張祖湘，王亞鳳，張 瑛，何瑞杰，韋用瓊，陽(yáng)丙媛，阮 俊，黃永林*

1廣西壯族自治區(qū)中國(guó)科學(xué)院廣西植物研究所 廣西植物功能物質(zhì)研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541006；2廣西久福生物科技有限公司，南寧 530012

蛞蝓屬腹足類腹足綱蛞蝓科動(dòng)物，為有肺的軟體動(dòng)物，因其體表布滿黏液，俗稱“黏蟲、鼻涕蟲、蜒蚰、土蝸、附蝸”。蛞蝓作為一種傳統(tǒng)中藥，味咸寒，入肺、肝、大腸經(jīng)，具有祛風(fēng)定驚、清熱解毒、破瘀通經(jīng)等功用，主治中風(fēng)口咼僻、筋脈拘攣、驚癇、喘息、喉痹、咽腫、癰腫、痰核、痔瘡腫痛等癥[1-3]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明蛞蝓提取物能夠抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，還可抑制肺癌細(xì)胞端粒酶基因hTERT和改變突變型P53的表達(dá)[4，5]。同時(shí)蛞蝓凍干粉能明顯延長(zhǎng)咳嗽潛伏期，減少咳嗽次數(shù)，具止咳化痰平喘作用，并能明顯的降低哮喘豚鼠肺組織嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)支氣管哮喘及慢性支氣管炎有較好的治療作用[6-9]。本課題前期通過(guò)DPPH自由基清除、細(xì)胞抗炎、酶活篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黑蛞蝓甲醇提取物脂溶性部位具有抗氧化、抗炎、降低血糖血脂等多種生物活性，以正己烷為溶劑，可使活性成分得到有效提取。文獻(xiàn)報(bào)道蛞蝓中含有多糖、氨基酸、甾醇類及其他成分[10-13]。植物甾醇類化合物與人體內(nèi)膽固醇的吸收、降解代謝、生化合成等密切相關(guān)，影響血糖血脂的變化[14]，但是目前對(duì)動(dòng)物甾醇類化合物生理活性報(bào)道較少，為了全面掌握黑蛞蝓(AgriolimaxagrestisLinnaeus)正己烷提取物的物質(zhì)基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)黑蛞蝓正己烷提取物進(jìn)行了系統(tǒng)的分離純化，并對(duì)化合物進(jìn)行了初步的α-糖苷酶抑制活性篩選。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Brucker Avance 500MHz超導(dǎo)核磁共振波譜儀(瑞典Bruker公司)；中低壓Semi-preparative HPLC(北京賽譜銳思公司)；CA-1111冷卻水循環(huán)(東京理化公司)；EYELA N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化公司)；自動(dòng)接收儀(日本Advantec公司)；柱層析硅膠(200～300目，青島海洋化工有限公司)；ODS-C18反相色譜柱(Agilent 公司)；Sephadex LH-20(美國(guó)GE公司)、Chromatorex C18(日本Fuji Silysia Chemical公司)；F254硅膠薄層板(德國(guó)Merck公司)，阿卡波糖(上海源葉)；PNPG(上海源葉)；α-糖苷酶(美國(guó)sigma公司);液相色譜所用試劑為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純凈水。

樣品2019年7月購(gòu)于南寧市五塘鎮(zhèn)，經(jīng)李岳執(zhí)業(yè)藥師鑒定為黑蛞蝓(AgriolimaxagrestisLinnaeus)，憑證樣品(201907)存放于廣西久福生物科技有限公司。

1.2 提取與分離

取黑蛞蝓(AgriolimaxagrestisLinnaeus)粉末3.0 kg，干燥后加入正己烷，超聲提取6次，每次30 min，過(guò)濾后合并濾液，濾液減壓除去正己烷后，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇反復(fù)萃取至無(wú)色?；厥杖軇┖蠓謩e得到石油醚浸膏290.0 g、乙酸乙酯浸膏8.6 g、正丁醇浸膏2.6 g。石油醚浸膏用二氯甲烷∶甲醇(1∶1)充分溶解后經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，二氯甲烷-甲醇(1∶1)體系等梯度洗脫，得到9個(gè)流份Fr1～Fr9。Fr4(122.0 g)采用硅膠柱層析分離，石油醚-二氯甲烷(9∶1→1∶9)體系梯度洗脫，分為Fr4-1～Fr4-9共9個(gè)流分。其中Fr4-4(5.0 g)經(jīng)Sephadex LH-20柱層析純化，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)等梯度洗脫，得到化合物14(753 mg)。Fr5(52.5 g)采用Sephadex LH-20柱層析純化，二氯甲烷∶甲醇(1∶1)等梯度洗脫，分為Fr5-1～Fr5-6共6個(gè)流分。Fr5-2(6.5 g)經(jīng)硅膠柱層析分離、Semi-preparative HPLC制備及重結(jié)晶，得到化合物13(44 mg)、8(26 mg)。Fr5-4(10.9 g)采用Chromatorex C18柱層析分離，甲醇-水(1∶9→10∶0)體系洗脫，分為Fr5-4-1～Fr5-4-8共8個(gè)流分。Fr5-4-5(2.7 g)經(jīng)Chromatorex C18柱層析、Semi-preparative HPLC制備純化分離，得到化合物10(4 mg)、6(8 mg)、7(10 mg)。Fr5-5(5.3 g)經(jīng)硅膠分離純化，石油醚-二氯甲烷(9∶1→1∶9)體系梯度洗脫，分為Fr5-5-1～Fr5-5-14共14個(gè)流分，其中Fr5-5-12用Sephadex LH-20柱層析分離，得到化合物15(4 mg)；Fr5-5-14(1.3 g)通過(guò)Sephadex LH-20、硅膠、Diaion HP20SS柱層析以及Semi-preparative HPLC制備純化分離，得到化合物11(10 mg)、12(18 mg)、4(16 mg)。乙酸乙酯浸膏用甲醇充分溶解后經(jīng)Chromatorex C18柱層析分離，甲醇-水(1∶9→10∶0)進(jìn)行梯度洗脫，得到Fr10-1～Fr10-5共5個(gè)流份。其中Fr10-1(318 mg)經(jīng)Chromatorex C18(甲醇-水)梯度洗脫并進(jìn)行重結(jié)晶，得到化合物3(20 mg)。正丁醇浸膏用甲醇充分溶解后經(jīng)Chromatorex C18(甲醇-水)分離，得到Fr11-1～Fr11-12共12個(gè)流分，其中Fr11-1-1經(jīng)Semi-preparative HPLC制備純化分離，得到純化合物1(2 mg)。Fr11-4(634 mg)、Fr11-6(876 mg)、Fr11-12(413 mg)重結(jié)晶后，分別得到化合物2(78 mg)、化合物9(512 mg)、化合物5(20 mg)。

1.3 α-糖苷酶抑制活性篩選

將50 μL PBS緩沖液(pH為6.8)加入96孔板中，然后分別加入不同濃度的待測(cè)樣品溶液20 μL和10 μL酶溶液(0.1 U/mL)，震蕩均勻，置于37 ℃恒溫箱中預(yù)熱5 min，然后加入10 μL PNPG(1 mM)，于37 ℃恒溫箱中反應(yīng)30 min，最后加入50 μL無(wú)水碳酸鈉(0.2 M)終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)405 nm處測(cè)定吸光值為反應(yīng)組A，等量緩沖液代替酶液做反應(yīng)對(duì)照組A0，等量緩沖液代替樣品做空白組C，等量緩沖液分別代替樣品溶液和酶液做空白對(duì)照組C0，其他步驟及試劑同上[15,16]。抑制率計(jì)算公式：抑制率=[1-(A-A0)/(C-C0)]×100%。重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)三次。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末;分子式為C8H10O。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：3.00(2H，dd，J=8.9，14.6 Hz，H-7)，3.78(2H，dd，J=4.3，8.9 Hz，H-8)，7.24～7.33(5H，m，H-2～H-6)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：137.3(C-1)，130.4(C-2)，129.9(C-3)，128.4(C-4)，129.9(C-5)，130.4(C-6)，38.3(C-7)，57.6(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為苯乙醇。

化合物2白色片狀固體;分子式為C16H32O2。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H-16)，1.25～1.36(24H，m，12×CH2)，1.64(2H，m，H-3)，2.34(2H，t，J=7.5 Hz，H-2);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：179.0(C-1)，34.0(C-2)，32.1(C-3)，29.9(C-4)，29.8(C-5)，29.8(C-6)，29.8(C-7)，29.8(C-8)，29.7(C-9)，29.6(C-10)，29.5(C-11)，29.4(C-12)，29.2(C-13)，24.9(C-14)，22.9(C-15)，14.3(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為十六烷酸。

化合物3淡黃色粉末;分子式為C18H34O2。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.87(3H，t，J=7.0 Hz，H-18)，1.24～1.29(22H，m，H-3～H-7，H-12～H-17)，1.62(2H，m，H-11)，2.01(2H，s，H-8)，2.33(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，5.34～5.37(2H，m，H-9，H-10);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：179.5(C-1)，34.1(C-2)，22.8(C-3)，29.6(C-4)，29.4(C-5)，29.5(C-6)，29.8(C-7)，29.8(C-8)，129.9(C-9)，130.2(C-10)，29.2(C-11)，29.8(C-12)，24.8(C-13)，29.8(C-14)，29.7(C-15)，29.8(C-16)，32.1(C-17)，14.2(C-18)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物3為(Z)-9-octadecenoic acid。

化合物4白色粉末;分子式為C21H40O4。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：0.90(3H，t，J=6.8 Hz，H-18′)，1.29～1.33(20H，m，H-4′～H-7′，H-12′～H-17′)，1.63(2H，m，H-3′)，2.03～2.06(2H，m，H-8′，H-11′)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，H-2′)，3.56(2H，m，H-3)，3.83(1H，m，H-2)，4.06(1H，dd，J=6.3，11.6 Hz，H-1b)，4.15(1H，dd，J=4.3，11.6 Hz，H-1a)，5.35～5.37(2H，m，H-9′，H-10′);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：66.5(C-1)，71.1(C-2)，64.1(C-3)，175.5(C-1′)，33.1(C-2′)，30.2(C-3′)，28.1(C-4′)，28.1(C-5′)，26.0(C-6′)，30.5(C-7′)，30.3(C-8′)，130.9(C-9′)，130.8(C-10′)，34.9(C-11′)，30.2(C-12′)，30.8(C-13′)，30.8(C-14′)，30.4(C-15′)，30.7(C-16′)，23.7(C-17′)，14.5(C-18′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[20]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為1-(2-hydroxyethoxy)ethyl(E)-octadec-9-enoate。

化合物5淡黃色固體;分子式為C27H56。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.85(6H，t，J=6.8，H-1，H-27)，1.22～1.25(4H，m，H-2，H-26);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：14.3(C-1)，22.8(C-2)，32.1(C-3)，29.6(C-4)，29.8-29.9(19C，C-5～23)，29.6(C-24)，32.1(C-25)，22.8(C-26)，14.3(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為二十七烷。

化合物6白色粉末;分子式為C28H54O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：0.88(6H，t，J=6.5 Hz，H-16，H-12′)，2.31(2H，t，J=7.3 Hz，H-2)，3.65(2H，s，H-1′)，5.33～5.35(2H，m，H-9，H-10);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：175.9(C-1)，34.9(C-2)，26.0(C-3)，28.2(C-4)，34.1(C-5)，33.0(C-6)，33.1(C-7)，34.9(C-8)，130.7(C-9)，130.9(C-10)，34.9(C-11)，33.1(C-12)，30.8(C-13)，34.8(C-14)，23.7(C-15)，15.4(C-16)，51.9(C-1′)，28.1(C-2′)，26.1(C-3′)，30.5(C-4′)，30.9(C-5′)，30.9(C-6′)，30.9(C-7′)，30.9(C-8′)，30.5(C-9′)，34.8(C-10′)，23.7(C-11′)，14.2(C-12′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為dodecyl (Z)-9-hexadecenoate。

化合物7白色粉末;分子式為C50H96O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：0.90(12H，t，J=6.7 Hz，4×CH3)，1.60(2H，m，H-3)，2.02～2.06(8H，m，H-18，H-21，H-30，H-33)，2.28(2H，m，H-2)，5.35(4H，t，J=4.6 Hz，H-19，H-20，H-31，H-32);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：178.2(C-1)，34.9(C-2)，26.1(C-3)，28.1(C-4)，30.1(C-5)，30.2(C-6)，30.2(C-7)，30.2(C-8)，30.2(C-9)，30.2(C-10)，30.2(C-11)，30.2(C-12)，30.2(C-13)，30.2(C-14)，30.3(C-15)，30.3(C-16)，30.7(C-17)，28.1(C-18)，130.8(C-19)，130.9(C-20)，28.1(C-21)，30.7(C-22)，30.4(C-23)，30.4(C-24)，30.2(C-25)，30.2(C-26)，30.6(C-27)，30.6(C-28)，30.8(C-29)，28.1(C-30)，130.8(C-31)，130.9(C-32)，28.1(C-33)，30.8(C-34)，30.6(C-35)，30.6(C-36)，30.3(C-37)，30.3(C-38)，30.3(C-39)，30.3(C-40)，30.3(C-41)，30.3(C-42)，30.3(C-43)，30.3(C-44)，30.3(C-45)，30.3(C-46)，30.1(C-47)，33.0(C-48)，23.7(C-49)，14.4(C-50)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23,24]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物7為cis,cis-diunsaturatedα-meromycolic acid。

化合物8白色粉末;分子式為C57H104O6。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.86(9H，t，J=7.0 Hz，3×(H-18′))，1.25(66H，s，3×11(CH2))，1.61(6H，br s，3×(H-11′))，2.01(6H，br s，3×(H-8′))，2.34(6H，t，J=7.5 Hz，3×(H-2′))，4.13～4.16(4H，m，H-1，3)，5.26(1H，m，H-2)，5.33～5.36(6H，m，3×(H-9′，10′));13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：65.2(C-1)，68.5(C-2)，65.2(C-3)，174.0(C-1′)，34.2(C-2′)，29.4(C-3′)，29.2(C-4′)，29.5(C-5′)，29.2(C-6′)，29.8(C-7′)，27.4(C-8′)，129.8(C-9′)，130.2(C-10′)，25.0(C-11′)，29.8(C-12′)，29.8(C-13′)，29.8(C-14′)，29.9(C-15′)，22.8(C-16′)，32.1(C-17′)，14.2(C-18′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物8為1,2,3-propanetriyl(9Z,9′Z,9″Z)tris(-9-octadecenoate)。

化合物9白色粉末;分子式為C27H46O。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.67(3H，s，H-18)，0.85(3H，d，J=2.2 Hz，H-26)，0.86(3H，d，J=2.2 Hz，H-27)，0.91(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，1.00(3H，s，H-19)，3.57(1H，m，H-3)，5.34(1H，m，H-6);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.1(C-1)，29.6(C-2)，71.7(C-3)，42.2(C-4)，140.7(C-5)，121.6(C-6)，31.5(C-7)，31.8(C-8)，50.0(C-9)，36.4(C-10)，20.9(C-11)，39.7(C-12)，42.2(C-13)，56.7(C-14)，24.2(C-15)，28.1(C-16)，56.0(C-17)，11.7(C-18)，19.3(C-19)，35.7(C-20)，18.6(C-21)，36.1(C-22)，23.7(C-23)，39.4(C-24)，27.9(C-25)，22.4(C-26)，22.7(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物9為膽固醇。

化合物10白色粉末;分子式為C27H44O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：0.73(3H，s，H-18)，0.88(3H，d，J= 2.0 Hz，H-26)，0.89(3H，d，J= 2.0 Hz，H-27)，0.95(3H，d，J= 6.5 Hz，H-21)，1.24(3H，s，H-19)，3.55(1H，m，H-3)，5.66(1H，br s，H-6);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：39.6(C-1)，31.9(C-2)，71.2(C-3)，44.3(C-4)，169.1(C-5)，126.3(C-6)，204.7(C-7)，42.7(C-8)，51.4(C-9)，37.5(C-10)，22.3(C-11)，40.1(C-12)，46.6(C-13)，51.5(C-14)，24.9(C-15)，29.6(C-16)，56.2(C-17)，12.4(C-18)，17.7(C-19)，37.0(C-20)，19.4(C-21)，37.4(C-22)，27.4(C-23)，40.6(C-24)，29.1(C-25)，23.2(C-26)，22.9(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物10為7-酮基膽固醇。

化合物11白色粉末;分子式為C27H46O2。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.69(3H，s，H-18)，0.85(3H，d，J= 2.2 Hz，H-26)，0.86(3H，d，J= 2.2 Hz，H-27)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，1.00(3H，s，H-19)，3.58(1H，m，H-3)，3.85(1H，br s，H-7)，5.60(1H，dd，J=1.8，5.3 Hz， H-6);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.1(C-1)，31.7(C-2)，71.6(C-3)，41.9(C-4)，143.6(C-5)，125.6(C-6)，73.5(C-7)，41.1(C-8)，48.4(C-9)，36.6(C-10)，21.2(C-11)，39.7(C-12)，43.1(C-13)，55.6(C-14)，23.9(C-15)，28.7(C-16)，56.1(C-17)，11.9(C-18)，18.9(C-19)，35.9(C-20)，19.3(C-21)，36.4(C-22)，26.5(C-23)，39.7(C-24)，28.1(C-25)，22.9(C-26)，22.7(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28,29]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物11為膽甾-5-烯-3β,7α二醇。

化合物12白色粉末;分子式為C27H46O2。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.69(3H，s，H-18)，0.85(3H，d，J= 2.2 Hz，H-26)，0.86(3H，d，J= 2.2 Hz，H-27)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，1.05(3H，s，H-19)，3.57(1H，m，H-3)，3.85(1H，m，H-7)，5.29(1H，br s，H-6);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.1(C-1)，31.5(C-2)，71.4(C-3)，42.1(C-4)，146.4(C-5)，124.0(C-6)，65.5(C-7)，37.6(C-8)，42.3(C-9)，37.5(C-10)，20.9(C-11)，39.3(C-12)，42.4(C-13)，49.6(C-14)，23.8(C-15)，28.4(C-16)，56.0(C-17)，11.7(C-18)，18.3(C-19)，35.9(C-20)，18.8(C-21)，36.3(C-22)，24.4(C-23)，39.6(C-24)，28.1(C-25)，22.9(C-26)，22.7(C-27)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28,29]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物12為膽甾-5-烯-3β,7β二醇。

化合物13白色粉末;分子式為C41H72O2。1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：0.67(3H，s，H-18)，0.87(3H，d，J=2.0 Hz，H-26)，0.88(3H，d，J=2.0 Hz，H-27)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，1.01(3H，s，H-19)，4.10(1H，m，H-3)，5.33(1H，m，H-6);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：37.2(C-1)，27.9(C-2)，73.8(C-3)，38.3(C-4)，139.8(C-5)，122.7(C-6)，32.1(C-7)，32.1(C-8)，50.2(C-9)，36.3(C-10)，21.2(C-11)，39.9(C-12)，42.4(C-13)，56.8(C-14)，24.4(C-15)，28.4(C-16)，56.3(C-17)，12.0(C-18)，19.4(C-19)，34.8(C-20)，18.8(C-21)，35.9(C-22)，23.9(C-23)，39.6(C-24)，28.1(C-25)，22.6(C-26)，22.8(C-27)，173.4(C-1′)，34.5(C-2′)，25.2(C-3′)，29.3(C-4′)，29.4(C-5′)，29.6(C-6′)，29.7(C-7′)，29.7(C-8′)，29.8(C-9′)，29.5(C-10′)，32.0(C-11′)，22.9(C-12′)，14.2(C-13′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[30]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物13為膽甾醇肉豆蔻酸酯。

化合物14白色針狀結(jié)晶;分子式為C44H78O2。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：0.67 (3H，s，H-18)，0.86(3H，d，J=2.2 Hz，H-27)，0.87(3H，d，J=2.2 Hz，H-26)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，1.02(3H，s，H-19)，2.28(2H，m，H-4)，4.62(1H，m，H-3)，5.36(1H，m，H-6);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：37.2(C-1)，27.9(C-2)，73.8(C-3)，38.3(C-4)，139.9(C-5)，122.7(C-6)，32.0(C-7)，32.1(C-8)，50.2(C-9)，36.4(C-10)，21.2(C-11)，39.9(C-12)，42.5(C-13)，56.8(C-14)，24.4(C-15)，28.2(C-16)，56.3(C-17)，12.0(C-18)，19.5(C-19)，35.9(C-20)，18.9(C-21)，36.8(C-22)，22.7(C-23)，39.7(C-24)，28.4(C-25)，22.8(C-26)，23.9(C-27)，173.4(C-1′)，34.9(C-2′)，25.2(C-3′)，29.3(C-4′)，29.4(C-5′)，29.5(C-6′)，29.6(C-7′)，29.7(C-8′)，29.8(C-9′)，29.8(C-10′)，29.8(C-11′)，29.8(C-12′)，29.8(C-13′)，29.5(C-14′)，32.1(C-15′)，24.0(C-16′)，14.3(C-17′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[31]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物14為膽甾醇基十七酸酯。

化合物15白色針狀結(jié)晶;分子式為C30H48O3。1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：0.67 (3H，s，H-24)，0.74(3H，s，H-25)，0.80(3H，d，J= 6.5 Hz，H-29)，0.86(3H，d，J=4.5 Hz，H-30)，0.91(3H，s，H-26)，1.04(3H，s，H-27)，2.99(1H，m，H-3)，5.12(1H，t，J=3.2 Hz，H-12);13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：36.5(C-1)，26.9(C-2)，76.9(C-3)，38.3(C-4)，54.8(C-5)，18.0(C-6)，32.7(C-7)，40.0(C-8)，47.0(C-9)，38.5(C-10)，23.3(C-11)，124.6(C-12)，138.2(C-13)，41.7(C-14)，28.2(C-15)，23.8(C-16)，46.9(C-17)，52.4(C-18)，38.4(C-19)，38.4(C-20)，30.2(C-21)，36.3(C-22)，27.6(C-23)，15.2(C-24)，16.1(C-25)，17.0(C-26)，22.9(C-27)，178.3(C-8)，16.9(C-29)，21.1(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[32]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物15為熊果酸。

2.2 α-糖苷酶抑制活性篩選結(jié)果

以上述標(biāo)準(zhǔn)方法平行測(cè)定三次取平均值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽(yáng)性藥阿卡波糖的IC50為0.003 7 mg/mL，化合物6的IC50為1.19 mg/mL，化合物10的IC50為1.34 mg/mL，對(duì)α-糖苷酶的抑制活性較弱，其他化合物無(wú)法計(jì)算其IC50值，對(duì)α-糖苷酶基本無(wú)抑制作用。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 不同化合物抑制α-糖苷酶活性的IC50值

3 結(jié)論

黑蛞蝓正己烷提取物中共分離得到15個(gè)化合物，主要為長(zhǎng)鏈脂肪酸和甾醇類化合物，其中有6個(gè)甾醇類化合物，甾醇類化合物9和14為主要成分。除化合物9之外，其余化合物均為首次從該動(dòng)物藥中首次分離得到。植物甾醇類化合物具有多種生物活性，能夠抑制人體對(duì)膽固醇的吸收、促進(jìn)膽固醇的降解代謝、抑制膽固醇的生化合成等作用，但是目前對(duì)動(dòng)物甾醇類化合物生理活性報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)初步篩選了純度較高的7個(gè)化合物的α-糖苷酶抑制活性，結(jié)果顯示化合物6和10對(duì)α-糖苷酶的抑制活性均較弱，其他化合物對(duì)α-糖苷酶基本無(wú)抑制作用。前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示該活性部位具有α-糖苷酶的抑制活性，活性成分可能為檢測(cè)到的多種萜類化合物。