劉雨露, 朱子貴, 張建新, 趙 紅, 姚平波

缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)是指組織器官缺血一定時間后恢復(fù)血流灌注時，缺血組織損傷加重的現(xiàn)象，多發(fā)于冠狀動脈旁路移植術(shù)、溶栓治療、心臟直視手術(shù)等血流供應(yīng)恢復(fù)過程中[1]。目前，I/R損傷主要采用抗氧化、抗炎、鈣通道阻滯劑、血管活性藥物等治療，尚缺乏治療的特效藥物[2]。miR-346屬于miRNA家族，在心血管疾病、惡性腫瘤等多種疾病中均出現(xiàn)差異表達[3-4]。近年來研究顯示，miR-346可以調(diào)控凋亡相關(guān)基因的表達，調(diào)節(jié)心肌I/R損傷參與心肌I/R損傷大鼠的心肌細胞凋亡[5]，但相關(guān)研究報道較少，且其對心臟功能的影響及作用的具體方式尚不明確。該研究分析了miR-346過表達對I/R大鼠氧化應(yīng)激和心肌組織細胞凋亡的作用，旨在為臨床新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑與儀器miR-346 ago和陰性對照miR-NC重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，RVVA)由上海漢恒生物技術(shù)有限公司設(shè)計和合成；肌酸激酶同工酶(creatine kinase MB，CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin，Mb)、心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、超氧化物歧化酶(superoxde dismutase，SOD)、乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathion peroxidase，GSH-Px)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒，均購自南京森貝伽生物科技有限公司；TUNEL組織細胞凋亡檢測試劑盒，購自深圳市拓普生物科技有限公司；兔抗鼠B細胞淋巴瘤/白血病(B-cell lymphoma/leukemia，Bcl)-2基因、Bcl相關(guān)蛋白(Bcl-associate X protein，Bax)、半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3，Cas-3)、cleaved Cas-3、Cas-9、cleaved Cas-9、β-actin單克隆抗體和辣根過氧化酶(horseradish peroxidase，HRP)標記的二抗均購于美國CST公司；BX60型光學(xué)顯微鏡購自日本OLYMPUS公司；Vivid 7.0彩色超聲儀購自美國GE公司；FPMOUS-ECGenie小動物心電圖監(jiān)測儀購自孚光精儀(中國)有限公司；RT-PCR儀(IQTM5型)購自美國Bio-Rad公司；AlphaImager HP凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Alpha Innotech公司。

1.2 實驗動物SPF級SD雄性大鼠48只，6～8周齡，體質(zhì)量為260～280 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2017-0022，飼養(yǎng)于南華大學(xué)動物中心實驗室，許可證號：SYXK(湘) 2020-0002。研究經(jīng)動物實驗倫理委員會審核批準，動物實驗倫理批號為NHDXFSNHYY20200603。

1.3 動物分組與miR-346過表達48只大鼠預(yù)飼養(yǎng)7 d后，采用簡單隨機分組將其隨機分為對照組、I/R組、I/R+agomiR-NC組和I/R+agomiR-346組，12只/組。I/R+agomiR-NC組經(jīng)尾靜脈注射RAAV-miR-NC，I/R+agomiR-346組經(jīng)尾靜脈注射RAAV-miR-346，1次/d，連續(xù)注射2周。對照組和I/R組經(jīng)尾靜脈注射等體積0.9%NaCl溶液，連續(xù)注射2周。

1.4 動物造模末次干預(yù)后，除對照組外所有大鼠均采用參考已有文獻復(fù)制心肌I/R模型[6]，常規(guī)麻醉，結(jié)扎左冠狀動脈前降支，缺血30 min后，恢復(fù)血流灌注120 min。對照組只插入線栓，不結(jié)扎。

1.5 心功能檢測和標本采集再灌注120 min后，使用小動物心電圖監(jiān)測儀檢測大鼠心率(heart rate，HR)，彩色超聲儀檢測大鼠左心室射血分數(shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、短軸縮短率(fractional shortening，F(xiàn)S)和左心室壁厚度(left ventricular wall thickness，LVWT)。檢測后，常規(guī)麻醉，分離腹主動脈血液，離心(3 000 r/min，10 min)，取血清，暫存于-20 ℃冰箱保存，分離心臟，一部分置于4%多聚甲醛中固定，另一部分暫存于-80 ℃冰箱保存。

1.6 RT-PCR檢測心肌組織miR-346水平取暫存于-80 ℃冰箱的心肌組織，勻漿后，根據(jù)試劑盒操作說明，依次進行總RNA提取，確定RNA純度和濃度，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，上機進行RT-PCR反應(yīng)。miR-346上游引物為5′-GAGTGCCTGCCTCTCTGTTG-3′，下游引物為5′-GAGCAGCTCTGCCCAGG-3′，以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法檢測各基因的相對表達量。

1.7 HE染色檢測心肌組織損傷取甲醛固定的大鼠心肌組織，進行常規(guī)的切片制作和HE染色，另一份進行TUNEL染色，嚴格按照試劑盒說明操作，光鏡下觀察心肌組織病理變化，參考已有文獻[5]評估心肌組織病理積分。

1.8 血清和心肌組織中相關(guān)因子的測定免疫標記法檢測血清CK-MB、Mb、LDH、cTnI水平，ELISA法檢測心肌組織SOD、GSH-Px和MDA水平，嚴格按試劑盒說明書進行測定。

1.9 TUNEL檢測心肌組織細胞凋亡取甲醛固定的大鼠心肌組織，嚴格按照試劑盒說明進行切片制作和TUNEL染色，光鏡下觀察心肌組織細胞凋亡。

1.10 Western blot檢測心肌組織Bax/Bcl-2、Cas-3和Cas-9表達取暫存于-80 ℃冰箱的心肌組織，勻漿后，提取總蛋白，進行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加一抗(Bax、Bcl-2、Cas-3和Cas-9，稀釋比例均為1 ∶500)，4 ℃孵育過夜，加HRP標記的二抗，室溫孵育2 h，顯影，以β-actin為內(nèi)參分析對比條帶強弱。

2 結(jié)果

2.1 各組I/R大鼠心肌組織miR-346水平I/R+agomiR-346組大鼠心肌組織miR-346水平高于I/R+agomiR-NC組(q值=13.352，P<0.05)，I/R組心肌組織miR-346水平低于對照組(q值=15.796，P<0.05)，I/R+agomiR-NC組與I/R組心肌組織miR-346水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。

圖1 各組I/R大鼠心肌組織miR-346水平A：對照組；B：I/R組；C：I/R+agomiR-NC組；D：I/R+agomiR-346組；與對照組比較：*P<0.05；與I/R+agomiR-NC組比較：#P<0.05

2.2 miR-346過表達對I/R大鼠心功能的影響I/R+agomiR-346組大鼠HR、LVEF、FS和LVWT高于I/R+agomiR-NC組(P<0.05)，I/R組大鼠HR、LVEF、FS和LVWT低于對照組(P<0.05)，I/R+agomiR-NC組與I/R組大鼠HR、LVEF、FS和LVWT差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組I/R大鼠心功能

2.3 miR-346過表達對I/R大鼠心肌組織損傷的影響對照組I/R大鼠HE染色顯示心肌組織細胞未見異常；I/R組和I/R+agomiR-NC組顯示心肌纖維斷裂，細胞出現(xiàn)變性、壞死，且伴隨大量炎性細胞浸潤；I/R+agomiR-346組顯示心肌組織細胞病理變化減輕。見圖2。

圖2 各組I/R大鼠心肌組織病理變化 HE×200A：對照組；B：I/R組；C：I/R+agomiR-NC組；D：I/R+agomiR-346組

2.4 miR-346過表達對I/R大鼠心肌組織損傷標志物的影響I/R+agomiR-346組大鼠血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平低于I/R+agomiR-NC組(P<0.05)，I/R組血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平高于對照組(P<0.05)，I/R+agomiR-NC組與I/R組大鼠血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

表2 各組I/R大鼠心肌組織損傷標志物水平

2.5 miR-346過表達對I/R大鼠氧化應(yīng)激的影響I/R+agomiR-346組大鼠心肌組織MDA水平低于I/R+agomiR-NC組，SOD和GSH-px水平高于I/R+agomiR-NC組(P<0.05)；I/R組心肌組織MDA水平高于I/R+agomiR-NC組，SOD和GSH-px水平低于I/R+agomiR-NC組(P<0.05)；I/R+agomiR-NC組與I/R組心肌組織MDA、SOD和GSH-px水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

表3 各組I/R大鼠氧化應(yīng)激水平

2.6 miR-346過表達對I/R大鼠心肌組織細胞凋亡的影響I/R+agomiR-346組大鼠心肌組織細胞凋亡率低于I/R+agomiR-NC組[ (18.22±3.76)%vs(27.93±5.48)%，q=7.858，P<0.05]，I/R組大鼠心肌組織細胞凋亡率高于對照組[(28.33±5.21)%vs(7.22±1.41)%，q=17.083，P<0.05]，I/R+agomiR-NC組與I/R組心肌組織細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

圖3 各組I/R大鼠心肌組織細胞凋亡 TUNEL×200A：對照組；B：I/R組；C：I/R+agomiR-NC組；D：I/R+agomiR-346組

2.7 miR-346過表達對I/R大鼠心肌組織Bax/Bcl-2、Cas-3和Cas-9表達的影響I/R+agomiR-346組大鼠心肌組織Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表達低于I/R+agomiR-NC組(q=21.324、14.596、9.872；P<0.05)，I/R組心肌組織Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表達高于對照組(q值=19.681、13.243、8.570；P<0.05)，I/R+agomiR-NC組與I/R組心肌組織Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖4。

圖4 各組I/R大鼠心肌組織Bax/Bcl-2、Cas-3和Cas-9表達A：對照組；B：I/R組；C：I/R+agomiR-NC組；D：I/R+agomiR-346組；與對照組比較：*P<0.05；與I/R組比較：#P<0.05

3 討論

I/R損傷是組織缺血后，恢復(fù)血流供應(yīng)時組織損傷加重的病理過程，與缺血低氧刺激生成的大量氧自由基，及其引起的心肌細胞能量代謝障礙、細胞凋亡等有關(guān)，嚴重影響了組織缺血后的恢復(fù)；臨床尚缺乏治療其特效藥物。miR-346是近年來研究中發(fā)現(xiàn)的與多種疾病相關(guān)的小RNA，可以靶向調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bax表達，抑制心肌細胞凋亡。該研究探討了miR-346在心肌I/R大鼠中的表達和作用，結(jié)果顯示I/R大鼠心肌組織中miR-346表達較對照組降低，說明miR-346可能參與I/R損傷的病理過程。該研究中，I/R大鼠的HR、LVEF、FS和LVWT較對照組下降，miR-346過表達后，HR、LVEF、FS和LVWT升高，表明miR-346過表達可以改善I/R大鼠的心功能。該研究表明，I/R大鼠血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平相較于對照組升高，且心肌組織表現(xiàn)出病理變化，而miR-346過表達后，血清CK-MB、LDH、Mb和cTnI水平下降，心肌組織病理變化減輕。CK-MB、LDH、Mb、cTnI均為臨床較為常用的指標，廣泛存在于心肌組織細胞中，在細胞受損時可以釋放進入血清，其在血清中的水平變化可以反映心肌細胞損傷。研究結(jié)果表明，miR-346過表達可以減輕心肌I/R大鼠的心肌組織損傷，改善心功能，有望成為I/R治療的新靶點。

該研究表明，I/R大鼠的心肌組織MDA水平較對照組升高，SOD和GSH-px較對照組下降，而miR-346過表達后，MDA下降，SOD和GSH-px升高。SOD是生物體內(nèi)最主要的抗氧化酶之一，廣泛分布于心肌細胞質(zhì)內(nèi)，可以通過氧化還原反應(yīng)，抑制多種過氧化物的作用，清除體內(nèi)過多的活性氧自由基(reactive oxide species，ROS)并將其轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)[7]。GSH-px是廣泛分布于心肌組織細胞的過氧化物分解酶，可以抑制ROS產(chǎn)生，降低心肌細胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平[8]。MDA是ROS代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，是臨床常用的反映心肌細胞氧化應(yīng)激水平的指標[9]。既往多項研究[10-11]顯示，I/R過程中產(chǎn)生的大量ROS是導(dǎo)致心肌組織細胞死亡，導(dǎo)致I/R損傷的主要因素。上述研究表明miR-346過表達可能通過抗氧化作用，清除過量的ROS，減輕I/R大鼠的心肌組織損傷。

該研究表明，I/R大鼠的心肌組織Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表達較對照組升高，細胞凋亡率升高，而miR-346過表達后，Bax/Bcl-2、cleaved Cas-3/Cas-3和cleaved Cas-9/Cas-9蛋白表達下降，細胞凋亡率下降。Bcl-2/Bax是一組可以調(diào)控細胞凋亡的蛋白，生理狀態(tài)下，Bcl-2定位于線粒體膜表面，Bax主要位于胞質(zhì)中，在凋亡信號作用下，Bax可以與Bcl-2相結(jié)合，在線粒體膜上形成孔道，破壞膜完整性，使線粒體釋放細胞色素C入胞質(zhì)，激活Caspase凋亡級聯(lián)反應(yīng)[12]。Caspase家族是調(diào)控內(nèi)源性細胞凋亡的蛋白酶系統(tǒng)，其中cleaved Cas-9為始動因子，cleaved Cas-3為凋亡效應(yīng)因子，胞漿中的細胞色素C可以與相應(yīng)的蛋白結(jié)合，激活Cas-9，從而激活Cas-3，啟動細胞凋亡程序，降解多種重要蛋白，導(dǎo)致細胞裂解死亡[13]。該研究結(jié)果表明，miR-346過表達可以抑制線粒體凋亡途徑，抑制I/R大鼠心肌細胞凋亡，減輕心肌組織損傷。既往研究[14]顯示，I/R過程中產(chǎn)生的大量ROS可以激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)心肌組織細胞死亡，導(dǎo)致I/R損傷。該研究結(jié)果表明，miR-346過表達可能通過抗氧化作用，抑制心肌細胞凋亡，降低I/R大鼠的心肌組織損傷。