王 靜，楊路宗，燕 楓

1.上海市長寧區(qū)天山中醫(yī)醫(yī)院麻醉科，上海 200000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院麻醉科，上海 200000；3.上海市松江區(qū)九亭醫(yī)院麻醉科，上海 201600

肺癌患者死亡率較高，每年約有160萬人死于肺癌[1]。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(SCLC)是肺癌的兩種亞型，NSCLC包括腺癌、鱗狀細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌，約占所有肺癌患者的85%[2]。盡管近年來治療NSCLC的技術(shù)和策略已有所改善，但該疾病的預(yù)后仍然很差。NSCLC的5年生存率僅在15%左右[3]。因此，尋找新的生物標(biāo)志物并闡明其潛在機(jī)制是開發(fā)NSCLC新療法的基礎(chǔ)。研究表明，肺癌細(xì)胞異常增殖與單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/真核細(xì)胞翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)信號通路有關(guān)，其涉及多效性AMPK的激活[4]。AMPK在調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，并充當(dāng)“代謝傳感器”來調(diào)節(jié)三磷酸腺苷(ATP)的水平[5]。它還與細(xì)胞生長有關(guān)，磷酸化的AMPK會(huì)抑制哺乳動(dòng)物mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的靶標(biāo)[6]。mTOR在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、生長、分化、遷移和存活中起著核心作用，4EBP1是mTOR下游信號級聯(lián)的一部分，它可通過mTOR的磷酸化被激活[7]。利多卡因是一種廣泛使用的酰胺類局部麻醉藥。近年來，許多研究報(bào)道了其在體外的抗腫瘤活性，比如在肝癌和宮頸癌中[8-9]，但關(guān)于利多卡因?qū)Ψ伟┘?xì)胞作用的報(bào)道較少。本研究擬探討利多卡因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖、侵襲及AMPK/mTOR/4EBP1信號通路的影響，為肺癌的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及藥物 人肺癌A549細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，批號CST-20200613；利多卡因購自武漢貝蘭生物科技有限公司，原料藥，純度99.9%，批號97958-12-3；5-氟尿嘧啶購自深圳市思美泉生物科技有限公司，原料藥，純度99.0%，批號TA10693-7。

1.2儀器與試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基、Matrigel基質(zhì)膠均購自美國Gibco公司，批號分別為QW74869、QW1659；胎牛血清購自美國Hyclone公司，批號XD458-32；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(CCK-8)測定試劑盒、結(jié)晶紫染料、TRIzol試劑、RIPA緩沖液均購自江蘇弘麒生物科技有限公司，批號分別為198043、195017、193016、200411；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(2×SYBR Green qPCR Master Mix)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒均購自上海冠泰生物科技有限公司，批號分別為A2020A109、A2020B117、A2020B207、A2020A105；AMPK、mTOR、4EBP1、磷酸化mTOR(p-mTOR)、磷酸化4EBP1(p-4EBP1)、GAPDH單克隆抗體、鼠抗人二抗均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司，批號分別為sc-3930、sc-7480、sc-5091、sc-7482、sc-5092、sc-1006、sc-1013；MJP-250S型二氧化碳培養(yǎng)箱購自浙江納德科學(xué)儀器有限公司；Labserv K3型酶標(biāo)儀購自上海沃元科技有限公司；E100型顯微鏡購自日本尼康公司；3420型transwell小室購自北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；TL988-Ⅱ型RT-PCR儀購自西安天隆科技有限公司；DYCZ-24EN型凝膠電泳儀購自北京六一生物科技有限公司；JY02G型凝膠成像儀購自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將肺癌A549細(xì)胞加入到RPMI-1640培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基中添加了10%的胎牛血清并在37 ℃、5%CO2、2%O2、93%N2環(huán)境中培養(yǎng)。設(shè)以下分組，肺癌A549細(xì)胞組,細(xì)胞濃度為每毫升5×106個(gè)肺癌A549細(xì)胞，并置于含10% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)；5-氟尿嘧啶組，肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)方法同肺癌A549細(xì)胞組，加入5-氟尿嘧啶，使5-氟尿嘧啶濃度為50 μmol/L[10]；利多卡因低、高劑量組，肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)方法同肺癌A549細(xì)胞組，各組分別加入利多卡因[11]，使利多卡因濃度分別為100、200 μmol/L。以上各組每組設(shè)6個(gè)平行孔，培養(yǎng)72 h。

1.3.2細(xì)胞增殖測定 各組細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束后，收集細(xì)胞，重懸，并將細(xì)胞種植到96孔板中，24 h后將10 μL CCK-8試劑加入每個(gè)孔中，并在37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h后，用酶標(biāo)儀在450 nm處測量吸光度(A)值，同時(shí)設(shè)置空白組(含有培養(yǎng)液、CCK-8)，計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.3.3細(xì)胞侵襲水平測定 transwell小室用于評估細(xì)胞的侵襲程度，操作如下：在無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，將100 mL Matrigel基質(zhì)膠包被在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將2×104個(gè)A549細(xì)胞懸浮于150 μL無血清培養(yǎng)基中，進(jìn)入上腔室，將700 μL含20% 胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于下腔室中，溫育48 h后，用棉簽輕輕地去除內(nèi)層上的細(xì)胞，并將外層細(xì)胞在4%多聚甲醛中固定15 min，并用0.1%結(jié)晶紫染料染色20 min，在5個(gè)隨機(jī)選擇的視野中對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。

1.3.4細(xì)胞AMPK、mTOR、4EBP1 mRNA水平測定 使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，通過mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成，使用2×SYBR Green qPCR Master Mix在PCR儀上進(jìn)行RT-PCR分析。β-actin是標(biāo)準(zhǔn)化AMPK、mTOR、4EBP1的內(nèi)參。采用2-ΔΔCt的方法計(jì)算AMPK、mTOR、4EBP1 mRNA的相對表達(dá)水平。引物由上海冠泰生物科技有限公司合成，引物序列如下：AMPK正向5′-GCACACATTGAAGAGGACAGAC-3′和反向5′-TATTGAAGGGGGTTCTGGTGGA-3′；mTOR正向5′-CCTAGTTTGGGAGGAGCAGA-3′和反向5′-GGCATGACACACAACACACT-3′；4EBP1正向5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′和反向5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTGA-3′；β-actin正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′和反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCATCG-3′。RT-PCR總反應(yīng)體系(10 μL)為：2×SYBR Green qPCR Master Mix 4 μL，cDNA模板1 μL，正向引物0.5 μL，反向引物0.5 μL，去離子水4 μL。參數(shù)設(shè)置為95 ℃ 48 s，57 ℃ 40 s，70 ℃ 40 s,循環(huán)40次，78 ℃ 1 min。

1.3.5細(xì)胞AMPK、mTOR、4EBP1、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平測定 使用RIPA緩沖液制備細(xì)胞裂解物，并檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離每種蛋白質(zhì)樣品(50 μg)，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，將膜與AMPK、mTOR、4EBP1、p-mTOR、p-4EBP1、GAPDH一抗(均為1∶500稀釋)置于4 ℃冰箱中孵育過夜，然后加入鼠抗人二抗(1∶3 000稀釋)孵育2 h，并用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，使用Image J軟件定量蛋白質(zhì)印跡上的蛋白條帶強(qiáng)度，并將其標(biāo)準(zhǔn)化。

2 結(jié) 果

2.1各組肺癌A549細(xì)胞A值、存活率比較 與肺癌A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、利多卡因低劑量組、利多卡因高劑量組A值、存活率降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，利多卡因低、高劑量組A值、存活率升高(P<0.05)；與利多卡因低劑量組比較，利多卡因高劑量組A值、存活率降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組肺癌A549細(xì)胞A值、存活率、侵襲能力比較

2.2各組肺癌A549細(xì)胞侵襲能力的比較 與肺癌A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、利多卡因低劑量組、利多卡因高劑量組穿膜數(shù)減少(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，利多卡因低、高劑量組穿膜數(shù)增加(P<0.05)；與利多卡因低劑量組比較，利多卡因高劑量組穿膜數(shù)減少(P<0.05)。見表1、圖1。

注：A為肺癌A549細(xì)胞組；B為5-氟尿嘧啶組；C為利多卡因低劑量組；D為利多卡因高劑量組。

2.3各組肺癌A549細(xì)胞AMPK、mTOR、4EBP1 mRNA表達(dá)水平比較 與肺癌A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、利多卡因低劑量組、利多卡因高劑量組AMPK mRNA相對表達(dá)水平升高，mTOR、4EBP1 mRNA相對表達(dá)水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，利多卡因低、高劑量組AMPK mRNA相對表達(dá)水平降低，mTOR、4EBP1 mRNA相對表達(dá)水平升高(P<0.05)；與利多卡因低劑量組比較，利多卡因高劑量組AMPK mRNA相對表達(dá)水平升高，mTOR、4EBP1 mRNA相對表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組肺癌A549細(xì)胞AMPK、mTOR、4EBP1 mRNA 相對表達(dá)水平比較

2.4各組肺癌A549細(xì)胞AMPK、mTOR、4EBP1、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平比較 與肺癌A549細(xì)胞組比較，5-氟尿嘧啶組、利多卡因低劑量組、利多卡因高劑量組AMPK蛋白表達(dá)水平升高，mTOR、4EBP1、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)；與5-氟尿嘧啶組比較，利多卡因低、高劑量組AMPK蛋白表達(dá)水平降低，mTOR、4EBP1、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)；與利多卡因低劑量組比較，利多卡因高劑量組AMPK蛋白表達(dá)水平升高，mTOR、4EBP1、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組肺癌A549細(xì)胞AMPK、mTOR、4EBP1、p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平比較

注：A為肺癌A549細(xì)胞組；B為5-氟尿嘧啶組；C為利多卡因低劑量組；D為利多卡因高劑量組。

3 討 論

局部麻醉在預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起著重要的作用，這可能歸因于其抑制了外科手術(shù)的應(yīng)激反應(yīng)。局部麻醉藥不僅可達(dá)到神經(jīng)阻滯、控制疼痛、抗心律失常和消炎的目的，而且還可引起神經(jīng)元細(xì)胞和其他類型細(xì)胞的死亡[12]，推測局部麻醉藥的細(xì)胞毒性可能起抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)，利多卡因可能是乳腺癌手術(shù)的理想浸潤麻醉劑，因?yàn)樗鼈兛梢栽谂R床相關(guān)濃度下誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞凋亡，證明了局部麻醉劑的潛在益處[13]；隨后，在研究利多卡因?qū)ξ赴┘?xì)胞的治療后發(fā)現(xiàn)，高劑量的利多卡因治療可導(dǎo)致細(xì)胞活力和集落形成呈劑量依賴性降低，利多卡因可能通過有絲分裂原激活的蛋白激酶途徑誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[14]。本研究評估了100、200 μmol/L的利多卡因的細(xì)胞毒性，發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶組、利多卡因低劑量組、利多卡因高劑量組A值、存活率低于肺癌A549細(xì)胞組，且穿膜數(shù)少于肺癌A549細(xì)胞組(P<0.05)；利多卡因高劑量組A值、存活率、穿膜數(shù)低于利多卡因低劑量組，且穿膜數(shù)少于利多卡因低劑量組(P<0.05)。這說明，利多卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖、侵襲具有明顯的抑制作用。

AMPK信號傳導(dǎo)是癌癥中最常見的調(diào)控途徑之一，AMPK的主要下游靶標(biāo)是蛋白激酶B(Akt)，Akt首先被鑒定為由反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的致癌基因，可誘導(dǎo)胸腺淋巴瘤。Akt在人實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中經(jīng)常被過度激活[15]。mTOR是Akt信號通路的關(guān)鍵下游轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，通過關(guān)鍵翻譯成分的磷酸化將上游營養(yǎng)物質(zhì)的利用與細(xì)胞生長、蛋白質(zhì)合成的控制聯(lián)系起來[16]。mTOR與雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶調(diào)控相關(guān)蛋白或雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶調(diào)控敏感蛋白組裝在一起，分別產(chǎn)生2個(gè)功能不同的復(fù)合物，即mTOR復(fù)合物1和2(mTORC1、mTORC2)。由mTORC1激活的2個(gè)最突出且特征最充分的翻譯調(diào)節(jié)因子是真核細(xì)胞翻譯起始因子4E(eIF4E)和4EBP1。4EBP1是eIF4E的已知結(jié)合伴侶，eIF4E是帽依賴翻譯的關(guān)鍵速率限制起始因子，可使4EBP1磷酸化導(dǎo)致其與eIF4E分離，并允許4EBP1在mRNA的5′端形成活性起始復(fù)合物。4EBP1對腫瘤的形成極為重要，已被確定為許多類型腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[17-18]。有研究表明，脂聯(lián)素可通過調(diào)節(jié)AMPK/mTOR/4EBP1信號通路抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞侵襲和遷移[19]，燈盞花素可抑制mTOR/4EBP1信號通路激活從而促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞凋亡[20]。本研究中，5-氟尿嘧啶組，利多卡因低劑量組、利多卡因高劑量組AMPK mRNA和蛋白表達(dá)水平高于肺癌A549細(xì)胞組(P<0.05)，mTOR、4EBP1 mRNA和蛋白及p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平低于肺癌A549細(xì)胞組(P<0.05)；利多卡因高劑量組AMPK mRNA和蛋白表達(dá)水平高于利多卡因低劑量組(P<0.05)，mTOR、4EBP1 mRNA和蛋白及p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)水平低于利多卡因低劑量組(P<0.05)，這表明利多卡因促進(jìn)AMPK mRNA和蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制mTOR、4EBP1 mRNA和蛋白及p-mTOR、p-4EBP1蛋白表達(dá)。同時(shí)說明，在肺癌A549細(xì)胞中，利多卡因通過激活A(yù)MPK的表達(dá)進(jìn)而抑制mTOR/4EBP1信號通路的激活。

綜上所述，利多卡因?qū)Ψ伟〢549細(xì)胞增殖、侵襲具有明顯抑制作用，其機(jī)制可能與利多卡因通過激活A(yù)MPK的表達(dá)進(jìn)而抑制mTOR/4EBP1信號通路的激活有關(guān)。