張存存，張娟，譚志超*，柳嘉，王永霞

1. 張北寶得康食品有限公司（張家口 076450）；2. 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司（北京 100015）；3. 河北工程大學(xué)（邯鄲 056038）

中國沙棘（Hippophae rhamnoidessubsp.sinensisRousi），是胡頹子科沙棘屬植物沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）的一個亞種，沙棘葉含有豐富的黃酮類成分[1-2]。研究表明，沙棘黃酮有很高的保健價值和藥用價值，具有抗心肌缺血[3]、抗氧化[4-6]、抗衰老[7]、抗疲勞[8]、抗腫瘤[9]、抗菌[10]、降血脂[11]、降血糖[12]等作用。

沙棘總黃酮常用的提取方法有溶劑浸提[13]、酶提取[14]、超聲輔助提取[15]和微波輔助提取[16]等。研究[17]表明，沙棘葉黃酮提取物對高溫比較敏感，溶劑浸提不僅溫度高且耗時[13]，酶提取和超聲輔助提取法也比較耗時[14-15]，至少需要數(shù)十分鐘，而微波輔助法提取[16]有微波泄露從而危害人體健康的風(fēng)險[18-19]。閃式提取技術(shù)是利用高速剪切頭形成高強度的剪切力，植物細(xì)胞被迅速破壁，并利用強力攪拌，使溶劑快速滲透，有效成分迅速擴散，具有提取時間短、溫度低、無輻射風(fēng)險的優(yōu)點[20-21]。閃式提取技術(shù)在無花果[22]、山楂果核[23]、馬鞭草[24]等總黃酮提取方面已有研究，但還未見對提取沙棘總黃酮的研究。

試驗用閃式法從沙棘葉中提取總黃酮，并優(yōu)化閃式提取工藝，以期為中國沙棘工業(yè)化加工提供指導(dǎo)、為沙棘總黃酮研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

沙棘葉（落地葉，品種為中國沙棘亞種，張北寶德康食品有限公司）。

食用酒精（95%，梅河口市阜康酒精有限責(zé)任公司）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95%，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；楊梅素、槲皮素、異鼠李素、山奈酚標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98%，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院）；氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇、甲醇、磷酸、鹽酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑北京有限公司）；去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

JHBE-50T閃式提取器（河南智晶生物科技股份有限公司）；UV-1800紫外-可見分光光度計[島津儀器（蘇州）有限公司]；DZF-6090真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KC-500高速粉碎機（北京開創(chuàng)同和科技發(fā)展有限公司）；TDL-5-A離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；ESJ120-4電子天平（沈陽龍騰電子秤量儀器有限公司）；KQ3200ES超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；1220 LC高效液相色譜（安捷倫科技有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 原料預(yù)處理

沙棘葉于60 ℃真空烘箱中真空干燥，用高速粉碎機粉碎，過0.850 mm（20目）篩，留篩下物備用。

1.3.2 提取工藝流程

配制乙醇水溶液，量取3 L，并稱取適量預(yù)處理過的沙棘葉粉末，混合均勻，將閃式提取器的剪切頭完全浸沒，開啟閃式提取器，旋轉(zhuǎn)提取電壓調(diào)節(jié)旋鈕，待提取電壓達(dá)到需求值時，開始計時；計時結(jié)束，先旋轉(zhuǎn)提取電壓調(diào)節(jié)旋鈕，提取電壓完全降為零時，關(guān)閉提取器，提取結(jié)束，料液按4 000 r/min離心30 min，得到粗提液備用。

1.3.3 沙棘葉閃式提取工藝單因素試驗

預(yù)處理過的沙棘葉粉末按照以下工藝參數(shù)閃式提取，得到粗提液，測定粗提液中總黃酮含量，考察各因素對沙棘總黃酮得率的影響。

1.3.3.1 提取電壓的影響

液料比（V乙醇∶m沙棘葉）10∶1 mL/g，加入60%乙醇-水溶液，提取電壓分別設(shè)置為100，120，140，160，180和200 V，提取時間120 s。

1.3.3.2 提取時間的影響

液料比（V乙醇∶m沙棘葉）10∶1 mL/g，加入60%乙醇-水溶液，電壓200 V，提取時間分別設(shè)置為30，60，90，120，150，180和210 s。

1.3.3.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的影響

液料比（V乙醇∶m沙棘葉）10∶1 mL/g，分別加入乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%，40%，50%，60%，70%和80%乙醇-水溶液，提取電壓200 V，提取時間120 s。

1.3.3.4 液料比的影響

液料比（V乙醇∶m沙棘葉）分別設(shè)置為8∶1，10∶1，12∶1，14∶1，16∶1，18∶1和20∶1 mL/g，加入60%乙醇-水溶液，提取電壓200 V，提取時間120 s。

1.3.4 正交試驗優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取提取電壓、提取時間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比4個因素及其對應(yīng)的3個較優(yōu)水平，以總黃酮提取得率為考察指標(biāo)設(shè)計L9(34)正交試驗表，每組試驗做3次計算沙棘總黃酮平均得率。

1.3.5 與傳統(tǒng)提取工藝的比較

根據(jù)康瑩[12]優(yōu)選傳統(tǒng)的乙醇浸提法提取沙棘葉總黃酮，乙醇體積分?jǐn)?shù)59%，液料比（V乙醇∶m沙棘葉）18∶1 mL/g，提取溫度79 ℃，提取時間125 min，料液按4 000 r/min離心30 min，得到粗提液備用。按照1.3.6的方法測定粗提液中總黃酮含量，并計算提取得率，按照1.3.7的方法測定粗提液中總黃酮組分，并與試驗優(yōu)化的閃式提取工藝作比較，從總黃酮提取得率和粗提物組分兩方面進行比較。

1.3.6 總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色的方法。

1.3.6.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制按照文獻(xiàn)[25]的方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.6.2 總黃酮含量的測定

精密量取2～5 mL粗提液，用30%乙醇稀釋至25 mL，作為供試品溶液。按照文獻(xiàn)[25]測定總黃酮含量，總黃酮以蘆丁計。

1.3.6.3 總黃酮提取得率計算

式中：y為總黃酮提取得率，mg/g；c為待測液中總黃酮質(zhì)量濃度，μg/mL；N為稀釋倍數(shù)；V為粗提液體積，mL；m為提取原料質(zhì)量（以預(yù)處理完的干基計），g。計算結(jié)果保留2位有效數(shù)字。

1.3.7 粗提物組分鑒定HPLC法[25]

1.3.7.1 色譜條件

Agilent TC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相：流動相為甲醇-0.4%磷酸（V甲醇∶V0.4%磷酸=55∶45）；流速1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長370 nm；進樣量20 μL。

1.3.7.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液

精密稱取10 mg楊梅素、槲皮素、山奈酚、異鼠李素對照品分別置于25 mL量瓶中，用60%甲醇超聲溶解，定容至25 mL，得到4種黃酮對照品母液。各吸取0.5 mL置于樣品瓶中，混勻，取續(xù)濾液進樣，得到黃酮混合對照品HPLC色譜圖。

1.3.7.3 粗提液黃酮類組分鑒定

取25 mL粗提液續(xù)濾液，加3.5 mL濃鹽酸，于75 ℃水解1 h；冷卻，用60%乙醇定容至50 mL；過濾，取續(xù)濾液進樣，得到粗提液HPLC色譜圖。

1.3.8 數(shù)據(jù)分析

每組試驗重復(fù)3次，取平均值，用SPSS AU 20.0進行方差分析和LSD法多重比較，p＜0.05具有顯著差異，p＜0.01具有極顯著差異，利用Microsoft Office Excel 2007進行制圖。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取電壓對提取得率的影響

由圖2可看出，隨著提取電壓增大，總黃酮提取得率隨之增大，提取電壓大于160 V，提取得率增加不再顯著，增勢趨緩。這是因為提取電壓越大，設(shè)備的刀頭旋轉(zhuǎn)越快，剪切和攪拌作用越強，所以沙棘葉組織內(nèi)的成分向外滲透越快，組織內(nèi)外的物質(zhì)濃度越快達(dá)到一致。從提取效果、能耗等方面綜合考慮，選取提取電壓160 V左右為宜。

圖2 提取電壓對沙棘葉總黃酮提取得率的影響

2.1.2 提取時間對提取得率的影響

由圖3可看出，總黃酮提取得率隨著閃式提取時間延長而增大，提取時間超過150 s時，提取得率增加不顯著。這是因為沙棘葉細(xì)胞中的成分滲透到溶劑中需要時間，提取時間越長，滲透擴散越充分，但是植物組織內(nèi)外物質(zhì)濃度趨于一致時，滲透速度減緩，溶劑中總黃酮濃度趨于平衡。綜合考慮提取效果和能耗，最佳提取時間選擇150 s。

圖3 提取時間對沙棘葉總黃酮提取得率的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取得率的影響

由圖4可看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取得率影響較大，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%左右時，提取得率最大，體積分?jǐn)?shù)再增加，提取得率反而下降。這可能由于不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇-水溶液極性不同，若乙醇比例太小，溶液極性太大，更有利于多糖、蛋白質(zhì)等水溶性的物質(zhì)溶出，不利于黃酮類成分的溶出，而乙醇比例太大，溶液的極性太小，醇不溶性的物質(zhì)形成封閉的微小空間，阻礙黃酮類成分的溶出。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對沙棘葉總黃酮提取得率的影響

2.1.4 液料比（V乙醇∶m沙棘葉）對提取得率的影響

由圖5可看出，隨著液料比增大，沙棘總黃酮提取得率增加，但是，液料比達(dá)到16∶1 mL/g后，沙棘總黃酮提取得率增加緩慢，提取得率沒有顯著差異。這是由于提取的過程是植物組織內(nèi)外的物質(zhì)濃度趨于一致的平衡過程，液料比越大，平衡時溶劑中的總黃酮含量相對越多，但是液料比達(dá)到一定比例后，含量提高越來越不明顯，從提高提取效果、節(jié)約溶劑方面綜合考慮，溶劑用量不宜過大。故適宜液料比為16∶1 mL/g。

圖5 液料比對沙棘葉總黃酮提取得率的影響

2.2 正交試驗優(yōu)化閃式提取工藝

根據(jù)1.3.4用正交試驗優(yōu)化工藝參數(shù)，正交試驗設(shè)計見表1。

表1 正交試驗設(shè)計

由表2中的正交試驗數(shù)據(jù)極差分析可知，各因素影響的順序為A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C2＞C3＞C1，D3＞D2＞D1。由表2極差分析和表3多因素方差分析可看出：提取時間對總黃酮提取得率影響最小，乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取電壓和液料比（V乙醇∶m沙棘葉）對提取得率有顯著性影響；閃式提取沙棘葉總黃酮最佳條件為A3B3C2D3，即提取電壓180 V、提取時間180 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比（V乙醇∶m沙棘葉）18∶1 mL/g。由于延長提取時間對總黃酮的得率提高影響不大，綜合考慮節(jié)能降耗，選取120 s較好，并且驗證試驗證明，在正交的最優(yōu)條件A3B3C2D3，總黃酮得率為20.46±0.28 mg/g，而在A3B1C2D3條件下總黃酮得率為20.32±0.20 mg/g，差距可以忽略不計。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析

2.3 與傳統(tǒng)浸提工藝的比較

2.3.1 提取得率的比較

根據(jù)2.2的試驗結(jié)果，選取A3B1C2D3工藝參數(shù)進行閃式提取，按照1.3.5的方法進行傳統(tǒng)浸提。由表4試驗數(shù)據(jù)可知，在同樣提取一次的情況下，傳統(tǒng)浸提比閃式提取的沙棘葉總黃酮得率要高，但是在同樣提取兩次的情況下，差距會減小，趨于基本一致。閃式與傳統(tǒng)提取法比較，閃式提取有較大的優(yōu)勢，主要表現(xiàn)為保證提取得率的情況下提取時間短，不用加熱，常溫提取即可。

表4 2種提取方法的提取得率

2.3.2 粗提物組分的比較

沙棘黃酮包含的種類繁多，異鼠李素、山奈酚、楊梅素和槲皮素只是其中含量較多的黃酮種類的苷元，HPLC法定性分析閃式提取和傳統(tǒng)浸提粗提液的主要黃酮成分。

在1.3.7色譜條件下，黃酮混合對照品及粗提液經(jīng)酸水解處理的樣品可以得到分離度較好的HPLC譜圖（見圖6）。圖6（A）為黃酮混合對照品色譜圖，按照出峰時間從前到后依次是楊梅素、槲皮素、山奈酚和異鼠李素。比較圖6B（閃式提取粗提液）和圖6C（傳統(tǒng)浸提粗提液）發(fā)現(xiàn)，峰型和出峰時間未發(fā)現(xiàn)明顯改變，說明閃式提取法所得物質(zhì)與傳統(tǒng)浸提法無較大差異，主要黃酮苷元組分一致，均含有楊梅素、槲皮素、山奈酚和異鼠李素。

圖6 HPLC色譜圖

3 結(jié)論

通過單因素試驗和正交試驗，并綜合考慮時間、能耗等成本因素，優(yōu)化閃式提取沙棘葉總黃酮的工藝條件：提取電壓180 V、提取時間120 s、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、液料比（V乙醇∶m沙棘葉）18∶1 mL/g。在此條件下，提取得率為20.32±0.34 mg/g，經(jīng)HPLC法鑒定，粗提物中含有楊梅素、槲皮素、山奈酚和異鼠李素，與傳統(tǒng)浸提法相比，總黃酮提取得率和粗提物組分基本一致，但是閃式提取法操作簡單，提取時間短，不用加熱，常溫提取即可，可降低提取成本，有利于沙棘葉總黃酮的穩(wěn)定。閃式提取過程中高度剪切造成物料細(xì)化，增加過濾分離的難度，試驗可用離心以分離料液，生產(chǎn)操作中，可用粗濾加臥式離心初步分離料液。

試驗原料為中國沙棘亞種的葉子，若擴大研究范圍，對其他品種的沙棘葉也進行類似研究，則能驗證此次工藝的普適性。用HPLC法對沙棘葉粗提液進行組分鑒定，由于未配合進行質(zhì)譜分析，所以所得結(jié)論有待進一步考究。