楊瀟瀛 劉旭豪 高福利 張浩林 韓瑩瑩 翁 強(qiáng) 袁崢嶸

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083)

腸道微生物是定植在腸道內(nèi)數(shù)量龐雜的微生物群，在動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)和健康中起著重要作用，對(duì)宿主的免疫、代謝、神經(jīng)系統(tǒng)也具有一定的調(diào)節(jié)作用[1-2]。反過(guò)來(lái)，宿主為腸道微生物提供了一個(gè)營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境，支持居住在多個(gè)生態(tài)位的不同微生物群落的發(fā)展[3]。腸道微生物已受到研究人員廣泛關(guān)注。冬眠是動(dòng)物進(jìn)化出的一種應(yīng)對(duì)冬季低溫和食物短缺的生存特性，典型特征是長(zhǎng)時(shí)間的昏睡(topor)，在此期間體溫僅略高于環(huán)境溫度，基礎(chǔ)代謝率降低到2%～4%[4]。冬眠前幾周至幾個(gè)月動(dòng)物開(kāi)始為冬眠做準(zhǔn)備，在這一時(shí)期動(dòng)物會(huì)過(guò)度進(jìn)食，白色脂肪大量增加，體重可增加近1倍，在冬眠期間依靠?jī)?chǔ)備的脂肪提供能量滿足自身需求[5]。在冬眠哺乳動(dòng)物中，食物短缺驅(qū)使腸道菌群依賴宿主來(lái)源的營(yíng)養(yǎng)而不是外源底物。從組織學(xué)角度來(lái)看，冬眠會(huì)伴隨著腸道形態(tài)的變化，包括質(zhì)量、絨毛高度和腸細(xì)胞更新減少[6-7]。從微生物學(xué)的角度來(lái)看，冬眠會(huì)改變腸道微生物區(qū)系。Dill-Mcfarland等[8]對(duì)十三條紋地松鼠(Ictidomystridecemlineatus)盲腸微生物的研究表明冬眠期間厚壁菌門(Firmicutes)的相對(duì)豐度較低，而擬桿菌門(Bacteroidetes)和疣微菌門(Verrucomicrobia)的相對(duì)豐度較高。Stevenson等[9]研究表明，相對(duì)于夏季盲腸微生物組成，北極地松鼠(Urocitellusparryii)在冬眠期間厚壁菌門的相對(duì)豐度降低，擬桿菌門、疣微菌門和變形菌門(Proteobacteria)的相對(duì)豐度增加。Sommer等[10]對(duì)棕熊的研究表明，與活躍期相比，冬眠降低了厚壁菌門和放線菌門(Actinobacteria)的數(shù)量，增加了擬桿菌門的數(shù)量。同時(shí)，包括甘油三酯、膽固醇和膽汁酸在內(nèi)的幾種參與脂質(zhì)代謝的代謝物也受到冬眠的影響。

野生達(dá)烏爾黃鼠(Spermophilusdauricus)是儲(chǔ)脂類冬眠動(dòng)物的典型代表，每年9—10月入蟄，次年3—4月出蟄，由反復(fù)的入眠—深冬眠—激醒的冬眠陣進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月的冬眠[11]。根據(jù)冬眠陣異溫(體溫<30 ℃)階段的持續(xù)時(shí)間和最低體溫可將其分為深冬眠陣(deep hibernation bouts,DHB)、短冬眠陣(short hibernation bouts,SHB)和日眠陣(daily torpor bouts,DTB)3類。其中，DTB多在冬眠初期發(fā)生，特點(diǎn)為在連續(xù)的淺而短的冬眠陣中體溫逐漸降低，直到達(dá)到DHB，稱之為體溫的“試降(test drop,TD)”過(guò)程[12]。然而，在誘導(dǎo)冬眠期間野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)如何變化尚未有報(bào)道。本研究對(duì)誘導(dǎo)冬眠組與對(duì)照組野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，利用16S rRNA測(cè)序技術(shù)研究其在誘導(dǎo)冬眠過(guò)程中腸道菌群如何改變以幫助機(jī)體維持生理活動(dòng)，并對(duì)腸道菌群功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，為今后進(jìn)一步研究腸道菌群作用機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

2019年9月于河北省張家口壩上草原(北緯40.83°，東經(jīng)114.88°)捕獲野生達(dá)烏爾黃鼠8只，體重(363.4±36.9) g，飼喂標(biāo)準(zhǔn)鼠飼糧，自由采食及飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d后將野生達(dá)烏爾黃鼠隨機(jī)分為2組，每組4只。對(duì)照組于自然溫度[(22±4) ℃]下正常飼養(yǎng)，誘導(dǎo)冬眠組于(4±1) ℃恒溫箱中飼養(yǎng)，無(wú)光照。以少量木屑置于黃鼠背部后，以木屑是否滑落為依據(jù)判定冬眠誘導(dǎo)是否成功。誘導(dǎo)10 d，使用紅外測(cè)溫儀及電子秤測(cè)定2組黃鼠體溫和體重。采用二氧化碳吸入法處死動(dòng)物，采集2組黃鼠盲腸內(nèi)容物立即置入液氮，保存在-80 ℃冰箱備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及測(cè)序

根據(jù)TIANamp DNA試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]說(shuō)明書(shū)提取每個(gè)腸道樣本的總基因組DNA后，用260和280 nm處吸光度的比值(A260/280)和瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估DNA質(zhì)量和完整性。采用兩步PCR法，使用正向引物B341F(5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’)和反向引物B785R(5’-ACTACHVGGGTATCTAATCC-3’)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)。所有擴(kuò)增反應(yīng)均在25 μL體積內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，這3個(gè)步驟重復(fù)25個(gè)循環(huán)，最終72 ℃延伸持續(xù)5 min。取2 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)目的片段后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1×AMPure XP Beads純化，進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增。除變性—退火—延伸3個(gè)步驟進(jìn)行8個(gè)循環(huán)外，其余步驟與第1輪PCR擴(kuò)增相同。使用QIAick Gel Extraction Kit(Qiagen,V alencia,CA，美國(guó))試劑盒從2%瓊脂糖凝膠中對(duì)目的片段進(jìn)行切膠回收。以KAPA Library Quantialization Kit(KAPA Biossystems,美國(guó))作為文庫(kù)混合標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定量。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和定量后，在杭州開(kāi)泰生物技術(shù)有限公司的Illumina MiSeq平臺(tái)上進(jìn)行雙端高通量并行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

高通量測(cè)序結(jié)果為雙端fastq文件格式，使用VSEARCH[13]v2.14.1將雙端序列合并形成單個(gè)序列，并切除正反向引物，以錯(cuò)誤率0.01進(jìn)行質(zhì)控。添加miniquesize為8去除低豐度噪音后，使用USEARCH v10.0.240中的unoise3[14]對(duì)序列進(jìn)行去噪(denoise)以獲得單堿基精度擴(kuò)增子序列變體(amplicon sequence variants,ASVs)，同時(shí)去除嵌合體，使用USEARCH[15]v10.0.240生成特征表。

比對(duì)RDP v1.6數(shù)據(jù)庫(kù)，以0.60為閾值使用VSEARCH v2.14.1確定每個(gè)ASVs的分類信息，并去除質(zhì)體和非細(xì)菌、古菌。經(jīng)等量抽樣標(biāo)準(zhǔn)化后，用vegan軟件包[16]計(jì)算群落豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)，以確定野生達(dá)烏爾黃鼠組內(nèi)的α多樣性。取1%～100%序列中ASVs的數(shù)量來(lái)計(jì)算稀釋過(guò)程的豐富度變化。利用Bray_Curtis距離計(jì)算β多樣性，并用主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)進(jìn)行可視化，找出組間微生物區(qū)系的結(jié)構(gòu)差異。在分類學(xué)上從門水平到屬水平對(duì)物種信息進(jìn)行注釋。所有上述數(shù)據(jù)均使用R v3.6.2生成可視化圖像。使用線性判別分析(linear discriminant analysis effect size,LEfSe)來(lái)確定不同分類層級(jí)的物種差異[17]。

基于高質(zhì)量序列，使用PICRUSt[18]對(duì)微生物功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，以得到KEGG通路中的基因相對(duì)豐度。使用STAMP[19]v2.1.1.0分析具有顯著差異的功能通路(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)冬眠組體重與體溫變化

誘導(dǎo)冬眠組誘導(dǎo)10 d后，分別測(cè)量對(duì)照組與誘導(dǎo)冬眠組野生達(dá)烏爾黃鼠體重及體溫。如圖1所示，對(duì)照組黃鼠體重(373.7±37.4) g，誘導(dǎo)冬眠組黃鼠體重(297.3±28.9) g，誘導(dǎo)冬眠組與對(duì)照組黃鼠相比，體重降低20.4%，差異顯著(P<0.05)。對(duì)照組黃鼠體溫(31.5±2.2) ℃，誘導(dǎo)冬眠組黃鼠體溫(22.3±4.5) ℃，相比對(duì)照組下降29.2%，差異顯著(P<0.05)。上述結(jié)果說(shuō)明機(jī)體在誘導(dǎo)冬眠期間調(diào)節(jié)自身體重及體溫應(yīng)對(duì)寒冷環(huán)境。

**：P<0.01；***：P<0.001。圖1 對(duì)照組(C)與誘導(dǎo)冬眠組(H)野生達(dá)烏爾黃鼠體重及體溫Fig.1 Body mass and body temperature of wild ground squirrel between control group (C) and induced hibernation group (H)

2.2 細(xì)菌群落豐富度和α多樣性分析

稀釋曲線可評(píng)估樣本測(cè)序量并比較2組樣本中物種豐富度。如圖2-A所示，對(duì)照組和誘導(dǎo)冬眠組物種豐富度稀釋曲線均趨于平坦，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量處于合理范圍，測(cè)序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣本中所有物種，更多的數(shù)據(jù)量對(duì)發(fā)現(xiàn)新的ASVs的貢獻(xiàn)很小。Shannon指數(shù)同時(shí)考慮了物種豐富度以及均勻度，與物種多樣性呈正相關(guān)，指數(shù)越大，樣本中物種的多樣性越大，反之越小。如圖2-B所示，誘導(dǎo)冬眠組Shannon指數(shù)顯著高于對(duì)照組(P<0.05),說(shuō)明誘導(dǎo)冬眠可能使腸道菌群豐富度和均勻度提升。

2.3 β多樣性分析

β多樣性分析表示多組樣本之間的差異，這種差異可以通過(guò)群落樣品之間的距離來(lái)表現(xiàn)，2個(gè)群落組成成分越相似，它們之間距離就越小。本研究以Bray_Curtis指數(shù)進(jìn)行衡量，對(duì)誘導(dǎo)冬眠組與對(duì)照組野生達(dá)烏爾黃鼠進(jìn)行PCoA。如圖3所示，誘導(dǎo)冬眠組與對(duì)照組樣本各自可以很好的聚為一類，并且第1主坐標(biāo)可以解釋樣本總差異的41.47%，第2主坐標(biāo)可以解釋樣本總差異的20.42%，說(shuō)明對(duì)照組與誘導(dǎo)冬眠組間細(xì)菌群落存在一定差異。

圖3 對(duì)照組(C)與誘導(dǎo)冬眠組(H)野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群PCoAFig.3 PCoA of gut microbiota of wild ground squirrel between control group (C) and induced hibernation group (H)

2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平菌群結(jié)構(gòu)

在門水平對(duì)相對(duì)豐度前9的菌群分析作圖，得到菌群結(jié)構(gòu)弦圖(圖4-A)，從圖中可以看出厚壁菌門和擬桿菌門在誘導(dǎo)冬眠組和對(duì)照組野生達(dá)烏爾黃鼠的腸道菌群中均占據(jù)統(tǒng)治地位，在所有樣本中所占到的平均比例分別為56.1%和29.5%，其次是疣微菌門，所占比例為12.7%，變形菌門、放線菌門、軟壁菌門(Tenericutes)的相對(duì)豐度均不足3%。

(A)：豐富度稀釋曲線；(B)：Shannon指數(shù)。圖B中不同小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)。(A)： richness rarefaction curve; (B): Shannon index. In the figure B, different small letters mean significant difference (P<0.05).圖2 對(duì)照組(C)與誘導(dǎo)冬眠組(H)野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群α多樣性Fig.2 α diversity of gut microbiota of wild ground squirrel between control group (C) and induced hibernation group (H)

2.4.2 屬水平菌群結(jié)構(gòu)

在屬水平對(duì)相對(duì)豐度前10的菌群分析作圖。如圖4-B所示，有28.1%的序列未能歸類，被列為未分類(Unassigned)，其余相對(duì)豐度大于3%的菌屬分別為乳桿菌屬(Lactobacillus,21.7%)、阿克曼菌屬(Akkermansia,11.6%)、擬桿菌屬(Bacteroides,10.8%)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium,8.7%)、梭狀芽胞桿菌ⅩⅣa屬(Clostridium_ⅩⅣa,7.7%)和普雷沃菌屬(Prevotella,6.9%)。

2.5 菌群結(jié)構(gòu)差異分析

為在ASVs水平檢測(cè)誘導(dǎo)冬眠組和對(duì)照組腸道菌群的差異，本研究使用曼哈頓圖分析了門水平上ASVs的富集。如圖5所示，在2組中，ASVs主要富集在擬桿菌門、厚壁菌門、變形菌門和疣微菌門；并且，從圖中可以看出，相對(duì)于對(duì)照組，誘導(dǎo)冬眠組黃鼠腸道菌群中擬桿菌門的相對(duì)豐度升高，厚壁菌門和疣微菌門的相對(duì)豐度降低。

Phylum：門；Firmicutes:厚壁菌門;Bacteroidetes:擬桿菌門;Verrucomicrobia:疣微菌門;Proteobacteria:變形菌門;Unassigned:未分類;Actinobacteria:放線菌門;Tenericutes:軟壁菌門;Fusobacteria:梭桿菌門;Other:其他;Genus：屬；Lactobacillus:乳桿菌屬;Akkermansia:阿克曼菌屬;Bacteroides:擬桿菌屬;Phascolarctobacterium:考拉桿菌屬;Clostridium_ⅩⅣa:梭狀芽胞桿菌ⅩⅣa屬;Prevotella:普雷沃菌屬;Blautia:布勞特氏菌屬;Clostridium_ⅩⅧ:梭狀芽胞桿菌ⅩⅧ屬。下圖同the same as below。圖4 對(duì)照組(C)與誘導(dǎo)冬眠組(H)野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群組成Fig.4 Composition of gut microbiota of wild ground squirrel between control group (C) and induced hibernation group (H)

Level：水平；Depleted:降低;Enriched:增加;NotSig:不顯著;CPM:counts per million每百萬(wàn)數(shù);Phylum of Features:特征門。圖5 誘導(dǎo)冬眠組(H)相比于對(duì)照組(C)門水平差異菌群曼哈頓圖(FDR校正,P<0.05,秩和檢驗(yàn))Fig.5 Manhattan plot of different microbiota at phylum level compared induced hibernation group (H) with control group (C)(FDR adjusted, P<0.05, Wilcoxon rank sum test)

為進(jìn)一步探究誘導(dǎo)冬眠期間野生達(dá)烏爾黃鼠差異性腸道菌群，本研究使用了LEfSe方法進(jìn)行分析。由圖6可知，在綱水平，梭菌綱(Clostridia)、厚壁菌綱(Negativicutes)的相對(duì)豐度在誘導(dǎo)冬眠期較高；在目水平，梭菌目(Clostridiales)、月形單孢菌目(Selenomonadales)的相對(duì)豐度在誘導(dǎo)冬眠期增加;此外，在科水平上氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、毛螺菌科(Lachnospiraceae)和在屬(Genus)水平上考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、梭狀芽胞桿菌ⅩⅣa屬(Clostridium_ⅩⅣa)、巴尼斯菌屬(Barnesiella)、埃格特菌屬(Eggerthella)、Lactonifactor、羅賓氏菌屬(Robinsoniella)的相對(duì)豐度均在誘導(dǎo)冬眠期增加。

c:綱 class;o:目 order;f:科 family;g:屬 genus;Clostridiales:梭菌目;Clostridia:梭菌綱;Phascolarctobacterium:考拉桿菌屬;Selenomonadales:月形單孢菌目;Acidaminococcaceae:氨基酸球菌科;Negativicutes:厚壁菌綱;Lachnospiraceae:毛螺菌科;Clostridium_ⅩⅣa:梭狀芽胞桿菌ⅩⅣa屬;Barnesiella:巴尼斯菌屬;Eggerthella:埃格特菌屬;Robinsoniella:羅賓氏菌屬;LDA SCORE:線性判別分析得分 linear discriminant analysis score。圖6 LEfSe鑒定誘導(dǎo)冬眠組(H)野生達(dá)烏爾黃鼠代表性差異菌群(LDA>2，P<0.05)Fig.6 Representative differential microbiota of wild ground squirrel in induced hibernation group (H) identified by LEfSe (LDA>2, P<0.05).

2.6 PICRUSt菌群功能預(yù)測(cè)

為確定2組樣本中菌群功能的差異性，利用PICRUSt軟件對(duì)代表性序列KEGG第3層級(jí)通路進(jìn)行預(yù)測(cè)。如圖7所示，在誘導(dǎo)冬眠組存在顯著差異的功能通路有11個(gè)(P<0.05)，主要包括碳水化合物代謝通路(carbohydrate metabolism)、磷酸戊糖途徑(pentose phosphate pathway)、細(xì)菌趨化性(bacterial chemotaxis)等，在對(duì)照組有5個(gè)顯著差異的功能通路(P<0.05)，主要包括脂類生物合成蛋白質(zhì)通路(lipid biosynthesis proteins)、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶通路(prenyltransferases)等。

Biosynthesis of ansamycins:安莎霉素的生物合成;Other transporters:其他轉(zhuǎn)運(yùn)者;Porphyrin and chlorophyll metabolism:卟啉與葉綠素代謝;Prenyltransferases:異戊烯基轉(zhuǎn)移酶通路;Carbohydrate metabolism:碳水化合物代謝通路;Phosphatidylinositol signaling system:磷脂酰肌醇信號(hào)系統(tǒng);Lipid biosynthesis proteins:脂類生物合成蛋白通路;Sporulation:孢子形成;Other ion-coupled transporters:其他離子偶聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白;Mineral absorption:礦物質(zhì)吸收;Nucleotide excision repair:核苷酸剪切修復(fù);Pentose phosphate pathway:磷酸戊糖途徑;Electron transfer carriers:電子轉(zhuǎn)移載體;Bacterial chemotaxis:細(xì)菌趨化性;Taurine and hypotaurine metabolism:牛磺酸和亞?；撬岽x;Ether lipid metabolism:醚脂質(zhì)代謝;confidence intervals:置信區(qū)間;Mean proportion:平均占比;Difference in mean proportions:平均占比差異;P-value (corrected):校正P值。圖7 對(duì)照組(C)和誘導(dǎo)冬眠組(H)野生達(dá)烏爾黃鼠在KEGG第3層級(jí)通路中的功能預(yù)測(cè)差異分析Fig.7 Differential analysis of function prediction in the third level KEGG pathway of wild ground squirrel between control group (C) and induced hibernation group (H)

3 討 論

腸道微生物寄生在宿主體內(nèi)并與宿主相互作用，形成了平衡、復(fù)雜、多樣的腸道微生物群系統(tǒng)。與宿主基因組不同，微生物組有很大可塑性，可以很容易地適應(yīng)各種環(huán)境和宿主源性刺激。腸道微生物的結(jié)構(gòu)和組成受遺傳、免疫狀態(tài)、腸道環(huán)境和飲食等幾個(gè)宿主特征的影響，其中飲食為關(guān)鍵決定因素[20]。為應(yīng)對(duì)冬季溫度降低、食物短缺等問(wèn)題，熊[10]、蝙蝠[21]、嚙齒動(dòng)物[8-9,22]、兩棲動(dòng)物[23-24]等形成了冬眠的生存特性。冬眠期間，動(dòng)物停止進(jìn)食，機(jī)體體溫顯著降低，代謝率減慢[25]。已有研究表明腸道微生物在冬眠期間會(huì)做出適應(yīng)性改變，普遍情況下冬眠期間厚壁菌門的相對(duì)豐度降低，擬桿菌門和變形菌門的相對(duì)豐度升高[26]。

為了探究在誘導(dǎo)冬眠時(shí)期，腸道菌群如何改變得以輔助維持機(jī)體正常生命活動(dòng)，本研究對(duì)野生達(dá)烏爾黃鼠進(jìn)行誘導(dǎo)冬眠，并收集盲腸內(nèi)容物進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，通過(guò)α、β多樣性分析、分類學(xué)組成分析、LEfSe差異分析、功能預(yù)測(cè)等研究了誘導(dǎo)冬眠期間野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及功能的變化。結(jié)果表明，誘導(dǎo)冬眠組黃鼠體重及體溫均顯著下降。體重減輕可能是由最大限度地吸收熱量并增加腸道、絨毛和微絨毛長(zhǎng)度的適應(yīng)性機(jī)制引起的[27]。作為儲(chǔ)脂類冬眠動(dòng)物，野生達(dá)烏爾黃鼠冬眠前后的體重變化與冬眠密切相關(guān)，如北極地松鼠在進(jìn)入冬眠前幾周內(nèi)體重增加，在冬眠期體重下降30%[28]。黃腹旱獺(Marmotaflaviventris)在冬眠前體重增加150%，冬眠后動(dòng)物體脂肪從生成狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉纸鉅顟B(tài)，體重也隨著降低[29]。體溫下降同樣為冬眠期間主要的特點(diǎn)之一，且體溫的節(jié)律在冬眠期間被抑制或者減弱[30]。楊明等[12]研究表明，當(dāng)達(dá)烏爾黃鼠體溫降低到30 ℃以下可認(rèn)定為開(kāi)始入眠，環(huán)境溫度處于-5～10 ℃時(shí)，達(dá)烏爾黃鼠為深冬眠狀態(tài)，其體溫保持在-2.4～11.0 ℃，隨環(huán)境溫度變化而變化；環(huán)境溫度在3～10 ℃時(shí)個(gè)體處于日眠狀態(tài)，體溫保持在22～28 ℃。冬眠中的動(dòng)物對(duì)體溫調(diào)節(jié)能力的降低，有利于減少用于體溫調(diào)節(jié)的代謝產(chǎn)熱，從而減少能量消耗。

α多樣性分析表明野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群在冬眠期Shannom指數(shù)較對(duì)照組顯著升高,說(shuō)明冬眠期間微生物豐富度和均勻度顯著增加。對(duì)十三條紋地松鼠Shannon指數(shù)的研究表明，腸道菌群物種多樣性在不同季節(jié)沒(méi)有顯著差異[8]；歐洲熊蜂(Bombusterrestris)在冬眠后Shannon指數(shù)升高[31]；兩棲動(dòng)物東北林蛙(Ranadybowskii)[24]、斑腿泛樹(shù)蛙(Polypedatesmegacephalus)[32]、馬鐵菊頭蝠[21]腸道菌群Shannon指數(shù)在冬眠期降低。在冬眠期間腸道菌群α多樣性表現(xiàn)出的結(jié)果差異可能是由于物種間差異及其食性差異引起的?；贐ray_Curtis距離矩陣的β多樣性分析結(jié)果表明野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)按誘導(dǎo)冬眠組與對(duì)照組聚集，2組樣本群落結(jié)構(gòu)存在差異。

菌群結(jié)構(gòu)分析表明野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群在門水平主要富集在厚壁菌門、擬桿菌門、疣微菌門和變形菌門，在屬水平上主要富集于乳桿菌屬，這一結(jié)果與其他嚙齒類動(dòng)物如十三線地松鼠[8]、北極地松鼠[9]、小林姬鼠(Apodemussylvaticus)[33]、北美紅松鼠(tamiasciurushudsonicus)[34]腸道優(yōu)勢(shì)菌群一致。厚壁菌門和擬桿菌門在機(jī)體中占據(jù)主要地位，厚壁菌門是桿狀或球形的革蘭氏陽(yáng)性菌，可通過(guò)包括淀粉體(amylosomes)和纖維小體(cellulosomes)的多酶復(fù)合物降解多糖[35]。擬桿菌門為革蘭氏陰性菌，被認(rèn)為是多糖的主要降解者，除此之外還可降解碳水化合物和蛋白質(zhì)[36]。同時(shí)，厚壁菌門與擬桿菌門的比例與疾病狀態(tài)的易感性也有關(guān)[37]。誘導(dǎo)冬眠組擬桿菌門的相對(duì)豐度增加可能是由于它們?cè)谌狈ι攀扯嗵堑那闆r下，更多地降解宿主多糖。除此之外，在通過(guò)LEfSe對(duì)2組野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群的差異分析發(fā)現(xiàn)在屬水平考拉桿菌屬、梭狀芽胞桿菌ⅩⅣa屬、巴尼斯菌屬、埃格特菌屬、Lactonifactor、羅賓氏菌屬均在冬眠期相對(duì)豐度增加。研究表明考拉桿菌屬(氨基酸球菌科)可利用擬桿菌屬和普雷沃菌屬降解動(dòng)物體內(nèi)不能被吸收消化的粗纖維產(chǎn)生的琥珀酸鹽作為碳源，產(chǎn)生短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)為機(jī)體提供營(yíng)養(yǎng)[38]，說(shuō)明誘導(dǎo)冬眠組腸道菌群中考拉桿菌屬的相對(duì)豐度增加有利于冬眠期機(jī)體更好的維持生理狀態(tài)。

本研究同時(shí)采用PICRUSt對(duì)誘導(dǎo)冬眠組與對(duì)照組野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群進(jìn)行了功能預(yù)測(cè)，基于KEGG第3層級(jí)的功能基因分析顯示碳水化合物代謝通路、磷酸戊糖途徑、細(xì)菌趨化性等11個(gè)功能通路在誘導(dǎo)冬眠組顯著富集。研究表明，宿主黏蛋白產(chǎn)生及宿主飲食攝入的碳水化合物可以被腸道微生物發(fā)酵，產(chǎn)生以SCFAs(主要包括乙酸、丙酸、丁酸)為主的代謝產(chǎn)物，調(diào)節(jié)機(jī)體能量攝入[39]。在對(duì)照組顯著富集的通路主要包括脂類生物合成蛋白質(zhì)通路、異戊烯基轉(zhuǎn)移酶通路等有5個(gè)功能通路。這進(jìn)一步證明了腸道菌群具有參與機(jī)體能量代謝的能力，在冬眠期間調(diào)節(jié)機(jī)體生理功能保持穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

① 野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群在冬眠期間發(fā)生改變，菌群多樣性升高，擬桿菌門的相對(duì)豐度升高，厚壁菌門和疣微菌門的相對(duì)豐度降低。

② 野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群在冬眠期間考拉桿菌屬、梭狀芽胞桿菌ⅩⅣa屬、巴尼斯菌屬、埃格特菌屬、Lactonifactor、羅賓氏菌屬的相對(duì)豐度升高。

③ 誘導(dǎo)冬眠組野生達(dá)烏爾黃鼠腸道菌群主要富集于碳水化合物代謝通路、磷酸戊糖途徑、細(xì)菌趨化性等通路。