李潤(rùn)豐，董大山，施可彬，2

（1 北京大學(xué)物理學(xué)院人工微結(jié)構(gòu)和介觀物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100871）

（2 山西大學(xué)極端光學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心，太原030006）

0 引言

光與物質(zhì)相互作用一直以來(lái)是科學(xué)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。光作為一種非侵入、無(wú)接觸的探測(cè)手段可以高效而無(wú)損地獲取待測(cè)體系內(nèi)部的豐富信息。這些信息或揭示樣本的化學(xué)特異性，為定量的物質(zhì)成分分析提供依據(jù)；或反映了樣品精細(xì)的空間結(jié)構(gòu)，允許人們以光為媒介提取微生物、微結(jié)構(gòu)的形態(tài)學(xué)特征；或打開(kāi)了觀察樣品的時(shí)間窗口，以超短光脈沖為信息載體揭示瞬態(tài)動(dòng)力學(xué)過(guò)程。

基于自發(fā)拉曼散射的光譜和成像技術(shù)就是這一領(lǐng)域的重要研究方向，自1928年發(fā)現(xiàn)以來(lái)［1-10］，逐步成為光學(xué)領(lǐng)域重要的研究工具。一方面，拉曼散射光子攜帶分子的振動(dòng)信息，彌補(bǔ)了紅外光譜在水吸收窗口處的探測(cè)能力不足，為生物、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究提供了重要的工具；另一方面，作為一種重要的無(wú)標(biāo)記檢測(cè)手段，拉曼光譜可以在保持樣品活性的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)無(wú)損和長(zhǎng)時(shí)程的觀察［11-20］。

由于自發(fā)拉曼信號(hào)需要較長(zhǎng)的積分時(shí)間，所以當(dāng)涉及到一些瞬態(tài)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程以及活體生物動(dòng)態(tài)觀察時(shí)，成像的速度受到極大的制約。為了更進(jìn)一步提高拉曼信號(hào)的強(qiáng)度，利用非線性光學(xué)過(guò)程實(shí)現(xiàn)的相干拉曼散射（Coherent Raman Scattering，CRS）技術(shù)蓬勃發(fā)展，主要方法包括相干反斯托克斯拉曼散射（Coherent Anti-stokes Raman Scattering，CARS）和受激拉曼散射（Stimulated Raman Scattering，SRS）。相干拉曼相比于自發(fā)拉曼大大提高了信號(hào)強(qiáng)度，同時(shí)使信號(hào)采集的積分時(shí)間縮短。自CRS 走向應(yīng)用以來(lái)，出現(xiàn)在各類(lèi)化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的新場(chǎng)景，也在不斷提出新的要求與挑戰(zhàn)：如何實(shí)現(xiàn)更高的信噪比，更大的穿透深度，更快的探測(cè)速度，更豐富的光譜信息，更強(qiáng)的分辨能力［21-30］。這也極大地促進(jìn)了相干拉曼技術(shù)在最近二十年來(lái)的快速發(fā)展：通過(guò)結(jié)合各類(lèi)新型光場(chǎng)調(diào)控方法，從相干拉曼的非線性過(guò)程中光束的偏振、啁啾、時(shí)序、相位等多個(gè)維度入手，應(yīng)對(duì)上述挑戰(zhàn)，使基于CRS 的光譜與成像技術(shù)在多個(gè)領(lǐng)域具有重要的實(shí)用價(jià)值，本文以光場(chǎng)調(diào)控為主線，梳理CRS 光譜和成像上的發(fā)展與應(yīng)用。

1 基本原理

相干拉曼技術(shù)本質(zhì)上是涉及四個(gè)光子的三階非線性光學(xué)過(guò)程，該過(guò)程與待測(cè)體系的三階非線性極化率有關(guān)。不管樣品是否具有對(duì)稱(chēng)性，總有非零的三階非線性極化率張量元，因此可以廣泛用于物質(zhì)探測(cè)。為了獲得顯著的三階非線性效應(yīng)有兩種方法，第一是利用脈沖激光器提供極高的峰值功率，第二是調(diào)諧作用光的頻率通過(guò)共振增強(qiáng)。上述頻率調(diào)諧具體是，頻率為ωP1的泵浦光（pump）和頻率為ωS的斯托克斯光（Stokes）激發(fā)樣品（ωP1＞ωS），當(dāng)滿足共振條件：泵浦光和斯托克斯光的頻率差與樣品化學(xué)鍵振動(dòng)頻率Ω一致時(shí)，樣品分子將處于拉曼相干態(tài)。在此基礎(chǔ)上有CARS 和SRS 兩類(lèi)過(guò)程，能級(jí)示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 CARS 和SRS 能級(jí)示意圖［5］Fig.1 Energy diagrams of spontaneous Raman，SRS and CARS［5］

對(duì)于CARS，若頻率為ωP2的探測(cè)光在相位匹配的方向上入射，將產(chǎn)生頻率為ωAS=ωP1?ωS+ωP2的反斯托克斯光。其中，探測(cè)光也可由泵浦光充當(dāng)，則此時(shí)ωAS=2ωP?ωS，被稱(chēng)為簡(jiǎn)并的CARS。CARS 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于，信號(hào)強(qiáng)度比自發(fā)拉曼散射強(qiáng)度大4～5 個(gè)數(shù)量級(jí)，并且信號(hào)光在泵浦光的藍(lán)端易于采集且不易受熒光干擾。CARS 技術(shù)的不足則主要在于非共振背景的影響，這一背景來(lái)源于樣品分子和所處環(huán)境的電子對(duì)入射光的響應(yīng)，是與共振無(wú)關(guān)的四波混頻噪聲［4］，會(huì)使采集到的CARS 光譜相對(duì)自發(fā)拉曼光譜發(fā)生偏移，因此涌現(xiàn)出了多種光場(chǎng)調(diào)控的方法對(duì)該背景噪聲進(jìn)行抑制或消除。

SRS 技術(shù)的產(chǎn)生機(jī)制與CARS 不同，在共振激發(fā)下，光與樣品分子可以發(fā)生能量交換。泵浦光子借助分子振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)化成為斯托克斯光子，同時(shí)將部分能量轉(zhuǎn)移至振動(dòng)能級(jí)上。因此泵浦光會(huì)發(fā)生受激拉曼損失（Stimulated Raman Loss，SRL），同時(shí)斯托克斯光會(huì)發(fā)生受激拉曼增益（Stimulated Raman Gain，SRG）。SRS 只有嚴(yán)格滿足共振條件時(shí)才會(huì)發(fā)生，因而本質(zhì)上不存在非共振背景，通過(guò)鎖相放大技術(shù)可以把SRL 或SRG 這一微弱的信號(hào)提取采集。實(shí)際應(yīng)用中鎖相放大技術(shù)需要提供一個(gè)參考頻率，這一頻率調(diào)制通常借助于振幅［6］、偏振［7］、移頻［8］等調(diào)控方式實(shí)現(xiàn)。

2 光場(chǎng)調(diào)控在相干拉曼光譜學(xué)中的應(yīng)用

以CARS 和SRS 的拉曼特異性機(jī)制實(shí)現(xiàn)光譜探測(cè)可以追溯到20世紀(jì)60年代［9］。特別是CARS 光譜技術(shù)，因其可以推斷物質(zhì)組分與濃度，也可以進(jìn)一步獲取氣體樣品的溫度信息，所以自從被發(fā)現(xiàn)以來(lái)CARS 光譜在燃燒場(chǎng)診斷中得到了廣泛的應(yīng)用［10］。相比于傳統(tǒng)接觸式的熱電偶等方法，CARS 光譜可以通過(guò)非接觸式的光學(xué)方法，輕易實(shí)現(xiàn)高溫場(chǎng)的診斷，但在早期的實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些問(wèn)題。

2.1 入射光場(chǎng)角度調(diào)控——BOXCARS

早期CARS 光譜的相位匹配方式是共線的，這意味著在泵浦光和斯托克斯光行進(jìn)路徑上的介質(zhì)都會(huì)產(chǎn)生CARS 信號(hào)，因此空間分辨率較低。1978年，ECKBRETH A C 借助對(duì)入射角度和波前的調(diào)控實(shí)現(xiàn)了非共線相位匹配的交叉CARS（BOXCARS）［11］。在這種相位匹配方式下，CARS 信號(hào)只有在三束光交叉點(diǎn)處才會(huì)產(chǎn)生，并且在透鏡的聚焦下，焦點(diǎn)可以做到比較小，以此提高空間分辨率。1980年，PRIOR Y 進(jìn)一步提出三維BOXCARS 的概念［12］。同年，SHIRLEY J A 等提出折疊的BOXCARS［13］。這些工作把對(duì)光場(chǎng)入射角度的調(diào)控拓展到三維空間，在提高空間分辨率的同時(shí)，使信號(hào)光與入射光更容易分離。CARS相位匹配方式見(jiàn)圖2。

圖2 通過(guò)調(diào)控入射角度實(shí)現(xiàn)各種CARS 相位匹配方式Fig.2 CARS phase matching methods by adjusting the incident angle of light field

2.2 脈沖光場(chǎng)時(shí)序調(diào)控——時(shí)間分辨CARS

影響光譜效果的第二個(gè)問(wèn)題是非共振背景，這一背景容易使化學(xué)特征峰位置發(fā)生偏移，對(duì)譜學(xué)的分析會(huì)有干擾。研究人員為了解決這一問(wèn)題，提出了一種通過(guò)調(diào)控探測(cè)脈沖時(shí)序做時(shí)間分辨抑制非共振背景的方法，該方法利用了CARS 信號(hào)的拉曼相干態(tài)和非共振背景的激發(fā)虛態(tài)隨時(shí)間的衰減特性不同的特性。以空氣的時(shí)間分辨CARS 光譜為例［14］，如圖3所示，空氣的CARS 光譜主要由氮?dú)獾腃ARS 信號(hào)和另外三種物質(zhì)的非共振背景構(gòu)成，很明顯可以看出，當(dāng)精確調(diào)控探測(cè)光束延遲110 ps 時(shí)，非共振信號(hào)減少了三個(gè)以上的數(shù)量級(jí)，而共振信號(hào)僅減少了三倍。連續(xù)調(diào)控探測(cè)光脈沖的延遲可以獲得不同溫度下拉曼相干態(tài)的時(shí)間演化，這也可以成為燃燒場(chǎng)診斷中判斷溫度的依據(jù)。時(shí)間分辨的方法也被應(yīng)用在氫氣及其瞬態(tài)動(dòng)力學(xué)的研究［15］，并逐漸被應(yīng)用到單層及多層石墨烯的CARS 光譜研究中［16］。值得一提的是，時(shí)間分辨的CARS 最早于2002年由XIE X S 等提出并應(yīng)用于顯微成像［17］，并且抑制CARS 非共振背景的光場(chǎng)調(diào)控方法多種多樣，我們將在第三節(jié)成像部分予以補(bǔ)充。

圖3 共振信號(hào)和非共振背景隨泵浦光-探測(cè)光延時(shí)的演化［14］Fig.3 Relationship between CARS signal components and Pump-Probe Delay

2.3 探測(cè)脈沖啁啾調(diào)控——single shot CARS

隨著激光脈沖從納秒發(fā)展到飛秒，為了獲得1kHz 甚至更高的瞬態(tài)譜學(xué)分析，研究者更傾向于做基于飛秒脈沖的單次（single-shot）光譜測(cè)量，此時(shí)上述連續(xù)調(diào)控探測(cè)脈沖延時(shí)的方法因?yàn)檫^(guò)程耗時(shí)所以無(wú)法適用。2002年LANG T 等提出調(diào)控探測(cè)光的啁啾（Chirped Probe Pulse，CPP）［18］，把探測(cè)光在時(shí)域上從幾十個(gè)飛秒拉長(zhǎng)至幾個(gè)皮秒，這樣就可以獲得相應(yīng)的幾個(gè)皮秒時(shí)間內(nèi)拉曼相干態(tài)隨時(shí)間的演化。啁啾調(diào)控下的探測(cè)光脈沖低頻分量先于高頻分量作用于樣品，因此把采集到的光譜做傅里葉變換可以獲得時(shí)間分辨CARS 光譜結(jié)果，以此可以作為溫度推斷的依據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)瞬態(tài)火焰燃燒場(chǎng)的高速光譜采集［19］。這種方法也被應(yīng)用于其他大數(shù)據(jù)量且需要高速采集的研究中，例如對(duì)于細(xì)菌等微生物的光譜研究［20-21］。為了實(shí)現(xiàn)single shot 的高頻測(cè)量，研究人員還提出了一種混合fs/ps 的single shot CARS［22］，與CPP 不同之處在于把高啁啾、寬頻譜的皮秒探測(cè)脈沖替換為窄頻譜的皮秒脈沖，兩種方法的光譜探測(cè)效果相似，但后者相較于CPP 在光譜的數(shù)據(jù)擬合上更加便捷［23］。

3 光場(chǎng)調(diào)控在相干拉曼顯微成像中的應(yīng)用

相干拉曼光譜應(yīng)用近年來(lái)也在追求獲得更高分辨率的空間信息，已經(jīng)有部分研究把單點(diǎn)的CRS 光譜拓展到一維線上［24］，再到二維的平面［25-26］，但受制于弱聚焦模式，其分辨率依然無(wú)法做到幾十微米以下。如何把拉曼特異性這一成像襯度應(yīng)用到高分辨的光學(xué)成像應(yīng)用中，實(shí)現(xiàn)無(wú)標(biāo)記的微生物、微結(jié)構(gòu)的顯微觀察成為了CRS 技術(shù)的重要研究方向。

最早的CRS 成像實(shí)驗(yàn)可以追溯到1985年，DUNCAN M D 等運(yùn)用非共線相位匹配方式獲得了洋蔥表皮細(xì)胞的CARS 圖像［27］，但這種非共線的相位匹配方式以及透鏡聚焦的光路配置限制了圖像分辨率。一直到1999年，ZUMBUSCH A 等運(yùn)用近紅外光源以共線的相位匹配方式實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞的CARS 顯微成像［28］。采用近紅外的激發(fā)光源一方面避開(kāi)了電子態(tài)的躍遷，可以抑制非共振背景的干擾；另一方面提高了穿透深度，利于實(shí)現(xiàn)厚樣品的CARS 成像。該研究還指出利用高數(shù)值孔徑物鏡實(shí)現(xiàn)緊聚焦的情況下，相位匹配條件容易滿足，并且可以實(shí)現(xiàn)三維成像。自此，CARS 顯微鏡的配置大部分由非共線轉(zhuǎn)向共線，通過(guò)對(duì)商用共聚焦顯微鏡或多光子顯微鏡改裝，結(jié)合單像素探測(cè)器做點(diǎn)掃描的顯微成像，CARS 顯微術(shù)也逐步走向?qū)嵱茫?，29-30］。作為CRS 成像的另一個(gè)脈絡(luò)，SRS 技術(shù)首次運(yùn)用到顯微成像上在2008年［6］。由于SRS 在原理上規(guī)避了CARS 過(guò)程的非共振背景，并且不同于CARS 信號(hào)對(duì)樣品濃度的二次依賴(lài)關(guān)系，SRS 信號(hào)強(qiáng)度與樣品濃度有線性的對(duì)應(yīng)關(guān)系，在定量分析上也有一定優(yōu)勢(shì)，因此在最近十年來(lái)獲得了迅猛發(fā)展［31-40］。相較于CARS，常見(jiàn)的SRS 的光路還需要額外配置斯托克斯光路上的調(diào)制器以及信號(hào)端的鎖相放大器。在CRS 成像應(yīng)用中有很多技術(shù)難點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)通過(guò)光場(chǎng)調(diào)控方法實(shí)現(xiàn)，我們將在下文加以分析。

3.1 時(shí)間加啁啾調(diào)控

CRS 成像的非線性過(guò)程往往需要較高的峰值功率，因此所采用的光源大部分是脈沖光。通過(guò)調(diào)控脈沖光場(chǎng)的時(shí)間和啁啾特性可以對(duì)CRS 成像有實(shí)質(zhì)性的幫助。脈沖光的啁啾可以看作是時(shí)域和頻率的映射關(guān)系，調(diào)控這一映射關(guān)系具有比較豐富的內(nèi)涵，包括時(shí)域的延時(shí)和拉伸、頻率的剪裁和移動(dòng)等都在CRS 成像應(yīng)用中有體現(xiàn)。

3.1.1 時(shí)域延遲

利用時(shí)域延時(shí)方法實(shí)現(xiàn)CARS 成像早在2002 就已經(jīng)被提出［17］，VOLKMER A 等通過(guò)調(diào)控探測(cè)光相對(duì)于泵浦光、斯托克斯光的延時(shí)，實(shí)現(xiàn)了非共振背景的有效抑制。該實(shí)驗(yàn)展示了聚苯乙烯小球產(chǎn)生的CARS信號(hào)相比于水溶液的非共振背景具有更長(zhǎng)的退相干時(shí)間，因此，相對(duì)于泵浦光和斯托克斯光作用于樣品的時(shí)間零點(diǎn)，把脈沖光時(shí)間調(diào)節(jié)到幾百個(gè)飛秒后，采集到的光譜里幾乎不含有非共振背景，這一方法有效地將信噪比（信號(hào)強(qiáng)度與非共振背景之比）提升超過(guò)十倍。脈沖光場(chǎng)的時(shí)域調(diào)控在最近的SRS 成像中也有非常新穎的應(yīng)用［35］，該研究中飛秒的泵浦和斯托克斯激光脈沖相向傳播進(jìn)入樣品，一系列的脈沖串在組織的固定深度處重復(fù)地相遇形成脈沖光片（pulse sheet），通過(guò)調(diào)控兩束脈沖的相對(duì)時(shí)間延遲可以獲得樣品縱向不同深度的SRS 信號(hào)，結(jié)合振鏡在橫向做二維掃描即可獲得SRS 的三維層析圖像。

3.1.2 頻域掃描

調(diào)控脈沖光場(chǎng)的啁啾特性可以實(shí)現(xiàn)高光譜的CRS 成像，即在每一個(gè)成像像素上采集到多個(gè)光譜成分。高光譜的CRS 成像所用脈沖光主要是皮秒或者飛秒，兩者的區(qū)別在于前者光譜較窄所以光譜分辨率高，而后者光譜較寬所以能激發(fā)多個(gè)振轉(zhuǎn)能級(jí)，因此在做高光譜成像應(yīng)用時(shí)主要有三種模式：頻率掃描、光譜聚焦、多色CARS（multiplex CARS），見(jiàn)圖4。

圖4 高光譜CRS 成像主要的三種模式［3］Fig.4 Methods of hyperspectral CRS imaging［3］

首先是基于頻率掃描的方式，對(duì)于入射的兩束脈沖光，固定其中一束光的頻率并在一定范圍內(nèi)連續(xù)調(diào)諧另一束光的頻率，即可在每個(gè)像素點(diǎn)上都能采集到覆蓋拉曼特征區(qū)域的完整光譜。這兩束光可以是窄帶的皮秒脈沖［30］，也可以是對(duì)飛秒脈沖整形后單色性較好的脈沖［36］。這種脈沖整形的技術(shù)可以通過(guò)光柵把光束色散開(kāi)，并利用快速移動(dòng)的狹縫和反射鏡不停裁剪出某個(gè)頻率成分的光送出去，實(shí)現(xiàn)快速選頻的功能［37］。這種選頻方案也可以通過(guò)振鏡與光柵的4f系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)［32］。

其次是基于光譜聚焦的方法，這主要通過(guò)兩個(gè)寬帶（飛秒）激光束實(shí)現(xiàn)。利用光學(xué)展寬元件使泵浦光和斯托克斯光獲得不同的啁啾量，使得時(shí)域重疊的光譜頻率成分縮小，讓兩束脈沖在不同時(shí)間重合即可獲得不同的頻率差，進(jìn)一步只要連續(xù)調(diào)控時(shí)間延遲即可找到共振頻率，或是在共振頻率附近進(jìn)行掃描［38-41］。最近，HE R 等在這種光譜聚焦的模式上充分利用鎖相放大器的兩個(gè)通道實(shí)現(xiàn)雙色SRS 成像，可以完成對(duì)脂肪和蛋白質(zhì)兩類(lèi)物質(zhì)同時(shí)觀察［42］。同時(shí)，掃描兩個(gè)脈沖之間的時(shí)間延遲可以做到很快，通過(guò)振鏡［43］、諧振鏡［44］以及六邊形反射鏡［45］等時(shí)間延遲線方案，大大縮短了光譜采集時(shí)間，最新的，LIN H 等的研究中采集每張光譜最快只需要20 μs［46］。

多色CARS 最初是通過(guò)使用窄帶泵浦光和寬帶斯托克斯光的方法實(shí)現(xiàn)［47，48］。后來(lái)隨著激光器技術(shù)的發(fā)展，生成超寬帶甚至是超連續(xù)的斯托克斯光源的方案不斷涌現(xiàn)［49-52］，因其對(duì)于單個(gè)像素可以一次性獲得整個(gè)光譜，也為快速高光譜成像提供了便利。

3.1.3 頻率移動(dòng)

直接調(diào)控脈沖光頻率的移動(dòng)，除了能實(shí)現(xiàn)上述高光譜的應(yīng)用，還可以有抑制CRS 成像噪聲的用途。對(duì)于抑制CARS 的非共振背景，只需要調(diào)制泵浦光和斯托克斯光的差頻在共振與非共振之間以一定頻率來(lái)回切換，由于非共振背景對(duì)這樣的高頻調(diào)制沒(méi)有響應(yīng)，因此結(jié)合鎖相放大器可以直接檢出調(diào)制的CARS 信號(hào)［53］。對(duì)于SRS 成像應(yīng)用而言，主要的噪聲來(lái)源于包括泵浦光和斯托克斯光的競(jìng)爭(zhēng)、交叉相位調(diào)制以及一些電子背景等。這種寬譜的噪聲是主流的振幅調(diào)制方法無(wú)法解決的，而窄帶的頻率調(diào)制不失為一種有效的方案。從早期的在激光器腔內(nèi)直接調(diào)頻［54］，再到后來(lái)的多個(gè)商用激光器同步調(diào)頻［55］。一直到最近XIONG H 等利用脈沖光在單模光纖中的自相位調(diào)制，把皮秒斯托克斯光分成兩種頻率成分，分別對(duì)應(yīng)共振和非共振并以此實(shí)現(xiàn)頻率調(diào)制，這種方法在實(shí)用性上有一定優(yōu)勢(shì)［8］。得益于頻率調(diào)制帶來(lái)的高信噪比，他們?cè)诖嘶A(chǔ)上實(shí)現(xiàn)了高對(duì)比度、高靈敏度的受激拉曼激發(fā)熒光成像，并與受激輻射淬滅成像（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）集成，相較于其他超分辨拉曼成像方法，使用較低的激光功率實(shí)現(xiàn)了更好的分辨率增強(qiáng)［56］。

3.2 偏振調(diào)控

CRS 的過(guò)程是偏振依賴(lài)的，調(diào)控入射泵浦和斯托克斯光場(chǎng)的偏振態(tài)一方面可以利用樣品分子共振信號(hào)和非共振背景的解偏率不同實(shí)現(xiàn)背景噪聲的抑制，另一方面也可以有效揭示樣品的極化特性。

偏振調(diào)控的CARS 早在2001年由CHENG J X 等用于顯微成像［57］，其原理如圖5所示，對(duì)于沿z軸傳播且滿足共振條件的泵浦和斯托克斯光，調(diào)控泵浦光沿x軸線偏振，斯托克斯光偏振方向與x軸夾角為φ。兩束光和樣品分子作用發(fā)生三階非線性極化效應(yīng)，產(chǎn)生共振和非共振信號(hào)PR、PNR，共振和非共振部分的偏振退化率不同，因而PR、PNR的方向不一致。只要在垂直于非共振信號(hào)的偏振方向上加上檢偏器，即可有效抑制非共振背景，但是同時(shí)也會(huì)損失一部分共振信號(hào)。

圖5 偏振CARS 抑制非共振背景原理圖［57］Fig.5 Schematic diagram of polarization CARS suppressing non-resonant background［57］

對(duì)入射光場(chǎng)的偏振調(diào)控可以有助于獲取樣品的極化取向等信息，因?yàn)閷?duì)于化學(xué)鍵取向有序的分子，CRS 信號(hào)將被極化的激發(fā)光大大加強(qiáng)。利用這一想法，CHENG J X 等在2003年設(shè)計(jì)了偏振CARS 顯微鏡，觀察到水分子氫氧鍵在磷脂雙層膜表面的有序取向［58］，同年，CHENG J X 等利用碳?xì)滏I的伸縮振動(dòng)模式獲取了組成膜的脂質(zhì)分子的方向信息［59］。2009年，LU F 等報(bào)道了一種激發(fā)光為徑向偏振的CARS 顯微鏡［60］，實(shí)驗(yàn)觀察到，在高數(shù)值孔徑物鏡的緊聚焦下，分子沿縱向的CARS 信號(hào)強(qiáng)度約為線偏振情況下的三倍，且橫向分辨率可提高約10%。研究人員還研發(fā)了旋轉(zhuǎn)偏振的CARS 和SRS 顯微鏡，用于顯示大視野范圍內(nèi)全局的偏振極化信息［61-62］。近年來(lái)還有工作表明運(yùn)用圓偏振的激發(fā)光可以獲得樣品分子的對(duì)稱(chēng)性信息，這項(xiàng)工作在實(shí)現(xiàn)化學(xué)特異性成像的同時(shí)引入了對(duì)稱(chēng)分辨對(duì)比度，可以對(duì)一些晶體和具有特殊對(duì)稱(chēng)性的細(xì)胞進(jìn)行成像［63］。

3.3 相位調(diào)控

相位調(diào)控是光場(chǎng)調(diào)控的重要手段之一，其內(nèi)涵包括入射光場(chǎng)相位模式的變換和延遲，也包括信號(hào)光場(chǎng)的相位處理，同時(shí)新型的相位模式也會(huì)帶來(lái)成像效果的提升。

早期的相位調(diào)控手段常與外差探測(cè)結(jié)合，用于抑制非共振背景。能起到相同作用的偏振檢測(cè)、時(shí)間分辨等方法雖然可以抑制非共振背景，但這些技術(shù)也會(huì)削弱共振信號(hào)的貢獻(xiàn)，因此不太適合于微弱信號(hào)的檢測(cè)。得益于外差法原理上可以放大微弱信號(hào)，外差探測(cè)不僅不會(huì)削弱信號(hào)，而且很適合在很強(qiáng)的背景中提取低濃度樣品的CRS 信息，也尤其適用于拉曼指紋區(qū)的成像［64］。

自2004年后，EVANS C L 等提出并發(fā)展了外差法的CARS 成像技術(shù)，他們把CARS 顯微鏡的架構(gòu)與馬赫-曾德?tīng)柛缮鎯x集成，皮秒的泵浦光束和斯托克斯光束共線合束后，送入馬赫-曾德?tīng)柛缮鎯x。其第一路用于在反斯托克斯頻率產(chǎn)生強(qiáng)的本振光（local oscillator），并用相位調(diào)制器對(duì)本振光束進(jìn)行10 MHz 的調(diào)制。干涉儀另一路包括一個(gè)壓電控制臺(tái)，用于精確調(diào)節(jié)兩臂之間的路徑差。本振光與泵浦光和斯托克斯光合束后直接進(jìn)入顯微鏡。在樣本中，生成的CARS 場(chǎng)直接與本振場(chǎng)混合。通過(guò)移動(dòng)相位，可以解算實(shí)部與虛部的分量［65］。如果調(diào)節(jié)本振場(chǎng)與CARS 場(chǎng)相位差為90°，結(jié)合鎖相放大器可以有效提取共振虛部分量，抑制實(shí)部非共振背景［66］。2006年，單光束的外差CARS 在寬帶的飛秒激光器上也得以實(shí)現(xiàn)，該方法結(jié)合空間光調(diào)制器和飛秒脈沖整形，光路上更加靈活［67］。2008年，對(duì)于斯托克斯光束做相位調(diào)控的CARS 顯微鏡也被提出用于提高成像信噪比［68］。

與上述利用本振光實(shí)現(xiàn)外差探測(cè)類(lèi)似，利用和CARS 光場(chǎng)頻率一致的參考光場(chǎng)可以記錄CARS 光場(chǎng)的全息。2010年，SHI K 等提出了一種非掃描的寬場(chǎng)CARS 全息術(shù)［69］，由于光學(xué)參量振蕩器可以產(chǎn)生與CARS信號(hào)同頻的光束，以此作為參考光，可以記錄CARS 場(chǎng)全息，進(jìn)而獲得CARS 光場(chǎng)的振幅和相位信息。2015年，LV Yonggang 等在此基礎(chǔ)上提出了一種不含非共振背景的CARS 全息振動(dòng)相位成像技術(shù)［70］，實(shí)現(xiàn)了對(duì)CARS 場(chǎng)虛部共振信息的有效提取。

近年來(lái)，特殊的相位調(diào)控以及脈沖整形技術(shù)也被運(yùn)用到CRS 成像上，通常使用空間光調(diào)制器或一些特殊光學(xué)元件實(shí)現(xiàn)。2018年，GONG L 等在空間光調(diào)制器上加載形狀為同心圓環(huán)的相位圖案，并將其應(yīng)用于泵浦光，可以縮小其焦點(diǎn)光斑，該實(shí)驗(yàn)演示了提高橫向分辨率和軸向分辨率的成像效果［71］。2020年，HOFER M 等借助空間光調(diào)制器做波前整形，賦予了CARS 光束經(jīng)過(guò)散射介質(zhì)深層聚焦的能力［72］。利用特殊光學(xué)元件做相位調(diào)控如相位板可以實(shí)現(xiàn)分辨率的提高［73］。而利用角錐鏡則可以生成貝塞爾光束，因?yàn)樨惾麪柟馐哂锌股⑸浜妥杂芰?，所以特別適合用作高散射和體樣品的CRS 成像［74-76］。2017年，CHEN X等用貝塞爾光束實(shí)現(xiàn)了SRS 投影層析［77］，運(yùn)用旋轉(zhuǎn)樣品的方案實(shí)現(xiàn)了150 μm×150 μm×150 μm 的三維成像，分辨率約為0.83 μm，見(jiàn)圖6。

圖6 對(duì)入射光進(jìn)行角錐相位調(diào)控，生成貝塞爾光束［77］Fig.6 Bessel beam generation by applying an axicon phase to the incident light field［77］

3.4 空間頻率調(diào)控

調(diào)控光場(chǎng)空間頻率可以為CRS 成像的分辨率提升提供新的思路。這一想法源于寬場(chǎng)熒光的結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（Structured Illumination Microscopy，SIM），其原理是已知空間頻率的激發(fā)光照明樣品，可以把原來(lái)無(wú)法探測(cè)的高頻信息轉(zhuǎn)化為能探測(cè)的低頻信息，其中激發(fā)光的空間頻率通常采用正弦強(qiáng)度調(diào)制。基于此，2014年P(guān)ARK J H 等提出了SIM-CARS 的理論架構(gòu)［78］。泵浦光經(jīng)SLM 調(diào)制產(chǎn)生的±1 級(jí)衍射光在樣品平面產(chǎn)生干涉條紋，作為結(jié)構(gòu)光照明，在斯托克斯光相向照射到樣品時(shí)，理論計(jì)算得到CARS 圖像分辨率將提升至原來(lái)的三倍。

近年來(lái)，在CRS 研究中，部分研究者通過(guò)調(diào)制空間頻率編碼時(shí)空信息，實(shí)現(xiàn)了靈活快速的光譜采集和顯微成像。2015年，LIAO C S 等設(shè)計(jì)了一種頻率復(fù)用的微秒級(jí)光譜成像方案［79］。泵浦激光器的每一個(gè)特定波長(zhǎng)都被調(diào)制成特定的兆赫頻率。通過(guò)SRG 過(guò)程，調(diào)制頻率轉(zhuǎn)移到斯托克斯光束中。利用面探測(cè)器在時(shí)域記錄斯托克斯光強(qiáng)時(shí)間軌跡，并進(jìn)行快速傅里葉變換可獲得SRS 光譜。該方法把單張光譜采集速度提升至60 μs。2020年，HEUKE S 等用空間頻率調(diào)控的聚焦線對(duì)樣品進(jìn)行線照明，聚焦線上的空間頻率隨時(shí)間在不斷變化，該頻率調(diào)制編碼了一維線上的空間位置信息［80］。使用單像素探測(cè)器即可獲得一維CARS 信號(hào)強(qiáng)度輪廓，結(jié)合樣品移動(dòng)可以獲得二維圖像采集。該方法相比于掃描式的CARS 成像具有較好的信噪比和更快的成像速度。2021年，同樣的空間頻率調(diào)控思路被應(yīng)用到SRS 成像上并以此對(duì)樣品z向不同深度進(jìn)行編碼［81-83］，在這項(xiàng)研究中，樣品z方向上的激發(fā)光場(chǎng)以一定的空間頻率分布，且該分布頻率隨時(shí)間變化，這一變化的空間頻率由加載在SLM 上的特殊角錐相位產(chǎn)生，見(jiàn)圖7。面探測(cè)器上接收的信號(hào)時(shí)間序列經(jīng)過(guò)傅里葉變換可以反映出樣品不同深度的SRS 信號(hào)，結(jié)合二維振鏡橫向掃描即可完成SRS 三維層析成像。這項(xiàng)工作一方面不需要z向的掃描，成像速度上略有提高；另一方面運(yùn)用角錐相位產(chǎn)生的貝塞爾光束，使成像深度相較于普通SRS 成像至少提高了兩倍。

圖7 SLM 上動(dòng)態(tài)加載的相位圖可以有效調(diào)控泵浦光在樣品處z 方向的空間頻率，從而編碼深度信息［81］Fig.7 The phase pattern on the SLM can dynamically control the spatial frequency of the pump light along z direction of the sample，thereby encoding depth information［81］

4 結(jié)論

相干拉曼散射光譜和成像應(yīng)用依賴(lài)于多個(gè)光子的非線性光學(xué)過(guò)程，極大地豐富了光場(chǎng)調(diào)控手段。同時(shí)從光場(chǎng)的一個(gè)維度到多個(gè)維度、從單一的調(diào)控方法到充分調(diào)動(dòng)頻率、相位、偏振等多種手段相結(jié)合，逐漸成為新的研究趨勢(shì)。以超分辨相干拉曼成像中的焦斑調(diào)控為例，既可以與STED、SIM 等波前調(diào)控思路相結(jié)合，也有利用相位調(diào)控產(chǎn)生貝塞爾光束提高深層分辨率的應(yīng)用，最新研究表明，結(jié)合新型探針可以可逆地實(shí)現(xiàn)相干拉曼成像的“開(kāi)-關(guān)”狀態(tài)切換［82］，這與傳統(tǒng)超分辨成像在深層機(jī)理上是相通的。另一方面在基礎(chǔ)科學(xué)的驅(qū)動(dòng)下，新型光場(chǎng)調(diào)控方法不斷涌現(xiàn)，使得突破傳統(tǒng)信噪比、降低光毒性成為可能，賦予相干拉曼應(yīng)用新的內(nèi)涵［83］。在面對(duì)化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)實(shí)際應(yīng)用提出新挑戰(zhàn)時(shí)，依托各種靈活的光場(chǎng)調(diào)控技術(shù)，相干拉曼散射光譜與成像應(yīng)用正向著高時(shí)空分辨率、高光譜分辨率、高穿透深度和高靈敏度逐步推進(jìn)。