溫蓓桐，張福娟，張艷書，段臘梅，王妍惠，呂長鑫*

1. 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心（錦州 121013）；2. 朝陽師范高等?？茖W(xué)校（朝陽 122000）

酸漿（Physalis）又名燈盞草、燈籠草、紅菇娘，是一種栽培歷史久遠的藥食同源類草本植物，目前在我國東北地區(qū)種植較廣泛[1]。酸漿果實呈球形橙紅色，成熟酸漿果實味道酸甜可口，營養(yǎng)豐富，其果肉及汁中富含多種礦物質(zhì)、維生素、纖維和胡蘿卜素，具有清熱解毒、利咽、化痰、利尿等功效[2]。目前市場上酸漿產(chǎn)品主要有果酒、果汁和果干等[3]，隨著其可食部分的加工利用，大量酸漿籽會被廢棄。張舵[4]研究發(fā)現(xiàn)酸漿籽中富含人體必需脂肪酸、植物甾醇和多糖等生物活性成分和油酸、亞油酸等不飽和脂肪酸，具有降低血清膽固醇、調(diào)節(jié)脂肪酸代謝及促進生長發(fā)育等功效。植物油脂提取方法較多，但多數(shù)操作復(fù)雜且可能存在有機溶劑殘留。水酶法是利用酶制劑來破壞種子細胞壁，使油脂從植物細胞中釋放出來[5]，此法具有無溶劑殘留、綠色安全、工藝簡單等特點[6-7]。試驗以酸漿籽為原料，探究提取酸漿籽油最佳工藝條件，同時對酸漿籽油清除·OH、DPPH·自由基能力進行測定，探究其抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿籽，宿遷能綠優(yōu)商貿(mào)有限公司；木聚糖酶（3萬 U/g）、果膠酶（3萬 U/g）、堿性蛋白酶（20萬 U/g），河南萬邦實業(yè)有限公司；1，1-二苯基-2苦基肼自由基，上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GT-100震動球磨儀（北京格瑞德曼有限公司）；Centrifuge5804R冷凍離心機（德國艾本德股份公司）；UV-2700紫外可見分光光度計（日本島津儀器公司）；SHA-2冷凍水浴恒溫振蕩器（金壇市瑞華儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 操作要點

去除酸漿籽中雜質(zhì)，干燥恒溫后粉碎過篩，取一定量酸漿籽粉于錐形瓶中，加入蒸餾水預(yù)熱，調(diào)節(jié)pH后加入木聚糖酶、果膠酶酶解在80 ℃水浴滅酶5 min冷卻至室溫；再調(diào)節(jié)pH，加入堿性蛋白酶酶解，水浴滅酶冷卻至室溫；在4 ℃、8 000 r/min條件下離心20 min，去除餅粕及水解液，加入乙醇振蕩破乳，離心分離得到清油。

1.3.3 酸漿籽油提取率測定

酸漿籽油提取率按式（1）計算。

式中：W為酸漿籽油提取率，%；m1為錐形瓶和瓶內(nèi)酸漿籽油質(zhì)量，g；m2為錐形瓶質(zhì)量，g；m為酸漿籽總脂肪質(zhì)量，g。

1.3.4 酶種類及添加比例確定

取30 g酸漿籽粉末于錐形瓶中，分別加入果膠酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纖維素酶與堿性蛋白酶，在最適酶解條件下，選擇酸漿籽油提取率高的酶制劑進行復(fù)配，按照3∶2∶1，3∶1∶2，2∶3∶1，2∶1∶3，1∶3∶2，1∶2∶3和1∶1∶1比例加酶確定最佳酶添加比。

1.3.5 水酶法提取酸漿籽油單因素試驗

針對酸漿籽粉，分別進行料液比（1∶3，1∶4，1∶5，1∶6和1∶7 g/mL）、酶總添加量（1.0%，1.5%，2.0%，2.5%和3.0%）、木聚糖酶和果膠酶酶解pH（3.0，3.5，4.0，4.5和5.0）、木聚糖酶和果膠酶酶解時間（1，2，3，4和5 h）、堿性蛋白酶酶解時間（0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 h）5組單因素試驗，根據(jù)酸漿籽油提取率，確定各因素最佳水平。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

根據(jù)單因素試驗，選取各因素參數(shù)范圍內(nèi)酸漿籽油提取率變化范圍較大的三個因素進行響應(yīng)面優(yōu)化。因此，選取料液比、木聚糖酶和果膠酶酶解pH以及堿性蛋白酶酶解時間為因素，以酸漿籽油提取率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設(shè)計試驗，方案見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

1.3.7 驗證試驗

按Box-Behnken試驗所得的最佳工藝做三組平行試驗，驗證工藝可靠性。

1.3.8 酸漿籽油體外抗氧化研究

1.3.8.1 清除·OH能力測定

向試管中依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL樣品溶液和1 mL 8.8 mmol/L的H2O2溶液，搖勻，靜置10 min，再加入1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，搖勻，于37 ℃反應(yīng)30 min，在510 nm處測其吸光度A1，去離子水代替H2O2測其吸光度A2，丙酮代替樣品溶液測其吸光度A0，以VC為對照?！H清除率按式（2）計算。

1.3.8.2 清除DPPH·能力測定

向試管中加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液和2 mL樣品溶液，混勻，避光靜置30 min，在517 nm處測吸光度A1，無水乙醇代替DPPH溶液測其吸光度A2，無水乙醇代替樣品溶液測其吸光度A0，以VC為對照。DPPH·清除率按式（3）計算。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Word 2010軟件進行整理繪圖，SPSS 19.0軟件進行顯著性分析，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類及其添加比例結(jié)果分析

由圖1可知，加入酶制劑后，酸漿籽油提取率明顯提高（p＜0.05），木聚糖酶對酸漿籽油提取率達14.18%，果膠酶和堿性蛋白酶次之。由于機械作用破壞酸漿籽細胞結(jié)構(gòu)，游離脂肪從中釋放出來[8]，添加復(fù)合酶后，木聚糖酶和果膠酶分解細胞壁多糖，細胞壁結(jié)構(gòu)被破壞；堿性蛋白酶破壞了脂蛋白和脂小體蛋白膜結(jié)構(gòu)，釋放出油脂，提高酸漿籽油提取率[9]，因此選取木聚糖酶、果膠酶和堿性蛋白酶復(fù)合進行研究。圖2表明，木聚糖酶、果膠酶和堿性蛋白酶添加比例為2∶1∶3時，油提取率最高達21.62%，因木聚糖酶、果膠酶協(xié)同作用于細胞壁[10]，細胞壁被破壞使蛋白酶與脂蛋白復(fù)合體得到充分接觸，酶解效果增強[11]。因此，確定木聚糖酶、果膠酶、堿性蛋白酶最佳添加比例為2∶1∶3。

圖1 酶種類對酸漿籽油提取率影響

圖2 酶添加比例對酸漿籽油提取率影響

2.2 單因素試驗結(jié)果分析

2.2.1 料液比對酸漿籽油提取率影響分析

圖3表明：在料液比1∶3～1∶6（g/mL）時，提取率逐漸升高，料液比1∶6（g/mL）時，提取率達到峰值；料液比1∶6～1∶7（g/mL）時，提取率逐漸降低。這是因為溶劑量過低，酶解液黏稠度較高，不利于油脂分子遷移；溶劑量過高，減少酶與底物的碰撞概率，降低反應(yīng)效率[12]。由此，1∶6（g/mL）為最佳料液比。

圖3 料液比對酸漿籽油提取率影響

2.2.2 復(fù)合酶添加量對酸漿籽油提取率影響分析

圖4表明：當(dāng)加酶量在1.0%～2.0%時，隨酶量增加，木聚糖酶、果膠酶和堿性蛋白酶與細胞壁多糖、脂蛋白、脂多糖充分作用[13]，酸漿籽油提取率隨之提高；當(dāng)加酶量達2.0%時，提取率達到最大值16.39%；加酶量超過2.0%時，可能是由于酶量過大，酶和底物的接觸位點不能充分暴露出來，導(dǎo)致酶促反應(yīng)效率下降[14]。綜上確定2.0%為最佳復(fù)合酶添加量。

圖4 復(fù)合酶添加量對酸漿籽油提取率影響

2.2.3 木聚糖酶和果膠酶酶解時間對酸漿籽油提取率影響分析

如圖5所示：木聚糖酶和果膠酶酶解1～2 h時，酶與底物發(fā)生反應(yīng)，酸漿籽油提取率明顯提高（p＜ 0.05）；酶解時間2 h時，酸漿籽油提取率達到峰值18.18%；2～5 h時，酶解速率隨酶解時間增加而顯著下降（p＜0.05），可能是因為底物隨酶解時間延長而不斷減少，其次酶解產(chǎn)物反過來與酶結(jié)合，也會對酶解反應(yīng)起到一定抑制作用[15]。故2 h為木聚糖酶和果膠酶酶解最佳時間。

圖5 木聚糖酶和果膠酶酶解時間對酸漿籽油提取率影響

2.2.4 木聚糖酶和果膠酶酶解pH對酸漿籽油提取率影響分析

由圖6可知：當(dāng)pH 4.0時，提取率達到最高20.75%；當(dāng)pH在3.0～4.0之間時，酸漿籽油提取率隨著pH增大而提高；pH 4.0后隨著pH增大提取率顯著降低（p＜ 0.05）。可能是因木聚糖酶最適pH 4.2，果膠酶最適pH 3.5，當(dāng)pH超過4.0后，會明顯抑制果膠酶活性。因此，確定木聚糖酶和果膠酶在pH 4.0時酶解效果最好。

圖6 木聚糖酶和果膠酶酶解pH對酸漿籽油提取率影響

2.2.5 堿性蛋白酶酶解時間對酸漿籽油提取率影響分析

由圖7可知：0.5～2.0 h內(nèi)，隨著堿性蛋白酶酶解時間延長，酸漿籽油提取率逐漸增大；當(dāng)酶解2.0 h時，堿性蛋白酶與酸漿籽粉充分反應(yīng)，提取率達20.01%。由于底物和總酶量有限，繼續(xù)延長酶解時間，酸漿籽油提取率不再增大。因此2.0 h為堿性蛋白酶酶解時間。

圖7 堿性蛋白酶酶解時間對酸漿籽油提取率影響

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果分析

2.3.1 模型建立及顯著性分析

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取率變化范圍較大的料液比（A）、木聚糖酶和果膠酶酶解pH（B）以及堿性蛋白酶酶解時間（C）作為考察因素，通過Box- Behnken得17組試驗，利用響應(yīng)面對表2數(shù)據(jù)分析，響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ突貧w系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表3 模型回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果

對試驗數(shù)據(jù)回歸分析，得到以提取率為響應(yīng)值的二次回歸方程：提取率=22.85-1.95A+3.24B+0.22C+ 0.85AB-0.09AC-2.24BC-4.40A2-6.44B2-2.94C2。該試驗?zāi)Ｐ蚿＜0.000 1，失擬項p=0.921 7＞0.05，模型極顯著，失擬項不顯著，說明在條件范圍內(nèi)各因素間有較強的交互作用。此次試驗R2=0.997 4，Radj2=0.994 1，C.V.=2.53%，RSN=53.134，說明二次回歸方程擬合度較好，置信度較高，能較好地反映各因素對酸漿籽油提取率影響。各因素對提取率影響大小依次為B＞A＞C。因素A、B、A2、B2、C2和交互項BC對提取率影響極顯著，交互項AB對得率影響顯著。

2.3.2 響應(yīng)面各因素之間交互作用分析

各因素交互作用對酸漿籽提取率影響如圖8所示，等高線圖反映了提取率隨各因素的變化情況。圖8（a1）和（c1）等高線圖較扁，圖8（b1）等高線略圓，故交互項對酸漿籽油提取率影響大小依次為BC＞AB＞AC；BC交互作用極顯著，AB交互作用顯著，與模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果一致。

圖8 各因素交互作用等高線圖

2.3.3 驗證試驗結(jié)果分析

通過響應(yīng)面優(yōu)化得出酸漿籽油最優(yōu)提取條件：料液比1∶5.80（g/mL）、木聚糖酶和果膠酶酶解pH 4.13、堿性蛋白酶酶解時間2.07 h，酸漿籽油提取率為23.49%。為驗證優(yōu)化結(jié)果的可靠性，進行3組平行驗證試驗，測得酸漿籽油提取率平均值為23.17%，與理論值相差1.36%，說明該模型與實際擬合效果較好，適用于酸漿籽油提取。

2.4 酸漿籽油體外抗氧化活性研究與分析

2.4.1 酸漿籽油對·OH清除能力測定分析

由圖9和圖10可知：在0.5～10.0 mg/mL范圍內(nèi)，酸漿籽油對·OH清除率隨酸漿籽油濃度增加而逐漸上升，當(dāng)酸漿籽油質(zhì)量濃度為10.0 mg/mL時，其對·OH清除率達到95.81%，與1.0 mg/mL的VC對·OH清除率相當(dāng)，可知酸漿籽油對·OH的清除效果較好。

圖9 酸漿籽油對·OH清除能力

圖10 VC對·OH清除能力

2.4.2 酸漿籽油對DPPH·清除能力測定分析

由圖11和圖12可知：在0.5～10.0 mg/mL范圍內(nèi)，酸漿籽油對DPPH·清除率隨酸漿籽油濃度增加逐漸上升，當(dāng)酸漿籽油濃度為10.0 mg/mL時，清除率為94.56%，與0.05 mg/mL的VC對DPPH·清除效果相當(dāng)，說明酸漿籽油對DPPH·有明顯的清除效果。

圖11 酸漿籽油對DPPH·清除能力

圖12 VC對DPPH·清除能力

3 結(jié)論

通過水酶法提取酸漿籽油，確定提取酸漿籽油最優(yōu)工藝條件：料液比1∶5.8（g/mL）、木聚糖酶和果膠酶酶解pH 4.13、堿性蛋白酶酶解時間2.07 h，此時酸漿籽油提取率為23.49%，驗證試驗與預(yù)測值基本相符。對酸漿籽油進行抗氧化研究，·OH清除率為95.81%，DPPH·清除率為94.56%，與0.05 mg/mL的VC清除能力相當(dāng)，說明酸漿籽油具備較好的抗氧化效果。此次試驗研究的酸漿籽油提取工藝可為其后續(xù)探究提供一定基礎(chǔ)，其詳細抗氧化研究還需進一步探索。