曲笑鋒,石菊,李鐵錫,于艷輝,劉松枝,唐曉桐,徐建,鄢必新*
(1.吉林修正藥業(yè)新藥開發(fā)有限公司,長春130103;2.吉林天力泰藥業(yè)有限公司,長白朝鮮族自治縣134400)
復方萬年青膠囊處方包含虎眼萬年青、半枝蓮、虎杖、郁金、白花蛇舌草、人參、丹參、黃芪、全蝎、蜈蚣。功能主治為解毒化瘀,扶正固本。用于肺癌、肝癌、胃癌化療合并用藥,且具有減毒增效的作用。本研究基于胃癌荷瘤小鼠模型,通過體外檢測免疫調節(jié)相關指標及NF-kb p65/p38水平,探究其作用機制,為臨床應用提供理論依據(jù)。
BALB/c小鼠,雌雄各半,18~22g,購自長春市億斯實驗動物技術有限責任公司,合格證號:SCXK(吉)2020-0002。
復方萬年青膠囊:由吉林天力泰藥業(yè)有限公司提供,批號:20190701;氟尿嘧啶注射液(5-FU):江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司,批號:190604;10×電轉液:Solarbio,批號:D1060-500;5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液,Solarbio,批號:T1070-500;5×loading buffer:Biosharp,批號:660272;1×PBST緩沖液:Solarbio,批號:T1070-500,P1031-500;高靈敏度ECL化學發(fā)光試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20191121;Page Ruler Prest:thermofisher,批號:00318120;βactin:BOSTER,批號:BA2305;P38 MAPK:CST,批號:8690;NF-kb/p65,CST,批號:8242;山羊抗兔二抗:BOSTER,批號:BA1054;山羊抗鼠二抗:BOSTER,批號:BA1050;PBS:HyClone,批號:AE29449011;RPMI1640培養(yǎng)基:HyClone,批號:AE29163435;Gey′s紅細胞裂解液:源葉生物,批號:L14M11G113128;LDH試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20201228;IgG試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20201228;IgM試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20201228;TNF-α試劑盒:南京建成生物工程研究所,批號:20201229。
SMP500-18272-LSIO酶標儀;JA1103N型電子天平;HHS水浴鍋;低溫高速離心機;Trans-blot SD cell半干轉膜儀;Gel imaging system;MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱。
BALB/c小鼠84只,隨機分為7組,每組12只,雌雄各半,分別為空白對照組、模型對照組、5-FU對照組、復方萬年青膠囊1倍臨床劑量對照組、復方萬年青膠囊3倍臨床劑量對照組、復方萬年青膠囊1倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組(0.5g·kg-1+70mg·kg-1)、復方萬年青膠囊3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組(1.5g·kg-1+70mg·kg-1),連續(xù)給藥14d。
小鼠腹腔接種胃癌瘤液后,待腹部出現(xiàn)明顯的腹水處死,仰臥固定,消毒皮膚,用眼科剪小心剝離表皮,露出外膜,抽取腹腔腫瘤積液,以0.9%氯化鈉注射液稀釋,調整細胞濃度至2.0×106個/mL,放在冰浴中備用。
除空白組以外,于無菌條件下抽取接種于小鼠7d的生長良好的腹水,按6×106mL,每只0.2mL接種于小鼠腹腔內進行建模[1-5]。24h后,空白組、模型組小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10mL·kg-1,每天1次,5-FU對照組1次/14d,復方萬年青膠囊聯(lián)合5-FU低劑量組、復方萬年青膠囊聯(lián)合5-FU高劑量組,腹腔注射5-FU,同時分別灌胃給藥,每天1次。以上各組連續(xù)給藥14d。
取荷瘤胃癌小鼠瘤體組織約50mg,加入800μL細胞裂解液,利用組織研磨器充分研磨組織,放入4℃垂直旋轉1h,12000rpm,離心20min,取上清,測量蛋白含量,-80℃保存待用。根據(jù)蛋白濃度,取50μg蛋白,與5×蛋白上樣緩沖液混勻,在98℃加熱器上加熱5min,瞬離10s。10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白,80V,20min,待樣品進入分離膠后,調整100~120V,80min。取出凝膠轉膜,20V,50min。轉膜后用含有5%脫脂奶粉的PBST封閉至少1h后,棄掉封閉液,孵育一抗(3% BSA的PBST按1∶1000比例稀釋),4℃,過夜?;厥找豢?,PBST洗三次,10min/次。孵育二抗(5%脫脂奶粉按1∶1000稀釋)室溫,搖床,孵育45min。棄二抗,PBST洗三次,10min/次。將顯色液A和B按照1∶1的比例混勻,均勻滴加于膜上,化學發(fā)光儀檢測NF-kb p65、p38蛋白的表達情況。
采集小鼠外周血,放置于-80℃保存,用于隨后的檢測。通過酶聯(lián)免疫試劑盒檢測免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、腫瘤壞死因子α(TNF-α),相關操作嚴格按照試劑盒說明書進行。
2.6.1 脾細胞懸液的制備
小鼠脫頸椎處死,剪開肌層無菌取脾,置于預冷PBS的培養(yǎng)皿中,剝離剩余脂肪和胰腺。剪碎脾臟通過70μm細胞過濾器以收集單細胞懸浮液。將細胞懸浮液1500轉,5min離心后用Gey′s溶液裂解紅細胞,靜止3min后再次離心。反復裂解離心直至無紅色沉淀,用PBS重懸即收獲脾細胞懸液。
2.6.2 NK細胞活性測定
對K562細胞以及脾細胞進行活細胞計數(shù)。將100μL K562細胞作為靶細胞(2.5×106個/mL)加入到96孔培養(yǎng)板的每個孔中。將100μL脾淋巴細胞用作效應細胞(1×107個/mL)添加至每個測試孔。同時設最大釋放孔及空白對照孔。即:
測 試 孔:K562 100μL+脾細胞100μL
空白對照孔:K562 100μL+RPMI1640 100μL
最大釋放孔:K562 100μL+LDH釋放劑(稀釋后)100μL
細胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4h后使用LDH測定試劑盒測量LDH水平。基于公式計算NK細胞的細胞毒率:
ODtest表示試驗孔的吸光度,ODmin表示空白對照孔的吸光度,ODmax表示最大釋放孔的吸光度。
實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 19.0軟件,結果用均值±標準差表示,P<0.05具有統(tǒng)計學差異;Western Blot法檢測蛋白表達情況后,利用Image J、Graphpad Prism軟件分析蛋白表達量。
3.1.1 對荷瘤小鼠血清酶學指標的影響
結果表明,與空白對照組比較,模型對照組荷瘤小鼠血清中IgM、IgG、TNF-α活性有不同程度升高(P<0.05,P<0.001);與模型對照組比較,復方萬年青膠囊3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgM、IgG、TNF-α活性不同程度降低(P<0.05,P<0.001),復方萬年青膠囊1倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgM、IgG明顯降低(P<0.01);與5-FU對照組比較,復方萬年青膠囊3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgG活性明顯降低(P<0.01),復方萬年青膠囊1倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgG活性極明顯降低(P<0.001),詳見表1。
3.1.2 對荷瘤小鼠NK細胞殺傷率的影響
各實驗組小鼠NK細胞殺傷率分別為81.5%、41.1%、159.6%、96.2%、86.3%、120.6%和194.2%,詳見表2。
結果表明,與模型對照組比較,5-FU對照組與復方萬年青膠囊1倍、3倍臨床劑量+5-FU聯(lián)合組均能夠下調NF-kb p65/p38水平;復方萬年青膠囊1倍、3倍臨床劑量組可使NF-kb p65/p38水平升高,詳見圖1。
胃癌是全球十大惡性腫瘤之一,其發(fā)病隱匿,進展迅速,多數(shù)患者確診時已為進展期,臨床研究顯示,在接受手術的患者中,有50%左右患者在1年內復發(fā),2年內復發(fā)轉移則占70%率以上[12]。大量基礎研究表明,腫瘤周圍免疫抑制的炎癥微環(huán)境是腫瘤形成的重要因素,可推動胃癌的惡性進程和治療失敗。而中醫(yī)藥在調節(jié)機體免疫方面有傳統(tǒng)優(yōu)勢,多項研究已證實,中藥有減輕腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)、治療腫瘤的作用[13]。復方萬年青膠囊以清熱解毒藥虎眼萬年青、半枝蓮、虎杖、白花蛇舌草為君,以補氣升陽藥人參、丹參、黃芪為臣,以郁金、全蝎、蜈蚣為佐使進行配伍,具有解毒鎮(zhèn)痛、散結消腫的功效,清熱解毒的同時,補氣升陽、活血止痛,調節(jié)機體免疫功能。
NK細胞可以通過自然殺傷和介導抗體依賴性的細胞介導的細胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity,ADCC)直接殺傷靶細胞[14],它不依賴抗體和補體而直接實現(xiàn)免疫功能,NK細胞的活性更是衡量機體免疫的重要指標。本研究采用BALB/c小鼠的腋下移植瘤模型,研究復方萬年青膠囊的免疫調節(jié)作用[15,16],實驗結果表明,復方萬年青膠囊聯(lián)合氟尿嘧啶注射液能明顯增加小鼠NK細胞殺傷率,且復方萬年青膠囊與氟尿嘧啶注射液聯(lián)合組荷瘤小鼠血清中IgG、IgM含量明顯降低并趨于正常水平,同時炎性因子TNF-α活性明顯降低,提示復方萬年青膠囊對氟尿嘧啶注射液的癌癥治療具有增效作用,具有明顯的免疫調節(jié)功能。
腫瘤細胞在細胞生理學方面有6個標志性改變:生長自給自足、逃避凋亡、對生長抑制信號的不敏感、無限增殖性、血管生成、組織侵襲性和轉移性[17,18]。很多介導這些效應的基因轉錄受NF-kb調控;MAPK通路是近年來發(fā)現(xiàn)的與腫瘤細胞凋亡有關的信號轉導通路,包括JNK、ERK、p38等關鍵調控因子。其中,p38受細胞因子、藥物、輻射等刺激而產生相應作用,參與腫瘤細胞的發(fā)生和進展。有研究顯示p38表達異常與腫瘤患者生存期顯著相關,活化的p38可以抑制Bcl-2活化和誘導Bax轉位,并通過誘導線粒體凋亡途徑促進腫瘤細胞凋亡[19-22]。本研究結果顯示,復方萬年青膠囊單獨給藥NF-kb p65/p38水平升高,聯(lián)合用藥后可有效降低NF-kb p65/p38 MAPK比值,而p38活性的增強可抑制Bcl-2活化,達到促進細胞凋亡發(fā)生的目的。綜上所述,復方萬年青膠囊聯(lián)合5-FU可能通過降低NF-kb p65/p38水平,抑制Bcl-2活化,從而抑制腫瘤細胞增殖,促進腫瘤細胞凋亡的發(fā)生。