梁 星，鄧龍雪，張 宇，劉建忠，吳曉彤*

1內(nèi)蒙古大學生命科學學院；2內(nèi)蒙古蒙驢食品有限公司，呼和浩特 010070

驢乳,被譽為“最佳的人乳替代品”，脂肪含量低，不飽和脂肪酸、維生素及乳糖含量高，具有較強的保健功能和治療人體免疫相關疾病等作用[1]。作為乳清蛋白性乳類，驢乳清蛋白中含有較高含量的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白和溶菌酶。α-乳白蛋白可以有效抑制有害細菌，有利于嬰幼兒的生長發(fā)育；β-乳球蛋白在消化過程中則可以和營養(yǎng)成分特異性結(jié)合[2]，起到保護營養(yǎng)成分的作用；而含量較高的溶菌酶使驢乳具有較強的抗菌功能[3]。此外，驢乳清蛋白中還含有免疫球蛋白、血清白蛋白以及表皮生長因子等多種微量成分，對機體的抗病機制有著重要的影響。因而，驢乳的開發(fā)利用有著巨大的社會價值和市場前景。但目前國內(nèi)驢乳產(chǎn)品單一，驢乳清蛋白的利用率更是被大為限制，其經(jīng)濟效益未能得到最大釋放。利用蛋白酶酶解驢乳清蛋白制備生物活性肽有助于進一步研究驢乳產(chǎn)品的綜合價值。

生物活性肽是指有利于生命機體活動和健康，能夠優(yōu)化機體代謝環(huán)境的小肽類物質(zhì)[4],具有抗菌、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)及降血壓等多種生物活性功能[5-8]。其中，抗氧化活性肽可以通過提供質(zhì)子、金屬離子螯合物和抑制脂質(zhì)過氧化等作用來清除體內(nèi)多余的自由基[9]。同時，肽鏈中疏水性氨基酸和芳香族氨基酸所占比例與多肽抗氧化活性呈正相關關系，比例愈高，抗氧化活性愈強，愈有益于機體的氧化防御[10]。目前動物乳蛋白是國內(nèi)外研究抗氧化活性肽的熱點，但以牛乳蛋白為原材料居多，而針對驢乳蛋白抗氧化活性肽的研究卻并不多見。

國外已有研究證實驢乳的總抗氧化能力高于人乳[11]，表明驢乳經(jīng)酶解后釋放的肽具有一定的抗氧化能力，驢乳是提取抗氧化肽的優(yōu)質(zhì)原材料，然而國內(nèi)對驢乳源抗氧化肽的研究較少，尋找一種可行的制備驢乳清蛋白抗氧化肽的工藝技術路線，對抗氧化肽應用于醫(yī)學、食品、保健等領域具有重大的意義，也可以發(fā)揮出驢乳的開發(fā)意義及市場經(jīng)濟效益。所以本實驗通過計算機模擬酶解篩選出最適蛋白酶后對驢乳清蛋白進行酶解，為開發(fā)抗氧化活性肽功能產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

驢乳清粉(陜西金潤生物科技有限公司，批號為JRSW200513-1)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH自由基，上海源葉生物科技有限公司)；α-胰凝乳蛋白酶(1 500 U/mg，上海源葉生物科技有限公司)；酪氨酸(純度≥99%，上海吉至生化科技有限公司)；福林酚試劑(1 mol/L，北京譜析公司)；Na2CO3(分析純，欣之然電線電纜專營店)；氫氧化鈉(分析純，武漢吉業(yè)升化工有限公司)；蛋白marker(北京賽默飛科技有限公司)；無水乙醇(東光縣東恒化工有限公司)；鹽酸(純度≥31%，石家莊市艷起發(fā)化工有限公司)；考馬斯亮藍染色液(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 實驗儀器

JC-DN-04C型凱氏定氮儀(青島聚創(chuàng)環(huán)保集團有限公司)；LDZX-75KBS型高壓滅菌鍋(浙江簡然儀器設備有限公司)；BZF-500型真空干燥箱(青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；DL-CJ-2N型超凈工作臺(河南信陵儀器設備有限公司)；FD-1型真空冷凍干燥機(上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司)；BSA224S-CW型電子天平(濟南歐威騰生物科技有限公司)；HY-5A型渦旋振蕩器(常州金壇良友儀器有限公司)；DK-8D型水浴鍋(常州金壇良友儀器有限公司)；PHS-3C型雷磁pH計(上海儀電科學股份有限公司)；SK7210HP型超聲波清洗儀(上海滬粵明科學儀器有限公司)；MULTISKANGO型全光譜酶標儀(濟南歐萊博科學儀器有限公司)；AI-F2130C型電泳槽(愛來寶生物技術有限公司)；ChampGel 5000型凝膠成像儀(森西賽智科技有限公司)；UV-2100型紫外可見分光光度計(濟南千司生物技術有限公司)；5804R型高速冷凍離心機(北京康高特儀器設備有限公司)；JY-JX5L型聚丙烯酰胺凝膠電泳儀(賽默飛世爾科技有限公司)；BS-2E型雙層恒溫搖床(常州金壇良友儀器有限公司)等。

1.3 實驗方法與數(shù)據(jù)處理

1.3.1 驢乳清蛋白含量測定

驢乳清粉中乳清蛋白的含量依據(jù)國標GB 5009.5-2016凱氏定氮法[12]測定。

1.3.2 驢乳清蛋白氨基酸序列分析

經(jīng)在UNIPROT、NCBI等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中檢索，可得驢乳清蛋白中含量較高的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、溶菌酶氨基酸序列如表1所示。

表1 氨基酸序列

將上述已知的蛋白質(zhì)序列作為模板，利用BIOPEP數(shù)據(jù)庫中內(nèi)置軟件對乳清蛋白進行模擬水解，選取的蛋白酶為數(shù)據(jù)庫中存在的胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶，比較內(nèi)置軟件計算的各蛋白酶水解度并整理出各蛋白酶酶解產(chǎn)生的生物活性肽，篩選出能夠產(chǎn)生抗氧化活性肽的蛋白水解酶。

1.3.3 蛋白酶活力的測定

依據(jù)國標GB/T 23527-2009福林-酚方法[13]測定。

分別配制0、10、20、30、40、50 μg/mL的酪氨酸標準溶液，預熱5 min后，各取1 mL酪氨酸標準溶液加入到混有1 mL福林酚試劑和5 mL的Na2CO3溶液(42.4 g/L)中，經(jīng)渦旋振蕩后，在40±0.2 ℃水浴鍋中靜置20 min，取出后用紫外分光光度計測定680 nm處的吸光值，并以酪氨酸濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

稱取少量蛋白酶，用相應緩沖液溶解并稀釋至一定濃度，酪蛋白溶液在40±0.2 ℃恒溫預熱5 min，空白管中加入1 mL酶液，40±0.2 ℃恒溫預熱2 min后，加入2 mL三氯乙酸，40±0.2 ℃恒溫預熱10 min后，加入1 mL酪蛋白溶液搖勻，取出靜置10 min，過濾，取1 mL濾液加入到混有1 mL福林酚試劑和5 mL的Na2CO3溶液(42.4 g/L)中，在40±0.2 ℃水浴鍋中顯色20 min，取出后用紫外分光光度計測定680 nm處的吸光值(試樣管需做三個平行試樣)，將測定的吸光值代入標準曲線中按下式計算出相應的蛋白酶活：

式中：X3為樣品的酶活力(U/g)；A1為由標準曲線得出的樣品最終稀釋液的活力(U/mL)；V1為溶解樣品所使用的容量瓶的體積(mL)；4代表反應試劑的總體積(mL)；n1為樣品的稀釋倍數(shù)；m4為樣品的質(zhì)量(g)；1/10為反應時間10 min，以1 min計，所得結(jié)果表示至整數(shù)。

1.3.4 DPPH自由基清除率的測定

稱取19.7 mg的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH自由基)溶于乙醇，于避光條件下定容至250 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為0.2 mmol/L的DPPH無水乙醇溶液。分別取相同體積的酶解肽與DPPH無水乙醇溶液相混合，震蕩均勻，室溫避光靜置30 min，然后設置高速冷凍離心機參數(shù)為4 ℃，4 200 rpm，離心混合溶液10 min，將酶標儀事先預熱15 min，取離心后的溶液上清液200 μL加入到96孔板中，用酶標儀檢測樣品在517 nm處的吸光值Ai，以等體積無水乙醇溶液替代DPPH無水乙醇溶液作為空白組，以等體積蒸餾水替代酶解肽樣品作為對照組，用下式計算DPPH自由基清除率[14]：

式中：A0為對照組(蒸餾水+DPPH無水乙醇溶液)的吸光值；Ai為樣品組(酶解肽+DPPH無水乙醇溶液)的吸光值；Aj為空白組(酶解肽+無水乙醇)的吸光值。

1.3.5 乳清蛋白酶解工藝流程

將驢乳源乳清蛋白配置成4%質(zhì)量濃度的溶液，85 ℃水浴加熱10 min，待溶液冷卻后調(diào)節(jié)溶液pH值至8，立即加入已配制好的α-胰凝乳蛋白酶溶液，經(jīng)玻璃棒攪拌后放入已達到設定溫度的水浴鍋內(nèi)靜置，每間隔30 min測定溶液pH值，并以1 mol/L的氫氧化鈉溶液維持pH值，水解至預定時間后，立即95 ℃水浴滅酶10 min，然后將溶液迅速冷卻至室溫，添加1 mol/L的鹽酸溶液或1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)pH至中性，高速冷凍離心機以4 200 rpm，4 ℃離心10 min，收集上清液并冷凍干燥制成酶解肽凍干粉。

1.3.6 乳清蛋白酶解工藝條件優(yōu)化

1.3.6.1 單因素實驗

取4%的蛋白液6 mL置于離心管中，經(jīng)85 ℃水浴加熱10 min后，取出冷卻，選擇溫度、pH、酶底比三個因素，以其中一項因素改變時，其他因素不變進行單因素實驗。各單因素變量分別是：溫度(35、40、45、50、55 ℃)、pH(7、7.5、8、8.5、9)、酶底比(2%、3%、4%、5%、6%)。

加入α-胰凝乳蛋白酶攪拌均勻，將離心管放入水浴鍋中，每隔30 min測定反應液pH值，以1 mol/L的氫氧化鈉溶液維持pH值在設定值±0.05之間，水解4 h后，立即95 ℃滅酶10 min，迅速冷卻至室溫，調(diào)節(jié)溶液pH至中性，4 200 rpm，4 ℃離心10 min，取上清液冷凍干燥得到酶解肽凍干粉，測定其DPPH自由基清除率。每組重復3次。

1.3.6.2 響應面實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，以pH、酶解溫度、酶底比為自變量，DPPH自由基清除率為響應值，設計響應面實驗(見表2)。利用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken實驗設計和數(shù)據(jù)處理。

表2 響應面實驗因素水平表

1.3.7 SDS-PAGE電泳分析

取一定量的乳清蛋白和酶解肽凍干粉，分別配制成7 mg/mL的溶液，以4∶1的比例加入5×蛋白上樣緩沖液中，沸水煮5～10 min后離心，收集上清液采用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，設置電壓200 V，電泳時間45 min，考馬斯亮藍染色液染色，脫色后將染好的膠片置于凝膠成像系統(tǒng)拍攝，分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 蛋白質(zhì)含量測定結(jié)果

利用凱氏定氮法測得本實驗使用的驢乳清蛋白含量為66.4%，且查詢數(shù)據(jù)庫可知驢乳清蛋白氨基酸序列中疏水性氨基酸較多，說明驢乳清蛋白適合用來制備抗氧化活性肽。

2.2 蛋白酶的篩選結(jié)果

為獲得高抗氧化活性的生物活性肽，利用UniProtdatabase(http://www.uniprot.org/)、NCBI等數(shù)據(jù)庫獲得原料蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)，查詢含量較高的蛋白氨基酸序列，并以其作為生物信息模板，由BIOPEP(http://www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)數(shù)據(jù)庫中內(nèi)置軟件進行模擬水解后，得到的各酶的水解度如表3所示。

表3 各蛋白酶水解度的比較

將BIOPEP數(shù)據(jù)庫水解得到的多肽整理分類，與數(shù)據(jù)庫中的抗氧化肽進行對比，計算機模擬水解預測具有抗氧化活性的肽段如表4所示，胃蛋白酶水解程度較低且預測結(jié)果為不具有抗氧化活性，木瓜蛋白酶水解度雖然高，但是預測其也不具有抗氧化活性，且木瓜蛋白酶雖然屬于內(nèi)切肽酶，但其對含巰基(—SH)肽鏈特異性較強，因此呈現(xiàn)出較差的酶解效果[15]，而胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的酶解多肽均具有抗氧化活性，且α-胰凝乳蛋白酶比胰蛋白酶得到的抗氧化活性酶解肽段多，因此綜合上述水解度的考量，本實驗篩選出可以產(chǎn)生抗氧化活性肽段的α-胰凝乳蛋白酶對驢乳清蛋白進行酶解。

2.3 蛋白酶活力的測定

由圖1可知，L-酪氨酸標準曲線為y=0.009 5x-0.008 2，R2=0.998 9。實測α-胰凝乳蛋白酶的吸光值為0.405 A，進一步代入公式計算出α-胰凝乳蛋白酶酶活為1 740 U/mg，與商品標簽(1 500 U/mg)上酶活數(shù)量級一致，結(jié)果可靠。

圖1 L-酪氨酸標準曲線Fig.1 L-Tyrosine standard curve

2.4 驢乳清蛋白酶解工藝的單因素結(jié)果分析

2.4.1 溫度對乳清蛋白酶解效果的影響

表4 驢乳清蛋白肽序列與功能預測

圖2為底物濃度4%，酶底比4%，時間4 h，pH 8時不同溫度對驢乳清蛋白酶解肽DPPH自由基清除率的影響。由圖可知，酶解肽的DPPH自由基清除率隨著溫度的升高呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，當40 ℃時達到最大值為46.19%。低于最適溫度時，DPPH自由基清除率隨溫度增加而增加，這可能是因為溫度的升高提高了酶的活力，從而促進了反應的進行[16]。當溫度繼續(xù)升高，高于最適溫度時，由于酶蛋白變性，進而使得DPPH自由基清除率逐漸下降，因此選取40 ℃作為最適酶解溫度。

圖2 溫度對驢乳清蛋白酶解肽DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of temperature on DPPH radical scavenging rate of donkey whey peptides hydrolyzed by protease

2.4.2 pH對乳清蛋白酶解效果的影響

pH是酶解反應的重要影響因素之一，通過改變pH可以影響蛋白酶活性中心的空間構(gòu)象和一些基團的解離程度，進而影響酶解的進行。當只有達到最適pH時，酶的催化效力才會達到最高[17]。由圖3可知，隨著pH的增大，驢乳清蛋白DPPH自由基清除率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當pH 8時DPPH自由基清除率達到最大值為45.33%。低于最適pH時，DPPH自由基清除率隨pH增加而增加，高于最適pH時，DPPH自由基清除率隨pH增加而下降，這是由于pH會影響酶和底物可解離基團的帶電情況，從而影響酶與底物的相互作用，因此選取PH 8作為最適酶解pH。

圖3 pH對驢乳清蛋白酶解肽DPPH自由基清除率的影響Fig.3 Effect of pH on DPPH radical scavenging rate of donkey whey peptides hydrolyzed by protease

2.4.3 酶底比對乳清蛋白酶解效果的影響

由圖4可知，驢乳清蛋白DPPH自由基清除率隨著酶底比的升高呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在4%時達到最大值為45.24%。低于最適酶底比時，DPPH自由基清除率隨酶底比增加而增加，高于最適酶底比時，DPPH自由基清除率隨酶底比增加而下降，這可能是因為隨著酶解反應的進行，肽鍵斷裂生成了越來越多的抗氧化肽段，當酶底比過高時，蛋白酶過度水解肽段，氨基酸含量增加，導致了活性的下降，因此選取4%作為最適酶底比。

圖4 酶底比對驢乳清蛋白酶解肽DPPH自由基清除率的影響Fig.4 Effect of enzyme substrate ratio on DPPH radical scavenging rate of donkey whey peptides hydrolyzed by protease

2.4.4 驢乳清蛋白酶解工藝的響應面結(jié)果分析

在單因素實驗結(jié)果基礎上，固定蛋白底物濃度為4%，酶解時間4 h，選用溫度、pH、酶底比作為自變量，以DPPH自由基清除率為指標，依據(jù)Box-Behnken設計原理設計了L9(34)響應面實驗，實驗設計及結(jié)果如表5所示。

表5 響應面實驗設計及結(jié)果

表6 響應面方差分析

續(xù)表6(Continued Tab.6)

圖5 各試驗因素交互作用對DPPH自由基清除率影響Fig.5 Effect of interaction of various experimental factors on DPPH radical scavenging rate

由表3得到回歸模型方程：Y=45.45-1.90A+5.73B-1.66C-0.3875AB+3.21AC-2.86BC-8.19A2-15.61B2-9.37C2

2.4.5 響應面實驗因素交互作用分析

實驗三因素對DPPH自由基清除率的交互作用如圖5所示，得到三因素間均具有一定的交互作用，DPPH自由基清除率隨著溫度、pH和酶底比的增加而先增加后減小，溫度和酶底比的交互作用及pH與酶底比的交互作用達到極顯著。

2.4.6 最佳酶解條件的確定及驗證

當固定底物濃度4%，酶解時間4 h時，分別研究酶解溫度，酶解pH及酶底比對驢乳清蛋白酶解肽抗氧化活性的影響。在單因素實驗的基礎上，利用響應面優(yōu)化酶解工藝條件，得到最佳工藝條件為溫度39.2 ℃，pH 8.1，酶底比4%，此時驢乳清蛋白酶解肽的DPPH自由基清除率可達46.28%。為方便實際應用，調(diào)整pH為8，溫度為39 ℃，進行驗證實驗，此時測量值為46.23%，與理論預測值相接近，說明通過響應面法得到的最佳酶解工藝條件可靠。

2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質(zhì)酶解程度

α-乳白蛋白是乳清蛋白中唯一能結(jié)合鈣離子的蛋白，且4個天冬氨酸殘基均能結(jié)合鈣離子，其獨特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)賦予α-乳白蛋白突出的功能特性和生物學活性,在其消化過程中，會生成各種生物活性肽，有抗氧化、抗菌等作用[18]；β-乳球蛋白屬于一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白，具有多個結(jié)合位點，包括β-乳球蛋白分子內(nèi)部的疏水內(nèi)腔和表面的疏水裂縫，因此對脂溶性維生素、脂肪酸及多酚類生物活性物質(zhì)都具有極高的親和性，能夠防止這些生物活性物質(zhì)的氧化降解，提高其在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)運效率，并促進這些物質(zhì)的吸收[19]。

驢乳清蛋白中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白含量均占較大組成部分，且分子量相似，α-乳白蛋白分子量大致為14.2 kDa[20]，β-乳球蛋白分子量大致為18.36 kDa[2]。由圖6可知，驢乳清蛋白在14.0、18.0 kDa分子量處均有較為清晰的條帶，說明驢乳清蛋白中的確富含α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，且經(jīng)4 h的α-胰凝乳蛋白酶酶解后，驢乳清蛋白已充分酶解完全。

圖6 驢乳清蛋白及酶解結(jié)果Fig.6 Donkey whey protein and enzymatic hydrolysis results

3 結(jié)論

利用UniProt database數(shù)據(jù)庫獲得原料蛋白質(zhì)中含量較高蛋白的氨基酸序列，并作為生物信息模板，采用BIOPEP數(shù)據(jù)庫中內(nèi)置軟件進行模擬酶解驢乳清蛋白手段，篩選出可以產(chǎn)生抗氧化活性肽段的α-胰凝乳蛋白酶，采用Design-Expert V8.0.6設計響應面試驗，確定驢乳清蛋白制備抗氧化肽的最佳工藝條件為：底物濃度4%，酶解時間4 h，溫度39 ℃，pH 8，酶底比4%。該條件下得到的酶解肽的DPPH自由基清除率最大值為46.23%。