王林琳 康智能 劉文鵬 唐標(biāo) 鄧常清

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合病原生物學(xué)湖南省點(diǎn)重實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410028）

缺血性腦卒中是全球主要的疾病負(fù)擔(dān)，其治療手段以溶栓和取栓為主，但血流復(fù)灌后常加重?fù)p傷，即腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfu?sion injury，CIRI）［1-2］。CIRI的損傷機(jī)制復(fù)雜，與炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等多環(huán)節(jié)以及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞焦亡和程序性壞死等多種細(xì)胞死亡方式有關(guān)［3］。鐵死亡作為新的細(xì)胞死亡方式參與CIRI，已有研究揭示腦缺血再灌注誘導(dǎo)神經(jīng)元鐵死亡，而抑制鐵死亡能減輕CIRI，鐵死亡成為CIRI干預(yù)的重要潛在靶點(diǎn)［4-5］。

三七具有活血散瘀、消腫定痛等功效，是治療心腦血管疾病的常用中藥。三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）是三七主要的有效成分，PNS制劑如血栓通和血塞通廣泛應(yīng)用于心腦血管疾病的防治中，療效確切。已有研究揭示PNS可通過(guò)抗炎、抗氧化、促進(jìn)血管新生等多環(huán)節(jié)發(fā)揮抗CIRI作用［6-7］，但PNS是否調(diào)控鐵死亡從而減輕CIRI尚未見報(bào)道。本研究基于PNS對(duì)鐵死亡的調(diào)控作用探討PNS減輕CIRI的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物PNS（批號(hào)：DS0054）購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠73只，體質(zhì)量（220±10）g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［SCXK（湘）2019-0004）］。排除手術(shù)中出血、再灌注死亡及造模不成功的13只，剩余60只用于后續(xù)試驗(yàn)，每組12只，其中全部12只進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分，6只用于染色和形態(tài)學(xué)檢測(cè)，6只用于試劑盒和Western blot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)后實(shí)施（編號(hào)：LL2021042803）。

1.1.3 主要試劑線栓（批號(hào)：2636A2）購(gòu)自北京西濃科技有限公司；TTC染料（批號(hào)：BCCC4696）、鼠抗β-actin單克隆抗體（批號(hào)：A5441）購(gòu)自Sigma公司；Western及IP細(xì)胞裂解液（批號(hào)：P0013）、SDSPAGE凝膠配制試劑盒（批號(hào)：P0014A）購(gòu)自碧云天公司；MDA試劑盒（批號(hào)：A003-1）、GSH試劑盒（批號(hào)：A006-2-1）、組織Fe2+試劑盒（批號(hào)：A039-2-1）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；大鼠IL-6試劑盒（批號(hào)：CSB-E04640）、TNF-α試劑盒（批號(hào)：CSB-E11987）和IL-1β試劑盒（批號(hào)：CSB-E08055）購(gòu)自武漢華美有限公司；GPX4抗體（批號(hào)：DF6701）購(gòu)自Affinity Biosciences公司；山羊抗鼠二抗（批號(hào)：ZK-0293P）和山羊抗兔二抗（批號(hào)：ZK-0295G-SA）購(gòu)自Merck Mil?lipore公司。

1.1.4 主要儀器電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀及凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與CIRI大鼠模型的建立大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、MCAO/R組和PNS低、中、高劑量組，12只/組。參照前期實(shí)驗(yàn)制作模型，操作簡(jiǎn)述如下：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（42 mg/kg）麻醉后，右側(cè)頸外動(dòng)脈結(jié)扎、凝斷后剪口，將線栓從頸外動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，并沿頸內(nèi)動(dòng)脈輕柔推至大鼠大腦前動(dòng)脈，線栓頭端阻塞大腦中動(dòng)脈，進(jìn)線長(zhǎng)度距頸總動(dòng)脈分叉處約為（18±2）mm，固定后縫合。線栓阻斷血流2 h后，抽出線栓實(shí)施復(fù)灌注24 h；假手術(shù)組分離血管，不剪口和插線栓。PNS低、中、高劑量組于造模前50 h和26 h、2 h連續(xù)灌胃給藥3次，劑量分別為20、40、80 mg/kg［8］。假手術(shù)組與MCAO/R組灌胃給予等體積生理鹽水。

1.2.2 神經(jīng)功能評(píng)分缺血再灌注后各組大鼠參照Longa評(píng)分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺失雙盲評(píng)分［9］，0分：無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀；1分：提尾時(shí)左側(cè)前肢不能完全伸直；2分：爬行時(shí)持續(xù)性向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時(shí)身體向左側(cè)傾倒；4分：不能自行行走，意識(shí)喪失。評(píng)分越高說(shuō)明大鼠神經(jīng)功能障礙越嚴(yán)重。有神經(jīng)功能缺失癥狀和神經(jīng)功能評(píng)分為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 腦梗死體積測(cè)定采用TTC染色法檢測(cè)腦梗死體積，斷頭取腦后于-20℃冰箱放置20~25 min，除去小腦和嗅球，從大腦的額葉向枕葉連續(xù)切5片，厚度約為2 mm。腦片于3%TTC溶液中37℃孵育18 min，期間翻面2次，染色分明后取出，放入4%的多聚甲醛中固定過(guò)夜后拍照。

1.2.4 腦組織中MDA、GSH、Fe2+含量測(cè)定取大鼠右側(cè)皮層組織放入液氮中速凍，然后置于預(yù)冷后的研磨缽中研磨成白色粉末狀，取粉末稱取重量，根據(jù)重量和體積1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行勻漿。勻漿后，3 500 r/min離心12 min，吸取上清液以備檢測(cè)，檢測(cè)按照說(shuō)明書添加樣品及工作試劑，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算MDA、Fe2+、GSH含量。

1.2.5 Western blot檢測(cè)大鼠腦組織GPX4的蛋白表達(dá)同前期研究，取大鼠右側(cè)大腦皮質(zhì)組織裂解后，12 000 r/min離心12 min，取上清測(cè)定蛋白濃度并配平和變性。取30 μg蛋白進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜和封閉后，加入GPX4（1∶1 000）或β-actin（1∶10 000）抗體4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，洗滌后顯影，Image J軟件進(jìn)行條帶的定量分析［8］。

1.2.6 腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的測(cè)定取大鼠右側(cè)缺血大腦皮質(zhì)組織勻漿后，4 800 r/min離心6 min，取上清按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS23.0進(jìn)行分析，計(jì)量資料以±s表示。數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后，用單因素方差分析進(jìn)行多組間比較，方差齊者采用LSD檢驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，方差不齊者用Dunnet's T3檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PNS對(duì)MCAO/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響如表1所示，假手術(shù)組大鼠無(wú)神經(jīng)功能缺失癥狀，評(píng)分為0；與假手術(shù)組相比，MCAO/R大鼠評(píng)分顯著增加（P<0.01）；與MCAO/R組相比，PNS低、中、高劑量組大鼠評(píng)分顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

表1 PNS對(duì)MCAO/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響（±s）Tab.1 Effects of PNS on neurological deficit score of MCAO/R rats（±s）

表1 PNS對(duì)MCAO/R大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響（±s）Tab.1 Effects of PNS on neurological deficit score of MCAO/R rats（±s）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.01；compared with MCAO/R group，2）P<0.05，3）P<0.01.

Groups Sham MCAO/R PNS 20 mg/kg PNS 40 mg/kg PNS 80 mg/kg n 12 12 12 12 12 Neurological deficit score 0±0 2.83±0.691）2.08±0.642）1.83±0.693）1.50±0.653）

2.2 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦梗死體積的影響TTC染色結(jié)果如圖1所示，紅色為腦組織正常區(qū)，白色為腦缺血梗死區(qū)，假手術(shù)組大鼠腦片無(wú)梗死區(qū)，MCAO/R處理后大鼠腦有明顯的白色腦梗死區(qū)，而PNS干預(yù)后減少大鼠腦梗死區(qū)體積。

2.3 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中MDA、GSH、Fe2+含量的影響與假手術(shù)組相比，MCAO/R組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)組織中GSH含量顯著降低，F(xiàn)e2+和MDA含量顯著升高（P<0.01）；與MCAO/R組相比，PNS組大鼠腦組織中GSH含量顯著升高，F(xiàn)e2+和MDA含量顯著降低（P<0.01），見表2。

表2 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中MDA、GSH、Fe2+含量的影響（±s，nmol/mg，n=6）Tab.2 Effects of PNS on MDA，GSH，F(xiàn)e2+contents of MCAO/R rats cerebral cortex（±s，nmol/mg，n=6）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.01；compared with MCAO/R group，2）P<0.01.

Groups Sham MCAO/R PNS 20 mg/kg PNS 40 mg/kg PNS 80 mg/kg MDA 18.24±1.06 38.64±1.921）30.17±1.352）25.15±1.272）22.83±0.952）GSH 14.25±1.06 5.51±1.301）7.45±0.802）9.33±0.802）10.18±1.022）Fe2+0.044±0.011 0.091±0.0141）0.076±0.0072）0.072±0.0052）0.068±0.0072）

2.4 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中GPX4表達(dá)水平的影響如圖2所示，MCAO/R處理后，大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)組織中GPX4表達(dá)水平顯著降低（P<0.01）；而PNS低、中、高劑量干預(yù)能顯著增加大鼠MCAO/R后大腦組織中GPX4蛋白表達(dá)水平（P<0.01）。

圖2 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中GPX4表達(dá)水平的影響Fig.2 Effect of PNS on GPX4 expression of MCAO/R rats cerebral cortex

2.5 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響MCAO/R處理后，大鼠皮層腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著升高（P<0.01）；PNS低、中、高劑量干預(yù)后，MCAO/R大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著降低（P<0.01），見表3。

表3 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響（±s，pg/mg，n=6）Tab.3 Effects of PNS on IL-1β，TNF-α，IL-6 contents of MCAO/R rats cerebral cortex（±s，pg/mg，n=6）

表3 PNS對(duì)MCAO/R大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的影響（±s，pg/mg，n=6）Tab.3 Effects of PNS on IL-1β，TNF-α，IL-6 contents of MCAO/R rats cerebral cortex（±s，pg/mg，n=6）

Note：Compared with Sham group，1）P<0.01；compared with MCAO/R group，2）P<0.01.

Groups Sham MCAO/R PNS 20 mg/kg PNS 40 mg/kg PNS 80 mg/kg IL-1β 27.75±4.71 85.67±13.541）71.46±9.052）53.18±5.432）43.16±6.322）TNF-α 8.86±0.96 19.82±0.901）16.37±1.222）14.23±1.452）12.01±1.522）IL-6 0.044±0.003 0.067±0.0061）0.058±0.0032）0.056±0.0022）0.053±0.0042）

3 討論

本研究揭示MCAO/R處理后，大鼠有明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀和腦梗死區(qū)，評(píng)分顯著增加，缺血側(cè)大腦皮質(zhì)組織中Fe2+和MDA及促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6含量顯著增加，GSH含量和鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4水平顯著降低；PNS干預(yù)顯著降低大鼠MCAO/R后的評(píng)分，減少腦梗死區(qū)域體積，降低缺血側(cè)腦組中Fe2+和MDA含量，增加GSH含量和GPX4表達(dá)水平，降低IL-1β、TNF-α、IL-6含量。已有大量前期體內(nèi)和體外研究揭示PNS能減輕CIRI［10-12］，本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果一致，表明PNS具有減輕CIRI作用。

鐵死亡作為一種新的細(xì)胞死亡方式介導(dǎo)了癌癥、缺血再灌注損等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程，參與并加重CIRI，抑制鐵死亡，減輕CIRI［13-15］。鐵死亡的主要特征是鐵依賴的脂質(zhì)過(guò)氧化活化以及過(guò)氧化產(chǎn)物蓄積誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，并常伴隨GSH和GPX4抗氧化系統(tǒng)功能下調(diào)，在腦缺血再灌注中，鐵死亡的發(fā)生主要表現(xiàn)為鐵超載，GPX4和GSH水平降低及脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量增加［16-17］。本研究結(jié)果顯示MCAO/R大鼠腦組織中Fe2+含量升高，GSH含量和GPX4水平降低，MDA含量升高，表明腦缺血再灌注誘導(dǎo)鐵死亡發(fā)生。此外，結(jié)果顯示PNS下調(diào)腦組中MDA和Fe2+含量，上調(diào)GSH含量和GPX4水平，表明PNS能抑制腦缺血再灌注中的鐵死亡，提示PNS可能通過(guò)抑制鐵死亡發(fā)揮抗CIRI作用。

炎癥反應(yīng)是CIRI機(jī)制的重要環(huán)節(jié)，腦缺血再灌注后炎癥細(xì)胞活化和TNF-α、IL-1β等促炎因子的分泌，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)及血腦屏障和神經(jīng)細(xì)胞損傷［18-19］。實(shí)驗(yàn)研究表明，多類中藥有效成分和中藥復(fù)方均能減輕促炎因子的釋放和增加抗炎因子的表達(dá)，有效控制炎癥反應(yīng)減輕CIRI［20-21］。本研究結(jié)果顯示，MCAO/R處理后，大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)組織IL-1β、TNF-α和IL-6含量顯著升高，而PNS的干預(yù)顯著降低皮層組織中促炎因子含量，表明PNS在CIRI中能降低促炎因子的含量抑制炎癥反應(yīng)。此外有研究報(bào)道鐵死亡有較強(qiáng)的促炎作用，鐵死亡會(huì)導(dǎo)致?lián)p傷模式相關(guān)分子的釋放激活固有免疫，釋放促炎因子和活化促炎通路加重炎癥反應(yīng)［22］，既往研究揭示鐵死亡抑制劑可抑制鐵死亡，降低組織中IL-1β和TNF-α含量，抑制炎癥反應(yīng)有效干預(yù)腦出血、非酒精肝炎和急性腎損傷等疾?。?3-25］。但PNS是否通過(guò)抑制鐵死亡從而減少促炎因子的釋放抑制炎癥反應(yīng)減輕CIRI尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，PNS可減輕MCAO/R大鼠CIRI，其機(jī)制可能與抑制鐵死亡和炎癥反應(yīng)有關(guān)。