒸水(>18 MΩ·cm).

1.2 儀器與設(shè)備

F-280熒光分光光度計(jì)(天津港東)；紫外分光光度計(jì)UV-2550(日本島津)；pHS-3C型數(shù)字酸度計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

如文獻(xiàn)所述的方法[16]制備了石墨烯量子點(diǎn)和CdTe量子點(diǎn)，并構(gòu)建CG體系.將30 μL石墨烯量子點(diǎn)與50 μL的CdTe量子點(diǎn)混合，定容到2 mL(pH=8)，測(cè)得熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長(zhǎng)380 nm，激發(fā)狹縫為5.0 nm，發(fā)射狹縫為10.0 nm.向上述構(gòu)建CG體系中，加入一定量亞甲基藍(lán)溶液，調(diào)節(jié)pH，孵育2 min后，在上述相同條件下測(cè)得熒光發(fā)射光譜.

2 結(jié)果與分析

2.1 CG體系檢測(cè)條件的優(yōu)化

為了得到可靠的分析結(jié)果，首先討論了pH和溫度對(duì)該亞甲基藍(lán)-CG體系的影響.pH會(huì)引起體系中CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的較大波動(dòng)，這是由于氫離子會(huì)引起CdTe量子點(diǎn)表面的巰基丙酸性質(zhì)改變，導(dǎo)致CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度降低.但是氫離子對(duì)石墨烯量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響較小，如圖1(a)所示，綜合考慮，選擇pH為8作為反應(yīng)條件.此外，研究了向CG體系中加入亞甲基藍(lán)后(加入0.1 g·L-1的亞甲基藍(lán)溶液20 μL)，孵育時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響，如圖1(b)所示，可見CG體系的熒光強(qiáng)度變化較小，為了得到可信的分析結(jié)果，選定孵育時(shí)間為2 min.

t/min(a)

pH(b)圖1 pH對(duì)CG體系的熒光強(qiáng)度影響關(guān)系圖和孵育時(shí)間對(duì)CG體系的熒光強(qiáng)度影響關(guān)系圖

2.2 亞甲基藍(lán)-CG體系的建立

將一系列0.1 g·L-1的亞甲基藍(lán)加入CG體系中，CdTe量子點(diǎn)的熒光發(fā)射強(qiáng)度隨著亞甲基藍(lán)濃度的增加而逐漸降低，而且CdTe量子點(diǎn)的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)也隨之發(fā)生明顯的藍(lán)移，但是石墨烯量子點(diǎn)的熒光發(fā)射強(qiáng)度和最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)幾乎未發(fā)生變化，如圖2(a)所示.

Wavelength/nm(a)

Concentrations of Methylene blue/(μmol·L-1)(b)圖2 加入亞甲基藍(lán)后CG體系的熒光光譜圖和相應(yīng)的線性關(guān)系圖

此外，亞甲基藍(lán)的濃度與CG體系熒光強(qiáng)度的比值F487 nm/F640 nm之間具有良好的線性關(guān)系，如圖2(b)所示，回歸方程為F487 nm/F640 nm=0.038 64[亞甲基藍(lán)]+0.9459，R2=0.999 5，根據(jù)文獻(xiàn)[17]計(jì)算可得最低檢出限為0.2182 μmol·L-1.通過進(jìn)一步研究(如圖3所示)，測(cè)定該猝滅體系的最低檢出限為0.558 9 nmol·L-1，線性范圍為3.13～9.38 nmol·L-1，激發(fā)狹縫為5 nm，發(fā)射狹縫為10 nm.

Concentrations of Methylene blue/(nmol·L-1)圖3 亞甲基藍(lán)濃度與CG體系熒光強(qiáng)度變化(F487 nm/F640 nm)的關(guān)系圖

2.3 亞甲基藍(lán)與CG體系作用機(jī)理探討

由圖2可知，將亞甲基藍(lán)加入CG體系中，CdTe量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生明顯的降低，但是石墨烯量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化不大，這是建立本比率熒光法定量分析亞甲基藍(lán)的前提條件.為了進(jìn)一步研究該體系的檢測(cè)機(jī)理，研究了孵育溫度為20 ℃和30 ℃時(shí)，不同濃度亞甲基藍(lán)對(duì)CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的影響，如圖4所示.

Concentrations of Methylene blue/(mg·L-1)圖4 不同孵育溫度對(duì)亞甲基藍(lán)-CdTe量子點(diǎn)體系熒光強(qiáng)度影響關(guān)系圖

隨著亞甲基藍(lán)濃度的增加，CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度逐漸降低，且熒光強(qiáng)度的變化與亞甲基藍(lán)的濃度之間具有較好的線性關(guān)系，隨著溫度升高，回歸線的斜率變小了.由此可推斷亞甲基藍(lán)所引起CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的降低為靜態(tài)猝滅過程，即亞甲基藍(lán)與CdTe量子點(diǎn)之間形成了復(fù)合物，隨著溫度的升高，復(fù)合物穩(wěn)定性降低，猝滅效率降低，即斜率減小.為了進(jìn)一步證明以上推斷，測(cè)定了CdTe量子點(diǎn)溶液中加入亞甲基藍(lán)前后的紫外可見吸收光譜，如圖5所示.結(jié)果表明，加入亞甲基藍(lán)溶液后，CdTe量子點(diǎn)的最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生了明顯的變化，說明有新的復(fù)合物生成，即亞甲基藍(lán)和CdTe量子點(diǎn)之間生成了復(fù)合物.

Wavelength/nm圖5 亞甲基藍(lán)加入CdTe量子點(diǎn)溶液前后的紫外可見吸收光譜圖

此外，根據(jù)許金鉤提出的熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅過程和動(dòng)態(tài)猝滅過程，均符合公式F0/F= 1 + Kqτ0M= 1 + KsvM，其中τ0代表量子點(diǎn)的平均熒光壽命，M代表亞甲基藍(lán)的濃度，Kq代表熒光衰減常數(shù)，Ksv代表回歸線的斜率.測(cè)得熒光衰減曲線后(譜圖未給出)，通過平均加權(quán)計(jì)算法得到了CdTe量子點(diǎn)的平均熒光壽命為20 ns[18].通過公式Kq=Ksv/τ0可得20 ℃和30 ℃時(shí)的Kq分別為2.121×1012和1.192×1012，均大于最大靜態(tài)猝滅常數(shù)(2×1010mol·L-1·s-1)，說明為靜態(tài)猝滅過程.綜上所述，通過變溫實(shí)驗(yàn)、紫外可見吸收光譜和計(jì)算均證明，亞甲基藍(lán)與CdTe之間生成了復(fù)合物，引起CdTe量子點(diǎn)熒光靜態(tài)猝滅.

2.4 實(shí)際樣品分析

通過測(cè)定一些金屬離子對(duì)該比率熒光體系熒光強(qiáng)度的影響，考察了該方法的選擇性.研究發(fā)現(xiàn)水中常見的鈉離子、鉀離子、鈣離子、鎂離子、氯離子、硫酸根離子均不會(huì)對(duì)體系熒光產(chǎn)生明顯的影響，即熒光強(qiáng)度不會(huì)增大或減小.雖然三價(jià)/二價(jià)鐵離子、銅離子、錳離子會(huì)同時(shí)引起量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的增大或減小，但是熒光強(qiáng)度比不會(huì)發(fā)生明顯的變化，這說明該比率熒光法用于亞甲基藍(lán)的檢測(cè)具有較好的選擇性.

將該熒光體系用于實(shí)際樣品的分析，水樣為模擬廢水，即向去離子水中加入確定量的亞甲基藍(lán)溶液得到樣品，分析結(jié)果如表1所示.回收率為97.60%-101.3%，說明本方法可以用于樣品中亞甲基藍(lán)的定量分析.

表1 水樣中亞甲基藍(lán)含量分析

3 結(jié) 論

成功地采用石墨烯量子點(diǎn)和CdTe量子點(diǎn)建立了一種比率熒光檢測(cè)方法，可用于水體中亞甲基藍(lán)的定量分析，最低檢出限為0.558 9 nmol·L-1.并采用變溫實(shí)驗(yàn)、紫外可見吸收和計(jì)算對(duì)亞甲基藍(lán)和CdTe量子點(diǎn)之間的相互作用機(jī)理進(jìn)行了討論，證明亞甲基藍(lán)所引起的CdTe量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度的降低為靜態(tài)猝滅過程.研究表明，該比率熒光法用于亞甲基藍(lán)的定量分析具有較好的靈敏度和選擇性，可用于實(shí)際水樣中亞甲基藍(lán)含量的分析.