周麗穎，姜姿妍，錢且奇，陳 圳，顧舒文，李 杰，紀(jì) 鵬，高曉建，姜 群，張曉君

(揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009)

中華絨螯蟹()隸屬于甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)弓蟹科(Archaeidae)，是我國(guó)重要的特種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。隨著養(yǎng)殖密度的加大及養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的惡化，由細(xì)菌感染引起的疾病給中華絨螯蟹養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重?fù)p失，如弗氏檸檬酸桿菌()感染可引起中華絨螯蟹“黑鰓病”，擬態(tài)弧菌()感染可導(dǎo)致中華絨螯蟹“腹水病”，點(diǎn)狀產(chǎn)氣單胞菌()感染可引起中華絨螯蟹腸炎等疾病。

豚鼠氣單胞菌()是一種革蘭氏陰性、氧化酶陽(yáng)性的兼性厭氧桿菌，隸屬于氣單胞菌科氣單胞屬。該菌是一種人獸共患病原體，可導(dǎo)致免疫功能正?；虻拖碌娜嘶几鞣N感染并發(fā)癥，如泌尿系統(tǒng)感染、呼吸道感染、膽道感染，嚴(yán)重感染者發(fā)生休克甚至死亡。同時(shí)豚鼠氣單胞菌也是魚類和其他冷血?jiǎng)游锏闹匾≡?，有?bào)道豚鼠氣單胞菌可感染草魚()、南方鲇()、鱸()、羅氏沼蝦()、南美白對(duì)蝦()等多種水生生物并造成大量死亡。2021年江蘇蘇州某養(yǎng)殖場(chǎng)的中華絨螯蟹出現(xiàn)大規(guī)模死亡現(xiàn)象，病蟹主要表現(xiàn)為活力減弱，攝食減少。從瀕死中華絨螯蟹肝胰腺組織中分離到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)細(xì)菌，經(jīng)理化特性和分子鑒定確定其為豚鼠氣單胞菌，本實(shí)驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了致病性、毒力基因檢測(cè)及耐藥性分析，旨在為中華絨螯蟹細(xì)菌性疾病的有效防控提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2020年10月于蘇州地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)取發(fā)病蟹，體重為150～200 g，采樣時(shí)水溫22 ℃，pH 8.0，溶氧為3 mg/L；該養(yǎng)殖場(chǎng)為精養(yǎng)模式，放苗密度為1 000～1 200只/667 m；自7月份開始發(fā)病，累積死亡率達(dá)30%以上。

1.2 細(xì)菌分離

患病蟹經(jīng)生理鹽水沖洗多次后，用75%酒精進(jìn)行蟹體表面消毒，無(wú)菌操作取肝胰腺組織，在LB培養(yǎng)基進(jìn)行接種劃線，28 ℃培養(yǎng)24 h，選擇形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步劃線純化，于30%甘油管中-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 組織病理切片觀察

用波恩氏液固定患病蟹鰓和肝胰腺組織24 h，用70%酒精保存。將組織脫水、透明、打蠟、石蠟包埋后，用切片機(jī)切片(3～6 μm)，然后HE染色，中性樹脂膠密封，用于顯微鏡的觀察。健康蟹鰓和肝胰腺組織為對(duì)照。

1.4 人工感染試驗(yàn)

選取平均體質(zhì)量為(6.00±1.93) g健康蟹360只暫養(yǎng)1周后進(jìn)行人工感染實(shí)驗(yàn)。將分離菌SHZ1接種于普通營(yíng)養(yǎng)肉湯，28 ℃培養(yǎng)過夜后用無(wú)菌生理鹽水將供試菌液稀釋到1.8×10、1.8×10、1.8×10、1.8×10和1.8×10CFU/mL。實(shí)驗(yàn)組于健康中華絨螯蟹第三步足基部注射0.1 mL菌液，對(duì)照組注射等量生理鹽水，每組設(shè)三個(gè)平行。定時(shí)對(duì)中華絨螯蟹的死亡情況進(jìn)行觀察記錄，以引起中華絨螯蟹發(fā)病死亡并能重新分離回收到原感染菌作為分離菌致病性的判定標(biāo)準(zhǔn)，并計(jì)算分離菌對(duì)中華絨螯蟹的半數(shù)致死量(LD)。

1.5 分離菌形態(tài)觀察和理化特性測(cè)定

取分離菌SHZ1進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)將分離菌SHZ1滴于經(jīng)聚醋酸甲基乙烯脂膜包被的銅網(wǎng)上并靜置1 min，用0.5%磷鎢酸水溶液負(fù)染1 min，最后自然干燥后利用Tecnai 12透射電子顯微鏡(Philips，荷蘭) 進(jìn)行拍照觀察。另外將分離菌SHZ1接種于微量生化管(杭州天和微生物試劑有限公司)測(cè)定氧化酶、接觸酶、乳糖、甘露糖、蔗糖等理化指標(biāo)，參照文獻(xiàn)[16]進(jìn)行。

1.6 gyrB基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

通過DNA抽提試劑盒提取分離菌的DNA作為模板，對(duì)菌株基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件參照張曉君等方法進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物交由上海生工測(cè)序。對(duì)分離菌的基因序列通過NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列比對(duì)以及同源性分析，運(yùn)用MEGA 7.0鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.7 病原菌胞外酶活性檢測(cè)

分離菌的胞外蛋白酶活性、卵磷脂酶活性、脂酶活性、DNA酶活性、明膠酶活性采用平板檢驗(yàn)方法。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的分離菌株點(diǎn)種于含有脫脂牛奶(10%)、蛋黃液(10%)、吐溫80(1%)、DNA(0.5%)、明膠(10%)的平板中，于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后觀察。含脫脂牛奶、蛋黃液及吐溫80的平板可以直接觀察水解圈；含DNA的平板則在觀察之前加入1 mol/L的HCl覆蓋平板。透明的水解圈區(qū)域顯示有酶活。含明膠的平板于28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h后，置于4 ℃冰箱中過夜后觀察。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.8 病原菌毒力相關(guān)基因檢測(cè)

選取熱敏蛋白酶()、溶血素()、彈性蛋白酶()、外膜蛋白()、膽固醇?；D(zhuǎn)移酶()以及鞭毛蛋白(、、、)共9個(gè)毒力相關(guān)基因。根據(jù)豚鼠氣單胞菌全基因組序列(GenBank CP016762)，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物(見表1)，由上海生物工程有限公司合成，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系共20 μL:2×Power Taq PCR MasterMix 10 μL，正反引物各0.5 μL(10 μmol/L)，模板DNA 1 μL，無(wú)菌雙蒸水8 μL，并以ddHO替代DNA模板作為空白對(duì)照；擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸7 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，以擴(kuò)增片段的有無(wú)及大小判斷相應(yīng)毒力基因的存在情況。

表1 毒力基因PCR引物Tab.1 Primers of virulence genes for PCR

1.9 耐藥性檢測(cè)

采用紙片擴(kuò)散法(K-B)對(duì)分離菌SHZ1進(jìn)行耐藥性測(cè)定，將分離菌SHZ1的濃度調(diào)整至1.8×10CFU/mL，吸取100 μL菌液涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，將藥敏紙片(購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品)貼于平板上，28 ℃中培養(yǎng)24 h后測(cè)量抑菌圈直徑(mm)。根據(jù)杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品說(shuō)明書：抑菌圈直徑大于等于17 mm為敏感，抑菌圈直徑大于等于14 mm小于17 mm為中介，抑菌圈直徑小于14 mm為耐藥，根據(jù)抑菌圈直徑判定分離菌SHZ1的耐藥性。

2 結(jié)果

2.1 組織病理切片觀察

組織病理切片觀察顯示患病蟹鰓絲腔中的上皮細(xì)胞形成的腔隔膜結(jié)構(gòu)在感染后被破壞。鰓絲柱狀細(xì)胞發(fā)生崩解，導(dǎo)致上皮層解體，鰓腔裸露。鰓小片局部區(qū)域扭曲變形，末端異常膨脹(圖1-a)。

圖1 患病蟹組織病理變化Fig.1 Change of hepatopancreas and gills microstructure in the diseased E.sinensis

觀察中華絨螯蟹肝胰臟組織切片的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組肝小管結(jié)構(gòu)清晰，基底膜完整，細(xì)胞核整齊地排列在基底膜側(cè)(圖1-B)?；疾⌒犯涡」艿募?xì)胞結(jié)構(gòu)模糊并隨意排列，血細(xì)胞數(shù)量增加，出現(xiàn)空泡狀結(jié)構(gòu)，基底膜明顯增厚(圖1-b)。

2.2 分離菌的致病性

分離菌SHZ1感染中華絨螯蟹一周內(nèi)死亡情況見表2，菌株SHZ1對(duì)中華絨螯蟹半數(shù)致死量為1.6×10CFU/mL。感染后中華絨螯蟹出現(xiàn)活動(dòng)緩慢，反應(yīng)遲鈍等癥狀。取人工感染中華絨螯蟹肝胰腺組織進(jìn)行細(xì)菌分離，將分離菌進(jìn)行分子鑒定及理化特性檢測(cè)，結(jié)果均與菌株SHZ1一致，表明豚鼠氣單胞菌是引起此次蘇州某養(yǎng)殖場(chǎng)中華絨螯蟹大規(guī)模死亡的病原菌，且對(duì)其有很強(qiáng)的致病性。

表2 分離菌SHZ1對(duì)中華絨螯蟹致病性分析Tab.2 Pathogenicity of strain SHZ1 to E.sinensis

2.3 分離菌形態(tài)特征及理化特性

透射電鏡觀察分離菌兩端鈍圓、呈桿狀、單生鞭毛，大小為1.2～1.6 μm×0.6～1.0 μm(圖2)。分離株SHZ1理化性質(zhì)見表3。β-半乳糖苷酶、七葉苷、接觸酶、氧化酶呈陽(yáng)性，能利用纖維二糖、木糖、蔗糖、鼠李糖等。不能利用乳糖、阿拉伯糖、棉子糖、枸櫞酸鹽等，這與豚鼠氣單胞菌的理化性質(zhì)相一致。

圖2 透射電鏡下分離菌株SHZ1的形態(tài)Fig.2 Electron micrograph of strain SHZ1

表3 分離菌株理化特性結(jié)果Tab.3 Results of physical and chemical properties of isolated strains

續(xù)表3

2.4 gyrB基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

分離菌SHZ1所擴(kuò)增的基因序列長(zhǎng)度為1 164 bp(GenBank登錄號(hào):MK990283)。對(duì)SHZ1進(jìn)行基因序列同源性分析，結(jié)果與氣單胞菌屬細(xì)菌的相似性達(dá)99%，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3，菌株SHZ1與豚鼠氣單胞菌聚為一支。結(jié)合該菌的形態(tài)特征、理化特性、基因序列系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析結(jié)果，鑒定分離菌為豚鼠氣單胞菌。

圖3 基于gyrB 基因序列所構(gòu)建的菌株SHZ1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetics tree based on gyrB gene sequence of strain SHZ1

2.5 分離菌毒力基因檢測(cè)

通過PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)菌株SHZ1可檢測(cè)出、、、、、、、及共9種毒力基因(圖4)，這些毒力基因可作為檢測(cè)病原性豚鼠氣單胞菌的生物學(xué)標(biāo)記。

圖4 SHZ1菌株毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Detection of virulence genes by PCR in strain SHZ1

2.6 胞外酶檢測(cè)結(jié)果

病原菌SHZ1胞外酶檢測(cè)結(jié)果表明，分離菌具有卵磷脂酶、酪蛋白酶、脂肪酶以及明膠酶活性，但不具有DNA酶活性。

2.7 耐藥性檢測(cè)

紙片擴(kuò)散法測(cè)定豚鼠氣單胞菌對(duì)供試34種抗菌類藥物耐藥性結(jié)果見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明：菌株SHZ1對(duì)青霉素類、呋喃類、頭孢菌素類的頭孢唑啉、氨基糖苷類的萬(wàn)古霉素、以及大環(huán)內(nèi)酯類的克拉霉素、克林霉素等9種藥物耐藥。對(duì)頭孢菌素類的頭孢噻吩、氨基糖苷類如卡那霉素等5種藥物中介。對(duì)頭孢菌素類如頭孢呋辛、氨基糖苷類如阿米卡星等20種藥物敏感。

表4 分離菌SHZ1藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 The drug sensitivity test of strain SHZ1

續(xù)表4

3 討論

近年來(lái)，陸續(xù)有報(bào)道豚鼠氣單胞菌可引起金魚()、長(zhǎng)絲鱸()、克氏原螯蝦()、匙吻鱘()等水生生物患病死亡。本次從發(fā)病中華絨螯蟹肝胰臟組織中分離到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng)菌，人工感染試驗(yàn)?zāi)芤鸾】敌返陌l(fā)病死亡，對(duì)分離菌進(jìn)行了理化特性方面的檢驗(yàn)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，表明豚鼠氣單胞菌SHZ1對(duì)中華絨螯蟹具有致病性，是引起蘇州養(yǎng)殖場(chǎng)大規(guī)模發(fā)病死亡的病原菌。

豚鼠氣單胞菌屬于氣單胞菌屬的嗜溫性氣單胞菌，普遍存在陸地和水環(huán)境中，能感染水生動(dòng)物引起其發(fā)病甚至死亡，具有較強(qiáng)的致病性。而氣單胞菌的致病性與其分泌大量毒力因子有關(guān)，誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞分泌活性氯，對(duì)腸組織造成嚴(yán)重?fù)p傷?？朔怂拗鞯姆烙鶛C(jī)制，導(dǎo)致組織損傷。鞭毛與細(xì)菌的毒力強(qiáng)弱息息相關(guān)，并且每個(gè)亞單位對(duì)于組成鞭毛都至關(guān)重要，基因參與鞭毛基體的環(huán)形成，基因則與基因一起構(gòu)成操縱子，調(diào)控鞭毛的形成?；虻耐蛔?，會(huì)導(dǎo)致端生鞭毛的喪失以及生物膜形成的減少。對(duì)細(xì)胞膜中磷脂的作用可能破壞細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞裂解。在增強(qiáng)細(xì)菌粘附、維持外膜結(jié)構(gòu)、逃避宿主殺傷等方面起到重要作用。李婉萍等曾對(duì)豹源豚鼠氣單胞菌進(jìn)行上述部分毒力基因的擴(kuò)增，檢測(cè)出、和三種毒力基因。而本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述9種毒力基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，分離菌SHZ1攜帶、、、、、、、和共9個(gè)毒力基因，說(shuō)明豚鼠氣單胞菌和其他氣單胞菌一樣，毒力基因具有多樣性。

鰓組織是中華絨螯蟹的重要呼吸器官，是防止水生疾病侵蝕的主要障礙。它在滲透壓的調(diào)節(jié)和離子平衡的調(diào)節(jié)中也起重要作用。中華絨螯蟹的肝臟和胰腺是重要的免疫器官，其組織結(jié)構(gòu)的變化也可在某種程度上反映了機(jī)體對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性改變。本研究發(fā)現(xiàn)，病蟹活動(dòng)性明顯減弱，鰓組織上皮細(xì)胞出現(xiàn)破壞和崩解，鰓腔隔破裂并瓦解，鰓腔中的血細(xì)胞數(shù)量減少。病蟹肝胰腺組織基膜破裂，上皮細(xì)胞排列紊亂、大量空泡化、管腔膜破裂、破碎的細(xì)胞組織進(jìn)入管腔等現(xiàn)象。該現(xiàn)象與周慧華等研究結(jié)果類似，說(shuō)明細(xì)菌性肝胰腺壞死不引起肝胰腺明顯水腫與萎縮。以上結(jié)果表明，豚鼠氣單胞菌的感染對(duì)中華絨螯蟹有明顯的毒性作用，并對(duì)其鰓組織和肝胰腺組織造成一定的損害。

本研究細(xì)菌耐藥性分析表明，分離菌對(duì)頭孢呋辛、頭孢噻肟、大觀霉素、四環(huán)素等20種抗菌藥敏感，而對(duì)頭孢唑啉、萬(wàn)古霉素、苯唑西林、青霉素G等9種藥物耐藥。從長(zhǎng)絲鱸中分離到的豚鼠氣單胞菌對(duì)青霉素、新生霉素、鏈霉素、復(fù)方新諾明等8種藥物耐藥。從中華絨螯蟹中分離到的豚鼠氣單胞菌對(duì)氨芐西林、麥迪霉素、萬(wàn)古霉素等3種抗生素耐藥。以上研究表明不同宿主內(nèi)分離到的豚鼠氣單胞菌對(duì)藥物的耐藥性有所不同。因此，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選擇合適的水產(chǎn)藥物治療細(xì)菌導(dǎo)致的疾病顯得尤為重要。同時(shí)還需考慮用藥劑量，給藥方式等問題，達(dá)到高效防治病害發(fā)生的目的。