呂文濤，楊 華，楊彩梅，李 娜,，鄭自彬，王遠霞，王興鑫,，肖英平*

（1.省部共建國家農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江杭州 310000；2.浙江農(nóng)林大學(xué)動物科技學(xué)院，浙江杭州 311300）

血管生成素樣蛋白4（Angiopoietin-Like Protein 4，），也稱為禁食誘導(dǎo)脂肪因子（Fasting Induced Adipose Factor，），是一類與血管生成素（Angiopoietin，）結(jié)構(gòu)類似的分泌性蛋白家族成員。ANGPTL4具有N端的卷曲-螺旋結(jié)構(gòu)域和C端的纖維蛋白原樣結(jié)構(gòu)域，主要參與脂肪代謝、糖代謝、血管生成、炎癥反應(yīng)及胰島素敏感性等生理狀況的調(diào)節(jié)，尤其對脂肪代謝有著重要的調(diào)控作用，同時已有研究證實還在調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展和診療中起重要作用。Nielsen等研究發(fā)現(xiàn)ANGPTL4蛋白參與脂質(zhì)代謝，通過抑制活性起作用，會導(dǎo)致血漿甘油三酯（Triglyceride，TG）衍生的脂肪酸釋放減少。Altun等已確定肝脂肪變性患者血清表達水平較低，通過游離脂肪酸代謝和過氧化物酶體增殖物激活受體-（）的誘導(dǎo)，在脂肪肝疾病發(fā)病機制中起重要作用。Aronsson等研究表明，在動物機體內(nèi)受腸道菌群調(diào)控，腸桿菌增加會抑制的表達，使得表達不受抑制而導(dǎo)致脂質(zhì)沉積。的功能研究主要集中在人類和小鼠2個物種上，豬和牛的分別于2006年和2014年發(fā)現(xiàn)并開始研究其功能。在不同物種中的功能類似，通過抑制活性和提高脂肪細胞中甘油三酯的分解，從而降低機體脂肪組織的重量。然而，幾種主要動物的ANGPTL4蛋白生物信息學(xué)分析對比尚未有人研究。本文通過分析ANGPTL4的分子結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，從生物信息學(xué)角度揭示ANGPTL4的功能和作用，為探究不同物種ANGPTL4蛋白的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 不同物種基因序列的獲取 利用NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得人、鼠、馬、貓、牛、羊、豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚的基因和蛋白質(zhì)編碼登錄號，如表1所示。

表1 11個物種的ANGPTL4基因和蛋白登錄號

1.2 構(gòu)建ANGPTL4蛋白的系統(tǒng)進化樹 利用Ensembl（http://www.ensembl.org/index.html）數(shù)據(jù)庫信息，選取11種物種相應(yīng)的源基因，然后使用BioEdit（Verision8）軟件對上述不同物種基因蛋白序列進行比對分析，采用Poisson model模型及MEGA7.0 Neighbor-Joining方法構(gòu)建物種間系統(tǒng)進化樹。

1.3 不同物種ANGPTL4基本理化性質(zhì)分析 采用各種在線分析網(wǎng)站對豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚ANGPTL4的信號肽區(qū)域、易于被特定蛋白酶磷酸化的位點、糖基化位點、跨膜區(qū)及可能的螺旋卷曲結(jié)構(gòu)進行了分析，并將豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚的ANGPTL4蛋白進行比較。各理化性質(zhì)分析及在線分析網(wǎng)站如表2所示。

表2 不同物種的ANGPTL4基本理化性質(zhì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1基因的序列相似性與系統(tǒng)進化分析

2.1.1 不同物種編碼區(qū)序列相似性比對 如表3所示，反芻動物牛和羊之間編碼區(qū)序列的相似性最高，達到97.60%；其次是鴨和粉腳雁，序列相似性達到97.50%；人與黃顙魚的序列相似性最低，為49.50%。由表3可以看出，反芻動物及禽類在物種之間序列相似性很高，而其余物種之間的序列相似性不高（51.00%～62.60%）。

表3 不同物種編碼區(qū)（CDS）序列比例 %

2.1.2 不同物種ANGPTL4蛋白進化樹 如圖1所示，鴨與粉腳雁、雞的親緣關(guān)系最近，與黃顙魚的親緣關(guān)系最遠；哺乳類動物中，鴨與鼠的親緣關(guān)系最遠。鴨和粉腳雁的關(guān)系最近，表明在禽類中遺傳和表達差異最小，其次與雞的關(guān)系最近，表明在家禽中的表達差異較小。

圖1 不同物種ANGPTL 4蛋白的進化樹

2.2的基本理化性質(zhì)分析 如表4所示，豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚的親水性均為負值，預(yù)測結(jié)果表明ANGPTL4蛋白為親水性蛋白。鴨的不穩(wěn)定系數(shù)小于40，分析結(jié)果表明鴨ANGPTL4蛋白為穩(wěn)定性蛋白；而豬、雞、粉腳雁和黃顙魚的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，表明該4個物種的ANGPTL4蛋白為不穩(wěn)定性蛋白。如圖2所示，這幾種物種的氨基酸組成中都含有20種常見的氨基酸，亮氨酸（Leu）含量最高，半胱氨酸（Cys）含量最低；此外，3種禽類：雞（）、鴨（）和粉腳雁（）的ANGPTL4的氨基酸含量差別不大，而豬（）和黃顙魚（）與3種禽類的ANGPTL4中多數(shù)氨基酸含量差異比較大。

圖2 不同物種ANGPTL4氨基酸含量比

表4 不同物種ANGPTL4的基本理化性質(zhì)分析結(jié)果

2.3 ANGPTL4的親水/疏水性分析 如圖3所示，在1～20位之間5個物種氨基酸序列都極具疏水性。豬ANGPTL4疏水性最強的位點在第13位的亮氨酸、第14位的半胱氨酸，分值為2.311；親水性最強位點是第378位的谷氨酸，分值為-3.711。雞ANGPTL4疏水性最強的位點在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸，分值為2.544；親水性最強位點是第444位的組氨酸，分值為-3.633。鴨ANGPTL4疏水性最強的位點在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸、第12位的丙氨酸，分值為2.589；親水性最強位點是第448位的組氨酸，分值為-3.633。粉腳雁ANGPTL4疏水性最強的位點在第10位的亮氨酸、第11位的半胱氨酸、第12位的丙氨酸，分值為2.589；親水性最強位點是第450位的組氨酸，分值為-3.633。黃顙魚ANGPTL4疏水性最強的位點在第12位的蘇氨酸，分值為2.733；親水性最強位點是第368位的天冬氨酸，分值為-3.844。整體來看，ANGPTL4蛋白親水性氨基酸的數(shù)量遠多于疏水性氨基酸的數(shù)量，表明ANGPTL4為親水性蛋白，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

圖3 不同物種ANGPTL4親水/疏水曲線

2.4 ANGPTL4的信號肽分析 如圖4可知，不同物種在第18～26位氨基酸之間存在裂解位點；豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚氨基酸序列的裂解位點分別在25～26、18～19、19～20、20～21、20～21位；因此ANGPTL4蛋白存在信號肽結(jié)構(gòu)。且利用TMHMM 2.0分析發(fā)現(xiàn)，豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚的基因編碼殘基的所有氨基酸都不存在跨膜區(qū)域。

圖4 不同物種ANGPTL4信號肽分析

2.5 ANGPTL4的磷酸化位點 如圖5所示，豬ANGPTL4編碼蛋白有23個潛在磷酸位點，其中包括有15個Ser、7個Thr和1個Tyr磷酸化位點；雞ANGPTL4編碼蛋白有37個潛在磷酸位點，其中包括有25個Ser、10個Thr和2個Tyr磷酸化位點；鴨ANGPTL4編碼蛋白有40個潛在磷酸化位點，其中包括有27個Ser、10個Thr和3個Tyr磷酸化位點；粉腳雁ANGPTL4編碼蛋白有34個潛在磷酸位點，其中包括有23個Ser、9個Thr和2個Tyr磷酸化位點；黃顙魚ANGPTL4編碼蛋白有43個潛在磷酸位點，其中包括有28個Ser、13個Thr和2個Tyr磷酸化位點。同時從圖6可以看出，ANGPTL4蛋白質(zhì)序列中有易被特定蛋白酶磷酸化的位點，結(jié)果顯示：豬在S74位含有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在V281位有1種激酶結(jié)合位點群（Kin-bind）、在W389位有1種脂酶結(jié)合位點群（lip-bind）；雞在S85位和S238位各有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶群（Baso-ST-kin）、在W455位有1種脂酶結(jié)合位點群（lip-bind）；鴨在S91位含有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在W459位有1種脂酶結(jié)合位點群（lip-bind）；粉腳雁在S91位含有1種嗜堿性絲氨酸-蘇氨酸激酶（Baso-ST-kin）、在W461位有1種脂酶結(jié)合位點群（lip-bind）；黃顙魚在W418位有1種脂酶結(jié)合位點群（lip-bind）。

圖5 不同物種ANGPTL4序列中磷酸化位點

圖6 不同物種ANGPTL4序列中易于被特定蛋白酶磷酸化位點

2.6 ANGPTL4的糖基化分析 分析發(fā)現(xiàn)，豬只有1個典型N糖基化位點，位于183位；雞有5個典型的N糖基化位點，分別位于88、124、165、224、247位；鴨ANGPTL4有5個典型的N糖基化位點，分別位于第94、130、171、230、249位；粉腳雁ANGPTL4有6個典型的N糖基化位點，分別位于第94、130、171、230、249、253位；黃顙魚有5個典型的N糖基化位點79、115、151、205、335。

2.7基因編碼蛋白的卷曲螺旋分析 分析發(fā)現(xiàn)，不同物種的卷曲螺旋數(shù)量存在差異，但在50～250位氨基酸序列，大部分物種存在至少一個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

2.8 不同物種ANGPTL4二級結(jié)構(gòu)預(yù)測及三級結(jié)構(gòu)同源建模 如圖7所示，豬ANGPTL4蛋白由412個氨基酸組成，包含12個螺旋和8個折疊；雞ANGPTL4蛋白由478個氨基酸組成，包含17個螺旋和6個折疊；鴨ANGPTL4蛋白由482個氨基酸組成，17個螺旋和6個折疊；粉腳雁ANGPTL4蛋白由480個氨基酸組成，19個螺旋和6個折疊；黃顙魚ANGPTL4蛋白由436個氨基酸組成，包含14個螺旋和11個折疊。

圖7 不同物種ANGPTL4二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

ANGPTL4蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測如圖8所示。豬蛋白結(jié)構(gòu)C值為-0.5，目標蛋白和模板蛋白結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.65±0.13；雞蛋白結(jié)構(gòu)C值為-1.48，目標蛋白和模板蛋白結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.53±0.15；鴨ANGPTL4預(yù)測結(jié)果的蛋白結(jié)構(gòu)C值為-1.91，目標蛋白和模板蛋白結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.49±0.15；黃顙魚蛋白結(jié)構(gòu)C值為-1.79，目標蛋白和模板蛋白的結(jié)構(gòu)相似性的TM值為0.50±0.15。

圖8 不同物種ANGPTL4蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3 討 論

ANGPTL4蛋白在機體的多個組織中都有表達，結(jié)構(gòu)類似于血管生成素，但功能有所不同；mRNA在白色脂肪和肝臟中表達較多。Kim等利用ANG同源基因的PCR擴增尋找ANG的同源蛋白時發(fā)現(xiàn)了ANGPTL4蛋白家族；Kersten等在肝細胞中發(fā)現(xiàn)了新的靶基因——，又稱為。2002年，國際人類基因組織將該基因命名。

本文通過生物信息軟件對不同物種ANGPTL4蛋白的理化性質(zhì)、生物學(xué)功能、系統(tǒng)進化關(guān)系、蛋白二級/三級結(jié)構(gòu)等進行了分析及預(yù)測。分析表明，家禽之間親緣關(guān)系最近，鴨與粉腳雁序列相關(guān)性高達94.4%、鴨與雞的高達88.20%。結(jié)構(gòu)決定功能，因此可以推測，鴨的功能與粉腳雁和雞的功能類似，促進脂代謝并抑制LPL活性，進而引起高血脂。蛋白一級結(jié)構(gòu)中的半胱氨酸多形成二硫鍵以增強蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，而亮氨酸含有疏水側(cè)鏈，疏水作用是蛋白質(zhì)折疊的主要驅(qū)動力，因此亮氨酸等疏水氨基酸常作為水溶性蛋白質(zhì)的內(nèi)部支撐結(jié)構(gòu)。氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，亮氨酸含量最高，半胱氨酸含量最低，可以推測ANGPTL4蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性低且水溶性較好，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。分析結(jié)果表明ANGPTL4為細胞外的可溶性蛋白。整體來看，ANGPTL4蛋白親水性氨基酸的數(shù)量遠多于疏水性氨基酸的數(shù)量，表明ANGPTL4為親水性蛋白，與理化性質(zhì)分析結(jié)果一致。

信號肽作為蛋白質(zhì)的一個片段，是蛋白質(zhì)合成并釋放到胞外不可或缺的一部分。信號肽分析發(fā)現(xiàn)，ANGPTL4在N端前有一段信號肽，結(jié)合各物種ANGPTL4親水/疏水性分析比較顯示1～20位氨基酸極具疏水性，表明ANGPTL4前端信號肽序列極具疏水性。此外，分析表明ANGPTL4不存在跨膜結(jié)構(gòu)，推測ANGPTL4可能不通過跨膜發(fā)揮生物學(xué)作用，而在胞外或者固定在細胞膜表面發(fā)揮其生物學(xué)功能，這與已知的豬和雞的功能一致。

蛋白質(zhì)的磷酸化是由蛋白質(zhì)激酶（Kinase）催化的磷酸基團轉(zhuǎn)移反應(yīng)，是最常見、最重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用，磷酸化主要發(fā)生在蛋白質(zhì)的絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）等殘基上。磷酸化反應(yīng)后，由于蛋白質(zhì)加入了磷酸基團，蛋白質(zhì)的構(gòu)型、活性及其與其他分子相互作用的性能發(fā)生了改變。本研究的分析結(jié)果表明，ANGPTL4有多個潛在磷酸化位點，初步揭示ANGPTL4蛋白的這些位點可能是調(diào)控活性的靶點。Costa等研究中指出在脊椎動物發(fā)育中對脂質(zhì)和TG代謝起重要作用。是乳糜微粒、極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）等代謝關(guān)鍵因子，將血液中乳糜微粒和VLDL中的TG催化水解為甘油和脂肪酸，在血脂代謝和轉(zhuǎn)運中發(fā)揮著重要作用。從分析結(jié)果來看，不同物種ANGPTL4磷酸化位點的預(yù)測中發(fā)現(xiàn)激酶和脂蛋白脂酶結(jié)合位點群，揭示ANGPTL4蛋白參與機體脂質(zhì)代謝過程。

蛋白糖基化也是一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，是由糖基轉(zhuǎn)移酶催化的單糖與蛋白質(zhì)上的某些殘基形成共價連接。糖基化通常使蛋白質(zhì)在水中的溶解度增大，并使不同的蛋白質(zhì)打上不同的標記，改變多肽的構(gòu)象并增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。本研究中預(yù)測到了不同物種ANGPTL4蛋白的多個糖基化修飾位點，且氨基酸功能位點集中在45～250位范圍內(nèi)，預(yù)測該區(qū)段內(nèi)的氨基酸對不同物種ANGPTL4蛋白發(fā)揮其生物學(xué)功能有重要意義。糖基化有能夠使蛋白質(zhì)抵抗消化酶、賦予蛋白質(zhì)傳導(dǎo)信號以及輔助蛋白在糖基化以后正確折疊等多種作用，具有重要的生物學(xué)意義。此外，在45～250位氨基酸殘基范圍內(nèi)，多數(shù)物種都存在至少1個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)和至少1個磷酸化位點，可以推測的這個螺旋結(jié)構(gòu)是其與其他分子相互作用的靶點。

4 結(jié) 論

本研究利用多種生物信息學(xué)軟件分析了豬、雞、鴨、粉腳雁和黃顙魚等幾種不同物種ANGPTL4蛋白的氨基酸組成特點、理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)：ANGPTL4蛋白的氨基酸組成在禽類與哺乳動物和水產(chǎn)之間有一定的差別；對各物種ANGPTL4蛋白的疏水性、磷酸化位點、糖基化位點以及卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的預(yù)測結(jié)果表明，在45～250位氨基酸區(qū)域具有特定的理化性質(zhì)和分子結(jié)構(gòu)，推測該序列可作為調(diào)控功能的靶位點。該研究將為進一步研究的特殊功能性及其與其他分子相互作用的機制提供了生物信息學(xué)參考。