陳成龍，劉蘭玲，史繼童，顏培正，李佳，趙東升

（山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355）

糖尿病（diabetes mellitus,DM）是一種伴隨因胰島 素分泌缺陷或生物作用受損引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)代謝紊亂的異質(zhì)性疾病[1]，屬于中醫(yī)“消渴”、“消癉”和“三消”范疇[2]。中國糖尿病患者總數(shù)高居世界第一，大約11%的人患有糖尿病[3,4]。中藥由于毒性低、副作用小等特點(diǎn)在治療糖尿病方面有著不可替代的優(yōu)勢。

馬齒莧（Purslane oleracea,PO），味酸，對“消渴”病的病機(jī)陰虛燥熱具有清熱解毒、益氣生津及散血消腫的作用[5]。枳椇（Hovenia dulcis,HD），味甘、酸，具有清熱生津、止渴除煩等作用[6]。性味及功能主治提示兩味藥均可治療糖尿病，并已有研究報(bào)道證實(shí)[7-9]，但其物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在機(jī)制的異同點(diǎn)尚未得到闡釋。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)與多向藥理學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)上提出的一種新方法學(xué)科，并已在中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究中廣泛應(yīng)用[10,11]?；诖耍覀兝镁W(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)研究馬齒莧、枳椇治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制差異，為進(jìn)一步深入研究開發(fā)和利用藥食同源中藥治療糖尿病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 PO與HD成分靶標(biāo)匯總

采用ETCM（http://www.tcmip.cn/）、TCMSP（https://tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫收集PO與HD成分。利用Discovery Studio 2016對符合Lipinski規(guī)則的化合物進(jìn)行藥代動力學(xué)評價(jià)：人類腸道吸收性（HIA）為0或1為優(yōu)；水溶解度（AS）為3或4。Lipinski規(guī)則為分子量（MW）小于500，氫鍵供體（Hdon）數(shù)目小于5，氫鍵受體（Hacc）數(shù)目小于10，脂水分配系數(shù)（AlogP）小于5，可旋轉(zhuǎn)鍵（RK）的數(shù)量不超過10。

利用SwissTarget Prediction服務(wù)器預(yù)測PO與HD成分靶標(biāo)，UniProt校正名稱。以probability＞0為標(biāo)準(zhǔn)收集有效靶點(diǎn)。

1.2 DM基因匯總

以“Diabetes”、“Diabetes Mellitus”為關(guān)鍵詞分別在DisGeNET（https://www.disgenet.org/）、Genecards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫檢索疾病基因，并以score＞0.5（DisGeNET）和score＞50（Genecards）為標(biāo)準(zhǔn)篩選有效基因。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建

采用Venny2.1繪制韋恩圖獲取PO、HD治療DM共有靶點(diǎn)與特有靶點(diǎn)。運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PO與HD調(diào)控DM共有靶點(diǎn)和特有靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。Cytoscape3.7.0軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)可視化。

1.4 構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

將PO與HD防治DM的共有和特有靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape3.7.0，構(gòu)建“中藥成分靶點(diǎn)疾病”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 靶點(diǎn)生物功能注釋

使用R4.0.3軟件，利用Bioconductor（https://www.bioconductor.org/）的org.Hs.eg.db，colorspace，stringi，DOSE，clusterProfile，pathview，ggplot2和limma等程集包，對篩選的共有和特有靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路分析（校正P＜0.05）。

2 結(jié)果

2.1 基礎(chǔ)信息匯總

通過檢索數(shù)據(jù)庫得到PO、HD成分分別為58個(gè)、45個(gè)，經(jīng)篩選獲得PO、HD成分分別為24個(gè)、19個(gè)（表1），共有成分為芹菜素（apigenin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和楊梅素（myricetin）。Swiss Target Prediction預(yù)測靶點(diǎn)數(shù)目分別為395個(gè)、367個(gè)，數(shù)據(jù)庫匯總DM基因856個(gè)。將化合物靶點(diǎn)與DM相關(guān)基因取交集，得到PO、HD治療DM的特有靶點(diǎn)分別為42個(gè)、34個(gè)，共有靶點(diǎn)66個(gè)（圖1）。

圖1 交集靶點(diǎn)韋恩圖Fig.1 Intersection targets from the Venn diagram

表1 成分基本信息Table 1 The basic information of components

續(xù)表

2.2 關(guān)鍵成分篩選

建立“中藥成分靶點(diǎn)疾病”網(wǎng)絡(luò)（圖2），包含182個(gè)節(jié)點(diǎn)和712條相互關(guān)系，平均每個(gè)化合物連接14個(gè)靶點(diǎn)。通過分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)湫再|(zhì)，得到網(wǎng)絡(luò)中起到樞紐作用的化合物。PO中度值較大的成分為5,7-dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)chroman-4-one、芥子酸（sinapic acid）、木犀草素（luteolin）、咖啡酸（caffeic acid）和HD中為柚皮素（naringenin），共有成分為芹菜素（apigenin）、槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和楊梅素（myricetin），見表2。

圖2 “中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)Fig.2 The network of"Herb-Component-Target-Disease"

表2 關(guān)鍵成分排名（前10）Table 2 The rank of key components(Top 10)

2.3 關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

Cytoscape3.7.0構(gòu)建藥材干預(yù)DM的主要作用靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)。共有靶點(diǎn)度值排名靠前的為AKT1（44）、EGFR（33）、PTGS2（31）、ESR1（30）、STAT3（26）、CXCL8（27）、PPARG（23）、PIK3CA（21）、IGF1R（19）和SERPINE1（17）（圖3 C），在二者防治DM的過程中占主要地位。PO特有靶點(diǎn)排名靠前的為GAPDH（20）、MAPK8（19）、MAPK1（19）和TLR4（10）（圖3 A），而HD為VEGFA（16）、ICAM1（9）、MAPK14（9）和HMOX1（8）（圖3 B）。

圖3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)路Fig.3 The PPI network

2.4 靶點(diǎn)生物功能注釋

2.4.1 共有靶點(diǎn)共有靶點(diǎn)調(diào)控DM涉及1 595條生物過程，與DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控、氧化應(yīng)激反應(yīng)RNA分解代謝過程和DNA代謝過程的調(diào)控等生物過程有關(guān)；涉及134個(gè)細(xì)胞組分，與黏著、細(xì)胞-基底連接等細(xì)胞組分有關(guān)，涉及162個(gè)分子功能，與泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等分子功能有關(guān)（圖4 A）。涉及122條通路，主要有PI3K-Akt、糖尿病心肌病、RAGE（糖尿病并發(fā)癥）、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、cAMP和AMPK等信號通路（圖4 B）。

圖4 共有靶點(diǎn)生物功能注釋Fig.4 The biological function annotation of common targets

2.4.2 PO特有靶點(diǎn)PO特有靶點(diǎn)調(diào)控DM涉及1 432條生物過程，與RNA分解代謝過程和DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控等生物過程有關(guān)；涉及127個(gè)細(xì)胞組分，與黏著、細(xì)胞基底連接等細(xì)胞組分有關(guān)；涉及154個(gè)分子功能，與泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等分子功能有關(guān)（圖5 A）；涉及117條通路，主要有PI3K-Akt、糖尿病心肌病、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、甲狀腺激素、鈣、RAGE（糖尿病并發(fā)癥）、cAMP、AMPK和Ⅱ型糖尿病等信號通路（圖5 B）。

圖5 PO特有靶點(diǎn)生物功能注釋Fig.5 The biological function annotation of PO specific targets

2.4.3 HD特有靶點(diǎn)HD調(diào)控DM涉及547條生物過程，與翻譯后蛋白修飾、蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物組裝等生物過程有關(guān)；涉及43個(gè)細(xì)胞組分，與主軸、黏著等細(xì)胞組分有關(guān)；涉及55個(gè)分子功能，與泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合等分子功能有關(guān)（圖6 A）；涉及11條通路，有PI3K-Akt、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、Ras、Rap1、MAPK和RAGE（糖尿病并發(fā)癥）等信號通路（圖6 B）。

圖6 HD特有靶點(diǎn)生物功能注釋Fig.6 The biological function annotation of HD specific targets

3 討論

《千金要方·食治篇》記載：“知其所犯，以食治之，食療不愈，然后命藥”，且藥食同源治療DM能夠平衡各個(gè)器官功能，有效控制血糖和預(yù)防糖尿病并發(fā)癥[12]。馬齒莧、枳椇被收載于《國家藥食同源目錄》，藥用和食用歷史悠久。因此，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)對二者治療糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制進(jìn)行對比，并分析其異同點(diǎn)。

“中藥成分靶點(diǎn)疾病”網(wǎng)絡(luò)顯示，PO、HD防治糖尿病的物質(zhì)基礎(chǔ)既存在共同點(diǎn)又具有明顯差異。PO與HD共同通過槲皮素、楊梅素等防治DM，此外，PO中的木犀草素、咖啡酸和芥子酸與HD中的柚皮素在防治DM過程中起到非常重要的作用。槲皮素能增加MAPK表達(dá)水平而減輕大鼠外周胰島素抵抗[13]。木犀草素通過抑制大鼠胰腺TLR4表達(dá)改善胰島素抵抗作用[14]。柚皮素能激活A(yù)MPK/Nrf2/HO-1信號通路，增強(qiáng)抗氧化反應(yīng)，減輕糖尿病小鼠心肌損傷[15]。

分析PPI網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，PO與HD共有靶點(diǎn)度值排名靠前的靶點(diǎn)居多，有AKT1、PPARG、PIK3CA和SERPINE1等，說明兩者除共有成分外，二者的特有成分也能通過作用共同靶點(diǎn)來發(fā)揮療效。分析兩味藥材的特有靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)HD涉及靶點(diǎn)數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)少于PO，說明PO發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)更廣，干預(yù)的靶點(diǎn)與通路更多。富集分析結(jié)果顯示HD和PO集中在糖尿病并發(fā)癥、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、PI3K-Akt、cAMP和AMPK等信號通路。胰島素通過激活PI3K/AKT信號通路，調(diào)節(jié)血脂和葡萄糖代謝平衡[16]。PPARG的激活使機(jī)體外周組織對胰島素的敏感性增加，抑制肝臟糖異生，脂肪組織脂肪酸分解抑制、合成增加等[17]。PO特異地作用于甲狀腺激素、鈣和Ⅱ型糖尿病等信號通路，HD特異地作用于Ras、MAPK信號通路。胞內(nèi)Ca2+濃度升高觸發(fā)胰腺 細(xì)胞分泌胰島素，Ca2+通道和活性的改變對胞內(nèi)鈣濃度及胰島素的分泌都起到關(guān)鍵作用[18]。藥物干預(yù)cAMP信號通路可增加電活動和Ca2+信號，此外，cAMP還有助于胰島素合成、細(xì)胞分化和增殖[19]。

本研究通過共有成分和特有成分的靶點(diǎn)分析，闡釋了PO、HD在防治DM方面的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在作用機(jī)制差異，為進(jìn)一步研究開發(fā)和利用馬齒莧、枳椇資源提供參考，也為深入揭示藥食同源中藥的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。