徐海月，李澤顥，韓永琪，王立國，方 芳

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是一種惡性腫瘤，是全世界男性癌癥死亡的主要原因之一[1]。PCa多發(fā)生于55 歲以上男性患者，高脂飲食、炎癥、性激素失衡等是導致其發(fā)生的危險因素，這些因素與氧化應激密切相關?；钚匝踝杂苫?reactive oxygen species, ROS)是氧化應激反應中產(chǎn)生的一種最為重要的氧化性介質(zhì)。一定水平的 ROS 有助于機體抵御感染等引起的炎癥反應、促進細胞增殖等作用；而過量的ROS可能對細胞造成不同程度的氧化性損傷[2]。因此，調(diào)節(jié)腫瘤氧化應激的分子對腫瘤的治療至關重要。

分化簇(CD)147(CD147)，是一種屬于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，在PCa等惡性腫瘤中表達增高[3-5]。研究[6]表明，在黑色素瘤細胞中刪除CD147的表達使細胞對過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導的氧化應激更為敏感。然而CD147對調(diào)節(jié)PCa細胞氧化應激作用尚不清楚。該研究旨在探討CD147對PCa細胞氧化應激的調(diào)節(jié)作用，為PCa的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料胰酶、胎牛血和RPMI-1640購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒購自北京博奧森公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒購自美國Sigma公司；RNA提取試劑盒購自北京索萊寶公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量 PCR 試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；PCR引物由庫美公司合成；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)試劑盒購自南京建成生物科技有限公司；Nrf2和HO-1 抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；內(nèi)參抗體 β-actin抗體購自美國Gene Tex公司。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 低表達CD147的實驗組LNCaP細胞(LNCaP/shCD147) 和陰性對照組LNCaP細胞(LNCaP/Scramble)由本實驗室保存[7]。細胞用含10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日換液。

1.2.2RT-qPCR鑒定CD147 mRNA表達 采用有機溶劑抽提法TRlzol法提取細胞總RNA， 定量后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以β-actin為內(nèi)參照， RT-qPCR檢測CD147 mRNA表達量，用基因相對定量法(2-△△Ct)計算結果。β-actin的上游引物序列為5′-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3′，下游引物序列為5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；CD147的上游引物序列為5′- CAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCG-3′，下游引物序列為5′- TGCGAGGAACTCACGAAGAA-3′。

1.2.3流式細胞儀檢測ROS 收集兩組細胞，1 000 r/min離心5 min后吸除上清液，用無菌PBS溶液洗滌2次。細胞內(nèi)ROS水平檢測按照ROS檢測試劑盒說明書進行。即每份樣本細胞中加入1 ml的DCFH-DA稀釋液(無血清DMEM培養(yǎng)液按照1 ∶1 000比例稀釋)，混勻后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育30 min，用PBS洗滌細胞并重復3次，重懸細胞于0.5 ml PBS中，用流式細胞儀進行檢測和分析。

1.2.4SOD、GSH-PX和MDA水平的檢測 收集細胞離心，將各組細胞沉淀用PBS重懸后超聲裂解，離心后取上清進行蛋白含量測定，抗氧化酶(SOD，GSH-PX)活性及MDA含量的檢測嚴格按照試劑盒說明書進行操作，分光光度計測吸光度。

1.2.5CCK-8實驗觀察細胞活力 取對數(shù)期細胞配制成濃度為4×108個/L的單細胞懸液，體積為每孔100 μl，接種于96孔板內(nèi)，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。待細胞貼壁后將培養(yǎng)基吸掉，分別加入終濃度為100、200、400、800 μmol/L的 H2O2稀釋液，同時設立陰性對照組，每組設4個復孔，分別作用2、4 h后，每孔避光加入10 μl CCK-8溶液，待培養(yǎng)液顯色后用酶標儀檢測450 nm吸光度值，以細胞的存活率表示細胞的活力。

1.2.6Western blot 檢測細胞中p-AKT、AKT、Nrf2和HO-1蛋白表達 將兩組細胞用無菌PBS緩沖液清洗3次，再用RIPA細胞裂解液冰上靜置5 min，12 000 r/min 離心5 min，取上清液蛋白定量后加入上樣緩沖液，煮沸5 min，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中每個泳道加入20 μl(含40 μg)的總蛋白電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入兔抗p-AKT、AKT、Nrf2和HO-1抗體(1 ∶500)、β-actin和Histone H3抗體(1 ∶1 000)4 ℃過夜。次日TBST洗膜，分別加入HRP標記的羊抗兔抗體(1 ∶5 000)，室溫避光孵育45 min，TBST洗膜后ECL化學發(fā)光顯影，Image J軟件分析目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 RT-qPCR鑒定H2O2刺激下細胞內(nèi)CD147的表達采用不同濃度的H2O2刺激LNCaP細胞后，CD147的表達逐漸增加(P<0.001)。見圖1。

圖1 H2O2刺激下CD147的表達情況與0 μmol/L組比較：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

2.2 RT-qPCR鑒定細胞CD147的表達結果顯示，與LNCaP/Scramble組細胞CD147表達水平比較，LNCaP/shCD147組CD147的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義(F=64.408，P<0.01)。

2.3 沉默CD147對細胞ROS含量影響流式細胞儀檢測兩組細胞內(nèi)ROS含量，結果顯示陰性對照組LNCaP/Scramble細胞ROS含量為(3.60±0.84)，細胞模型組LNCaP/shCD147細胞內(nèi)ROS水平為(13.23±0.76)，與陰性對照組比較，細胞模型組ROS增高(F=33.825，P<0.01)。見圖2。

圖2 沉默CD147表達對ROS的生成影響

2.4 沉默CD147對SOD、GSH-PX活性和MDA含量影響LNCaP/Scramble組細胞抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性值和MDA的含量分別是(41.563±1.873)、(30.341±1.261)和(2.562±0.264)；LNCaP/shCD147細胞組細胞抗氧化酶SOD、GSH-PX的活性值和MDA的含量分別是(250.755±12.502)、(173.112±14.591)和(3.678±0.398)。與LNCaP/Scramble組相比較，LNCaP/shCD147細胞SOD、GSH-PX的活性降低(F=74.376、48.999，P<0.01)，而細胞上清中MDA的含量升高(F=16.568，P<0.05)。

2.5 沉默CD147對H2O2誘導的細胞損傷的影響CCK-8方法檢測細胞存活率，結果顯示：與LNCaP/Scramble組比較，當400 μmol/L H2O2作用細胞2 h時，LNCaP/shCD147細胞存活率下降(F=8.328，P<0.05)，并且隨著H2O2濃度的升高細胞存活比率越低(F=26.172，P<0.01)。當200 μmol/L H2O2作用LNCaP/shCD147細胞4 h后，細胞存活率下降(F=14.763，P<0.05)，隨著 H2O2濃度的升高LNCaP/shCD147組細胞存活率逐漸下降(F=78.790、151.603，P<0.01)。見圖3。

圖3 沉默CD147對過氧化氫誘導的細胞存活影響A:不同濃度H2O2作用2 h后細胞存活率變化;B：不同濃度H2O2作用4 h后細胞存活率變化；與LNCaP/scramble 組比較：**P<0.01

2.6 CD147通過PI3K/AKT途徑抑制氧化應激實驗結果表明，與對照組LNCaP/Scramble比較，LNCaP/shCD147細胞中Nrf2 和HO-1表達降低(F=38.495、73.597，P<0.01)。與LNCaP/shCD147細胞組比較，采用20 μmol/L PI3K/AKT途徑抑制劑LY294002作用細胞24 h后，LNCaP/shCD147細胞中Nrf2 和HO-1表達進一步降低(F=50.342、47.756，P<0.01)。見圖4。

圖4 沉默CD147促進H2O2作用LNCaP細胞Nrf2和HO-1的表達A:各組Nrf2蛋白表達；B:各組HO-1蛋白表達；1：LNCaP/scramble組;2：LNCaP/shCD147組;3：LNCaP/scramble+LY294002組;4：LNCaP/shCD147+LY294002組；與LNCaP/scramble組比較：**P<0.01；與LNCaP/shCD147組比較：##P<0.01

3 討論

氧化應激在PCa發(fā)生發(fā)展中起重要作用。與PCa旁的正常前列腺組織相比，PCa組織中產(chǎn)生更高水平的內(nèi)源性 ROS，促進腫瘤細胞的增殖和新血管形成等[8]。然而，過量的ROS可引起氧化應激，破壞、氧化脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等導致細胞凋亡和壞死。因此，探討腫瘤細胞在ROS作用下的分子機制，有望為治療腫瘤提供新的線索。

首先通過RT-qPCR的實驗檢測到，選用不同濃度及不同時間點的H2O2作用LNCaP細胞后，CD147表達逐漸升高，這表明CD147可能參與了細胞內(nèi)的氧化應激。接下來利用特異性siRNA干擾技術成功降低了CD147在PCa中的表達，發(fā)現(xiàn)PCa細胞氧化應激水平增高，導致細胞中過多的ROS積累，說明CD147可能具有抑制氧化應激的作用。ROS包括超氧化物陰離子、H2O2、羥基自由基，可刺激細胞引起結構破壞，包括脂質(zhì)過氧化以及DNA和蛋白質(zhì)氧化，破壞人體的氧化還原平衡并改變細胞的正常功能和形態(tài)[9]。在進化過程中，哺乳細胞中產(chǎn)生強大的抗氧化系統(tǒng)，例如SOD、GSH-PX和MDA等。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，通過將超氧化物歧化為普通分子氧來維持機體代謝平衡。GSH-PX是體內(nèi)重要的自由基捕獲酶之一，能減少脂質(zhì)過氧化物的形成，增強機體抗氧化損傷的能力。MDA在受到氧化刺激時會顯著增加，能影響線粒體呼吸鏈復合物及關鍵酶活性并加劇膜的損傷，通過鏈式反應放大活性氧的作用，可反映機體脂質(zhì)過氧化的程度。CD147干擾之后，細胞上清液中MDA含量升高，SOD和GSH-PX的活性降低，說明CD147可能通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的作用使腫瘤細胞處于平衡狀態(tài)。此外，利用H2O2作用細胞建立氧化應激模型表明CD147表達降低后細胞存活下降。實驗結果進一步說明CD147具有對氧化應激的保護作用。

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關因子2(Nrf2)具有重要的抗氧化作用，通過作用抗氧化反應序列元件(ARE)并調(diào)控下游Ⅱ相代謝酶和抗氧化蛋白/酶的信號通路在細胞防御保護中發(fā)揮重要作用。Ⅱ相代謝酶血紅素加氧酶-1(HO-1)是血紅素分解代謝過程中的限速酶，是一種參與抗氧化、抗凋亡和抗炎反應的應激蛋白[10]。實驗結果表明，CD147表達下降后Nrf2和HO-1的水平減少。目前研究[11-12]表明，蛋白激酶 C(PKC)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇 3 激酶(PI3K)、核因子κB(NF-κB)和腺苷活化蛋白激酶(AMPK)途徑等均參與了Nrf2/ARE信號通路的激活及其依賴的基因表達調(diào)控過程。課題組前期研究表明，CD147能夠通過PI3K/AKT途徑抑制PCa細胞自噬，減少自噬性細胞死亡及促進PCa細胞雄激素受體活性的作用[13]，因此推測CD147是否可以通過PI3K/AKT途徑參與調(diào)節(jié)PCa細胞的氧化應激。使用PI3K/AKT途徑抑制劑LY294002作用細胞，結果顯示LY294002能夠使LNCaP/shCD147細胞中Nrf2和HO-1表達進一步降低。