于紅紅 陳茜 李芳 羅瑞熙 王臘 趙立鳳 俞琦 許滔 田維毅

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴陽(yáng) 550025）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性炎癥性疾病，也是導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生的重要因素，AS形成及發(fā)展與炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、脂代謝功能紊亂等多種因素密切相關(guān)［1］。巨噬細(xì)胞通過(guò)吸收氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）并沉積于動(dòng)脈壁導(dǎo)致泡沫化巨噬細(xì)胞聚集，形成AS斑塊［2］。已有大量研究證明，中醫(yī)藥治療AS療效確切，近年關(guān)于清熱解毒法治療AS的研究也日益增多。四妙勇安湯為古代治療熱毒熾盛之脫疽的著名方劑，出自《驗(yàn)方新編》，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草四味藥組成?，F(xiàn)代研究證實(shí)其具有抗炎、降脂、穩(wěn)定斑塊、抗血栓形成等藥理作用，臨床多用于治療血栓閉塞性脈管炎、AS、高血壓、冠心病等疾病，但其抗AS的分子機(jī)制尚不明確［3-5］。本研究以ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫化巨噬細(xì)胞為AS體外模型，探究四妙勇安湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞活化及自噬的作用，為AS“熱毒蘊(yùn)結(jié)”學(xué)說(shuō)提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±10）g，購(gòu)自長(zhǎng)沙天勤公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011；小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞購(gòu)自上海中橋新舟公司。

1.1.2 藥物與主要試劑四妙勇安湯按原方比例配伍（金銀花90 g、玄參90 g、當(dāng)歸60 g、甘草30 g），購(gòu)自北京同仁堂貴陽(yáng)店，常規(guī)制備水煎液；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone）；細(xì)胞消化液（eBioscience）；青鏈霉素雙抗（南京維森特）；ox-LDL（廣州奕源生物YB-002）；CCK-8試劑盒（日本同仁LF673）；油紅O細(xì)胞染色、BCA測(cè)定試劑盒（G1262、C0020，北京索萊寶）；IL-6、IL-10、IFN-γ ELISA試劑盒（EK206/3、EK210/4、EK280/3，聯(lián)科）；LC3B、p-mTOR、p-p70S6K抗體（CST3868、5536、9234）、GAPDH抗體（Affinity T0004）、p-AMPK抗體（8813R，北京博奧森）；雷帕霉素（V900930，Sigma）。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清制備40只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、四妙勇安湯低、中、高劑量組，每組10只，按“動(dòng)物與人體等效劑量換算系數(shù)”計(jì)算大鼠給藥劑量，低、中、高劑量分別為15.75、31.5、63 g/（kg·d）［6］。正常對(duì)照組灌胃給予等量生理鹽水，2次/d，連續(xù)1周。股動(dòng)脈取血，離心，收集上清，滅活補(bǔ)體，過(guò)濾除菌后分裝保存。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和干預(yù)RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、10 μl/ml青鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基（37℃、5%CO2）。實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞分為正常對(duì)照組、低、中、高劑量含藥血清組、模型組、雷帕霉素組。除正常對(duì)照組外，其余組均加入終濃度為66 μg/ml的ox-LDL共培養(yǎng)24 d建立泡沫細(xì)胞模型。正常對(duì)照組及模型組采用20%正常對(duì)照組血清干預(yù)24 h；低、中、高劑量組分別給予20%濃度的低、中、高劑量含藥血清干預(yù)24 h；雷帕霉素組采用mTOR抑制劑雷帕霉素（1 μmol/L）干預(yù)24 h。

1.2.3 油紅O染色觀察細(xì)胞脂滴棄上清，PBS洗3次，油紅O固定液固定25 min，油紅O染色液浸染15 min，蘇木素染色液復(fù)染核1~2 min，水洗后鏡下觀察。

1.2.4 CCK-8檢測(cè)泡沫細(xì)胞活性用含10%胎牛血清、青鏈霉素雙抗10 μl/ml的DMEM高糖培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/ml，100 μl/孔接種于無(wú)菌96孔板，干預(yù)細(xì)胞后棄培養(yǎng)基，將正常對(duì)照組、含藥血清高劑量組分別按10%、20%、30%、40%和50%濃度加入孔中，全部加樣均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，孵育24 h后按說(shuō)明書操作加入試劑，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度。

1.2.5 ELISA檢測(cè)IL-6、IL-10和IFN-γ表達(dá)取正常對(duì)照組、模型組、不同劑量含藥血清組培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基上清，按ELISA試劑盒說(shuō)明書采用酶標(biāo)儀檢測(cè)IL-6、IL-10和IFN-γ表達(dá)。

1.2.6 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬水平變化按1.2.2干預(yù)細(xì)胞，電鏡固定液4℃固定4 h，PBS洗3次，鋨酸固定液固定2 h，脫水，包埋，切片，染色，透射顯微鏡采集圖像。

1.2.7 免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)LC3Ⅱ表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×104個(gè)/ml，1 ml/孔接種于含有無(wú)菌蓋玻片的24孔板，按1.2.2方法干預(yù)細(xì)胞。4%多聚甲醛固定，PBS洗3次，甩干，加入破膜液孵育，洗滌，封閉，棄培養(yǎng)液，加入一抗孵育過(guò)夜，洗滌，加入二抗孵育，洗滌，加入DAPI染液避光室溫孵育，洗滌，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.2.8 RT-PCR檢測(cè)AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)收集各組細(xì)胞，Trizol法抽提總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR儀擴(kuò)增。AMPK正向引物序列：5'-AACCTGAGAACGTCCTGCTTGATG-3'，反 向：5'-TGACTTCTGGTGCGGCATAATTGG-3'；mTOR正 向引物：5'-CTGATCCTCAACGAGCTAGTTC-3'，反向：5'-GGTCTTTGCAGTACTTGTCATG-3'；p70S6K正 向引物：5'-CTGATTTATGCCTTTCAGACCG-3'，反向：5'-CCTTTTTGATGTAAATGCCCCA-3'；內(nèi)參GAPDH正向引物：5'-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3'，反向：5'-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3'。PCR擴(kuò)增條件為：95℃30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃5 s，55℃10 s，38個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)。

1.2.9 Western blot檢 測(cè)p-AMPK、p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達(dá)收集細(xì)胞，高效細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，調(diào)整各組蛋白濃度，沸水浴煮10~15 min使蛋白變性，SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉，依次孵育一抗、二抗，洗膜，加入顯影劑，ChemiDocXRS化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色、曝光，Image Lab軟件分析條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，其余采用單因素方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 油紅O染色鑒定泡沫細(xì)胞正常對(duì)照組巨噬細(xì)胞未見(jiàn)明顯橘紅色脂滴；ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫化巨噬細(xì)胞明顯可見(jiàn)胞內(nèi)橘紅色脂滴增多，說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)存在大量脂質(zhì)，證實(shí)泡沫化巨噬細(xì)胞模型建立成功（圖1）。

圖1 油紅O染色觀察RAW264.7細(xì)胞及泡沫細(xì)胞（×200）Fig.1 Oil red O staining of RAW264.7 cells and foam cells（×200）

2.2 四妙勇安湯含藥血清對(duì)泡沫化巨噬細(xì)胞活性的影響CCK-8結(jié)果顯示（表1），與正常對(duì)照組相比，含藥血清高劑量組在10%~30%濃度范圍內(nèi)細(xì)胞活力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），隨濃度增加，細(xì)胞活力呈逐漸下降趨勢(shì)（P<0.05）。后續(xù)將采用不影響細(xì)胞活力劑量范圍內(nèi)的20%濃度含藥血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 四妙勇安湯含藥血清對(duì)泡沫化巨噬細(xì)胞活性的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Si-Miao-Yong-An-Decotion containing serum on foam macrophage activity（±s，n=6）

表1 四妙勇安湯含藥血清對(duì)泡沫化巨噬細(xì)胞活性的影響（±s，n=6）Tab.1 Effect of Si-Miao-Yong-An-Decotion containing serum on foam macrophage activity（±s，n=6）

Note：Compared with Control，1）P<0.05.

Groups Control High dose Percentage of concentration 10%1.134±0.056 1.027±0.104 20%1.154±0.067 1.045±0.078 30%1.148±0.102 1.021±0.084 40%1.118±0.076 0.841±0.0751）50%1.041±0.064 0.751±0.0591）

2.3 四妙勇安湯含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞IL-6、IL-10和IFN-γ的影響與正常對(duì)照組相比，ox-LDL刺激巨噬細(xì)胞24 h后，IL-6、IFN-γ水平顯著升高，IL-10水平顯著降低（P<0.05）；與模型組相比，含藥血清各劑量組作用于泡沫化巨噬細(xì)胞24 h后，IL-10分泌增加，IL-6、IFN-γ分泌明顯減少（P<0.05，表2）。

表2 各組細(xì)胞上清IL-6、IL-10和IFN-γ含量比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.2 Comparison of contents of IL-6，IL-10 and IFN-γ in cell supernatant of each group（±s，n=6，pg/ml）

表2 各組細(xì)胞上清IL-6、IL-10和IFN-γ含量比較（±s，n=6，pg/ml）Tab.2 Comparison of contents of IL-6，IL-10 and IFN-γ in cell supernatant of each group（±s，n=6，pg/ml）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups Control Model Low dose Middle dose High dose IL-6 2 346.37±109.58 3 053.46±86.171）2 643.61±71.432）2 216.49±80.572）2 104.73±101.462）IL-10 140.75±10.26 105.43±11.051）123.97±17.042）151.63±15.062）149.47±14.122）IFN-γ 1 568.36±81.24 2 476.84±102.531）2 017.56±96.542）1 426.82±75.362）1 354.74±63.492）

2.4 透射電鏡觀察細(xì)胞自噬水平變化電鏡結(jié)果顯示，正常對(duì)照組與模型組未見(jiàn)自噬小體；而四妙勇安湯含藥血清各劑量組與雷帕霉素組均可見(jiàn)雙層膜包裹的內(nèi)含細(xì)胞器的自噬小體，同時(shí)部分泡沫細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)受損，嵴消失（圖2）。

圖2 透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)（×1 500）Fig.2 Transmission electron microscope detection of cell ultrastructure（×1 500）

2.5 細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記檢測(cè)自噬蛋白LC3Ⅱ細(xì)胞自噬誘導(dǎo)過(guò)程中自噬體形成的特點(diǎn)為L(zhǎng)C3Ⅱ轉(zhuǎn)化率提高，熒光染色下可見(jiàn)斑點(diǎn)狀聚集于自噬體內(nèi)膜附近。熒光二抗Cy3-山羊抗兔熒光素標(biāo)記LC3發(fā)出的紅光為陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色為DAPI染色的細(xì)胞核。熒光結(jié)果顯示，正常對(duì)照組和模型組細(xì)胞幾乎不可見(jiàn)LC3Ⅱ點(diǎn)狀聚集；經(jīng)含藥血清各劑量組及雷帕霉素組處理的細(xì)胞LC3Ⅱ呈陽(yáng)性紅光點(diǎn)分布，雷帕霉素組陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)量最為顯著（圖3）。

圖3 熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞LC3Ⅱ表達(dá)（×200）Fig.3 Fluorescence microscope detection LC3Ⅱexpres?sion（×200）

2.6 四妙勇安湯含藥血清對(duì)AMPK、mTOR、p70S6K mRNA的影響與正常對(duì)照組相比，模型組AMPK mRNA表達(dá)降低，mTOR和p70S6K mRNA表達(dá)提升（P<0.05）。與模型組相比，含藥血清組及雷帕霉素組干預(yù)后AMPK mRNA表達(dá)顯著升高，而mTOR和p70S6K mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05，表3）。

表3 各組細(xì)胞AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)（±s，n=3）Tab.3 AMPK，mTOR，p70S6K mRNA expressions in each group of cells（±s，n=3）

表3 各組細(xì)胞AMPK、mTOR、p70S6K mRNA表達(dá)（±s，n=3）Tab.3 AMPK，mTOR，p70S6K mRNA expressions in each group of cells（±s，n=3）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups AMPK mTOR p70S6K Control Model Low dose Middle dose High dose Rapamycin 1.00±0.00 0.74±0.091）1.19±0.082）1.24±0.102）1.28±0.072）1.34±0.122）1.00±0.00 1.16±0.071）0.74±0.102）0.78±0.072）0.65±0.082）0.60±0.092）1.00±0.00 1.25±0.111）0.84±0.072）0.69±0.062）0.71±0.082）0.64±0.072）

2.7 四妙勇安湯含藥血清對(duì)p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組p-AMPK蛋白表達(dá)降低，p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。與模型組相比，含藥血清組及雷帕霉素組干預(yù)后p-AMPK蛋白表達(dá)顯著升高，而p-mTOR和p-p70S6K蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05，圖4、表4）。

圖4 各組p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達(dá)Fig.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres?sions in each group

表4 各組細(xì)胞p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres?sions in each group of cells（±s，n=3）

表4 各組細(xì)胞p-AMPK、p-mTOR、p-p70S6K蛋白表達(dá)（±s，n=3）Tab.4 p-AMPK，p-mTOR and p-p70S6K protein expres?sions in each group of cells（±s，n=3）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Groups Control Model Low dose Middle dose High dose Rapamycin p-AMPK 1.00±0.00 0.76±0.051）1.52±0.162）1.62±0.182）1.86±0.152）1.91±0.202）p-mTOR 1.00±0.00 1.13±0.051）0.92±0.102）0.86±0.082）0.84±0.072）0.77±0.042）p-p70S6K 1.00±0.00 1.12±0.151）0.91±0.052）0.90±0.082）0.76±0.042）0.61±0.072）

3 討論

AS是多種心腦血管疾病形成的基礎(chǔ)病理因素，其發(fā)病機(jī)制涉及內(nèi)皮細(xì)胞損傷、脂代謝失常、平滑肌細(xì)胞增殖和分化、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)等多個(gè)環(huán)節(jié)［7-8］。自噬對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)起關(guān)鍵作用，是一種細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的溶酶體依賴性的降解過(guò)程，參與機(jī)體多種慢性炎癥性疾病、心腦血管系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病過(guò)程［9］。自噬在AS發(fā)生發(fā)展乃至斑塊破裂等不同階段均發(fā)揮作用，影響AS進(jìn)程，為AS防治研究提供了新靶點(diǎn)［10］。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）常用于自噬相關(guān)蛋白檢測(cè)，脂化后的LC3為L(zhǎng)C3Ⅱ，常用于評(píng)估自噬活性［11］。AMPK/mTOR/p70S6K是自噬經(jīng)典通路之一，在自噬調(diào)控中起關(guān)鍵作用。AMPK、mTOR、p70S6K是AKT/mTOR/p70S6K通 路 關(guān)鍵 分子，mTOR可通過(guò)抑制自噬途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫細(xì)胞形成，從而促進(jìn)AS病理過(guò)程，p70S6K是負(fù)性自噬調(diào)節(jié)通路mTOR的關(guān)鍵下游激酶，AMPK激活可抑制mTOR、p70S6K磷酸化，誘導(dǎo)自噬，延緩AS進(jìn)程［12］。IL-6、IL-10、IFN-γ等炎癥因子激活可介導(dǎo)自噬，而適度自噬又可抑制炎癥因子表達(dá)［13］。

本研究采用不同濃度四妙勇安湯含藥血清干預(yù)RAW264.7源性泡沫細(xì)胞，通過(guò)CCK-8法觀察含藥血清對(duì)泡沫細(xì)胞活化的影響，確定含藥血清干預(yù)濃度為20%。目前，體外建立巨噬細(xì)胞泡沫化模型最常用的為ox-LDL。研究表明，ox-LDL可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞自噬且呈劑量依賴性［14］；但也有研究報(bào)道，ox-LDL可抑制THP-1源性巨噬細(xì)胞自噬，且呈時(shí)間和劑量依賴性［15-16］。ox-LDL誘導(dǎo)細(xì)胞泡沫化過(guò)程中，可抑制亦可誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，可能與ox-LDL濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、是否聯(lián)合其他誘導(dǎo)藥物使用以及細(xì)胞種類密切相關(guān)。本研究采用66 μg/ml ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，油紅O染色結(jié)果顯示，經(jīng)ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)明顯可見(jiàn)大量橘紅色脂滴，說(shuō)明ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化。與模型組相比，含藥血清抑制促炎因子IL-6和IFN-γ表達(dá)，誘導(dǎo)抑炎因子IL-10表達(dá)；與模型組相比，含藥血清組和雷帕霉素組自噬小體數(shù)量增加，LC3Ⅱ陽(yáng)性點(diǎn)數(shù)量增多以及調(diào)控AMPK/mTOR/p70S6K信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

綜上所述，四妙勇安湯含藥血清可調(diào)節(jié)ox-LDL誘導(dǎo)的泡沫化巨噬細(xì)胞活化，降低細(xì)胞炎癥因子表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，可能是其防治AS的作用機(jī)制之一。