蔣沅岐，田成旺，周鈺通，王旭光，夏媛媛，周福軍*，陳常青*

雙氫青蒿素固體分散體的制備及其生物利用度研究

蔣沅岐1，田成旺2, 3, 4，周鈺通2, 3, 4，王旭光4, 5，夏媛媛4, 5，周福軍2, 3, 4*，陳常青2, 3, 4*

1. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 2. 天津藥物研究院，天津 300462 3. 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 4. 釋藥技術(shù)與藥代動(dòng)力學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462 5. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物代謝新技術(shù)創(chuàng)新單元，天津 301617

制備雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）固體分散體（solid dispersion，SD）（DHA-SD），對(duì)其進(jìn)行處方優(yōu)化和表征，以提高DHA的體外溶出度及其在大鼠體內(nèi)的生物利用度。通過(guò)溶解度篩選出與DHA相容性較好的載體材料，以體外溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)DHA-SD進(jìn)行處方優(yōu)化，應(yīng)用掃描電子顯微鏡（SEM）、差示掃描量熱分析（DSC）、X-射線衍射分析（XRD）和紅外光譜（IR）對(duì)所制備的DHA-SD進(jìn)行表征。將DHA-SD進(jìn)行初步壓片，采用LC-MS/MS法分析DHA在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，比較片劑及原料藥的相對(duì)生物利用度，采用WinNonlin 8.3.1軟件非房室模型統(tǒng)計(jì)矩法，計(jì)算DHA的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。平衡溶解度結(jié)果顯示，以羥丙基-β-環(huán)糊精（H-β-CD）和大豆磷脂為主要載體的DHA-SD對(duì)DHA的增溶效果較好；優(yōu)化后的DHA-SD處方為DHA 20%、H-β-CD 66.12%、大豆磷脂13.22%、檸檬酸0.66%，其在純水中30 min的溶出度達(dá)到了94.51%。體內(nèi)生物利用度結(jié)果顯示，SD大鼠ig給予DHA片劑后，最大血藥濃度（max）和藥時(shí)曲線下面積（AUC0～）分別為原料藥的4.44、2.94倍。DHA-SD可顯著提高DHA的溶解度和口服生物利用度。

雙氫青蒿素；固體分散體；溶解度；體外溶出度；生物利用度；LC-MS/MS；藥動(dòng)學(xué)

青蒿素是菊科蒿屬植物黃花蒿L(fēng).葉中分離得到的一種具有過(guò)氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）為青蒿素經(jīng)硼氫化鈉還原得到的衍生物，分子式為C15H24O5，相對(duì)分子質(zhì)量為284.35，其半合成工藝簡(jiǎn)單，是青蒿素類藥物在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物[1]。構(gòu)效關(guān)系研究顯示，DHA保留了抗瘧活性基團(tuán)過(guò)氧橋，將羰基還原了成羥基，極大增強(qiáng)了抗瘧效果[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)DHA有抗腫瘤作用[3]。然而，DHA的水溶性差，生物利用度低限制了其在臨床上的應(yīng)用。近年來(lái)，許多研究者著眼于應(yīng)用現(xiàn)代制劑手段開(kāi)發(fā)DHA的新劑型，如脂質(zhì)體[4]、自微乳給藥系統(tǒng)[5]、包合物[6]、前藥自組裝納米粒[7]等，以提高其生物利用度。

固體分散體（solid dispersion，SD）技術(shù)將藥物和載體混合，制成高度分散的固體分散物，藥物以分子、膠態(tài)、微晶或無(wú)定形狀態(tài)存在于載體材料中，固體分散體是提高疏水藥物的溶解度、溶出度和口服生物利用度的最有效的形式之一[8]。磷脂分子具有兩親性，是非常有效的乳化劑，同時(shí)也是細(xì)胞膜的重要組成成分，與人體具有較好的相容性[9]，其能以非能量依賴的方式穿透細(xì)胞的磷脂雙分子層進(jìn)入細(xì)胞，提高生物利用度，而不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性[10]。DHA屬難溶性藥物，且在溶液中不穩(wěn)定，因此，本研究以羥丙基-β-環(huán)糊精（H-β-CD）和大豆磷脂為主要載體材料，制備了雙氫青蒿素固體分散體（DHA-SD），更有利于提高其穩(wěn)定性。以溶出度為指標(biāo)優(yōu)化DHA-SD處方，并進(jìn)一步應(yīng)用差示掃描量熱（DSC）法、X-射線粉末衍射（XRD）法、紅外光譜（IR）法、掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)優(yōu)選處方的DHA-SD進(jìn)行表征。然后將DHA-SD初步壓片，考察其在SD大鼠體內(nèi)的生物利用度。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters e2695-2998液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Agilent 1260-VWD液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Sciex Triple QuadTM，API 4000 Q-Trap質(zhì)譜儀，美國(guó)AB Sciex公司；17R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific公司；SB-3200DTN超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；AB-204N型電子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪器，天津賽盟實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；RC 12AD型智能溶出測(cè)定儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；DW-Z型電動(dòng)攪拌器，天津科諾儀器設(shè)備有限公司；1710 FT-IR紅外光譜儀，美國(guó)尼高力公司；HWT-20C恒溫水浴搖床，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司；DZF-6050型真空干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；Gemini 300掃描電子顯微鏡，德國(guó)蔡司公司；DSC-60差示掃描熱分析儀，日本島津公司；D/max-2500 X射線粉末衍射儀，日本理學(xué)公司。

1.2 材料

DHA原料藥，批號(hào)C01120200501，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.2%，昆藥集團(tuán)重慶武陵山制藥有限公司；對(duì)照品DHA（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.90%，批號(hào)為100184-201403）、青蒿素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%，批號(hào)為100202-201606），中國(guó)食品藥品檢定研究院；H-β-CD，淄博千匯生物科技有限公司；大豆磷脂，沈陽(yáng)天峰生物制藥有限公司；檸檬酸、泊洛沙姆407，羅輔醫(yī)藥科技（上海）有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS），天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；聚維酮K30（PVP K30）、泊洛沙姆188、聚乙烯己內(nèi)酰胺-聚醋酸乙烯酯-聚乙二醇接枝共聚物（Soluplus），北京鳳禮精求醫(yī)藥股份有限公司；-甲基--葡萄糖胺，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；羥丙基甲基纖維素（HPMC），Ashland公司；乳糖，安徽山河藥用輔料股份有限公司；聚乙二醇（PEG）6000，南京威爾藥業(yè)股份有限公司；磺丁基-β-環(huán)糊精鈉，西安德立生物化工有限公司；雙氧水，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；乙酸銨，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司；甲酸，色譜純，天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇、乙腈、無(wú)水乙醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司。

SPF級(jí)SD大鼠6只，雄性，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證編號(hào)：SYXK（津）2016-0009。本研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在符合國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估認(rèn)證管理委員會(huì)（AAALAC）認(rèn)證的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行，符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 DHA-SD的制備

采用溶劑法制備DHA-SD[11]，依處方稱取原料藥及各輔料，加入適量無(wú)水乙醇，于40 ℃恒溫磁力攪拌至溶解，繼續(xù)攪拌20 min，于50 ℃減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去無(wú)水乙醇，真空干燥除去殘留無(wú)水乙醇，研細(xì)，過(guò)60目篩，即得DHA-SD。

2.2 平衡溶解度實(shí)驗(yàn)初篩處方

2.2.1 色譜條件[5]Agilent 1260-VWD液相色譜儀；色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（250 mm×4.16 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm；柱溫25 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫條件：0～18.0 min，45%乙腈；18.0～18.1 min，45%～100%乙腈；18.1～23.0 min，100%乙腈；23.0～23.1 min，100%～45%乙腈；23.1～30.0 min，45%乙腈；理論塔板數(shù)以DHA峰計(jì)算為21 928。

2.2.2 對(duì)照品溶液的配制 精密量取適量DHA對(duì)照品，加甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.3 溶解度測(cè)定 在5 mL水中加入過(guò)量的DHA-SD置于50 mL三角瓶中，渦旋混勻，于25 ℃、60 Hz恒溫水浴振蕩24 h后取出，10 000 r/min離心10 min，吸取適量的上清液，用甲醇稀釋至適當(dāng)質(zhì)量濃度，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液于“2.2.1”項(xiàng)HPLC色譜條件下測(cè)定DHA的含量，并計(jì)算其溶解度。

2.2.4 處方初篩 初步選定可用于DHA-SD的輔料有H-β-CD、PVPK30、大豆磷脂、HPMC、PEG6000、乳糖、泊洛沙姆188、泊洛沙姆407、SDS、檸檬酸、磺丁基-β-環(huán)糊精鈉、-甲基--葡萄糖胺、Soluplus等，采用24 h平衡溶解度實(shí)驗(yàn)測(cè)定不同輔料對(duì)DHA的增溶效果，具體處方及平衡溶解度測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)平衡溶解度結(jié)果，以H-β-CD、大豆磷脂為載體時(shí)溶解度較高，大豆磷脂可有效提高DHA在水中的溶解度。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，DHA在H-β-CD中較穩(wěn)定，檸檬酸有助于提高DHA的穩(wěn)定性。故選擇大豆磷脂、檸檬酸和H-β-CD作為DHA-SD的載體材料。

表1 不同處方DHA-SD的平衡溶解度

Table 1 Equilibrium solubilities of DHA-SD in different formulations

處方質(zhì)量比平衡溶解度/(mg?mL?1) DHA∶H-β-CD∶PVP K301∶4.5∶1.51.784 DHA∶H-β-CD∶PVP K301∶5∶12.115 DHA∶H-β-CD1∶62.124 DHA∶H-β-CD∶PVP K301∶3∶31.090 DHA∶H-β-CD∶大豆磷脂1∶3∶34.473 DHA∶H-β-CD∶HPMC1∶3∶30.874 DHA∶H-β-CD∶乳糖1∶3∶31.228 DHA∶H-β-CD∶PEG 60001∶3∶30.925 DHA∶H-β-CD∶泊洛沙姆1881∶3∶30.660 DHA∶H-β-CD∶SDS1∶5∶0.51.047 DHA∶H-β-CD∶檸檬酸1∶5∶0.51.519 DHA∶磺丁基-β-環(huán)糊精鈉∶PVP K301∶3∶30.932 DHA∶磺丁基-β-環(huán)糊精鈉1∶61.752 DHA∶泊洛沙姆407∶PVP K301∶3∶30.050 DHA∶H-β-CD∶N-甲基-D-葡萄糖胺1.5∶7∶10.020 DHA∶PVP K30∶Soluplus1∶3∶10.061

2.3 DHA-SD處方的優(yōu)化

2.3.1 色譜條件 Waters e2695-2998液相色譜儀；色譜柱為Reprosil-Pur Basic C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水（60∶40）；檢測(cè)波長(zhǎng)216 nm；柱溫25 ℃；樣溫15 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；理論塔板數(shù)以DHA峰計(jì)算為8398。

2.3.2 DHA-SD輔料比例篩選 根據(jù)前期對(duì)處方的初步研究，擬定了DHA-SD處方組成，現(xiàn)采用正交試驗(yàn)對(duì)DHA-SD輔料的配比進(jìn)行研究。在正交試驗(yàn)中，以H-β-CD（A）、大豆磷脂（B）、檸檬酸（C）的質(zhì)量比為考察因素進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，以DHA-SD溶出度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定最佳制劑處方，正交試驗(yàn)因素水平、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。采用槳法進(jìn)行溶出度測(cè)定，以純水為溶出介質(zhì)，溶出介質(zhì)體積為250 mL，溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速100 r/min，依法操作，分別于15、30 min時(shí)取出2 mL，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，續(xù)濾液即為供試品溶液。因15min時(shí)各處方溶解度差異較明顯，故選用15min的結(jié)果作為篩選依據(jù)。用“2.3.1”項(xiàng)HPLC條件測(cè)定DHA含量。由DHA-SD處方研究L9(34)正交試驗(yàn)直觀分析可知，各因素作用主次為A＞C＞B，最佳工藝參數(shù)為A2B2C1。方差分析結(jié)果顯示，因素A對(duì)試驗(yàn)有顯著影響（＜0.05）。綜合考慮，確定DHA-SD各輔料的比例為H-β-CD∶大豆磷脂∶檸檬酸（5∶1∶0.05）。

表2 DHA-SD處方優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments of DHA-SD prescription optimization

試驗(yàn)號(hào)ABCD(空白)溶出度/% 14 (1)0.5 (1)0.05 (1)(1)70.02 24 (1)1.0 (2)0.10 (2)(2)65.26 34 (1)2.0 (3)0.15 (3)(3)53.70 45 (2)0.5 (1)0.10 (2)(3)73.74 55 (2)1.0 (2)0.15 (3)(1)78.45 65 (2)2.0 (3)0.05 (1)(2)81.19 76 (3)0.5 (1)0.15 (3)(2)68.75 86 (3)1.0 (2)0.05 (1)(3)82.21 96 (3)2.0 (3)0.10 (2)(1)70.89 K1188.98212.51233.42219.36 K2233.38225.92209.89215.20 K3221.85205.78200.90209.65 R14.806.7110.843.24

表3 方差分析

Table 3 Variance analysis

方差來(lái)源偏差平方和自由度均方F值顯著性 A117.95258.9822.37P＜0.05 B23.36211.684.43 C62.67231.3311.88 D (誤差) 5.2722.6371.00

2.3.3 DHA-SD原料藥與輔料比例的確定 原輔料的比例直接影響SD的溶解度、可壓性等性質(zhì)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇藥輔比為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5制備SD，對(duì)DHA-SD原料藥和輔料的比例進(jìn)行優(yōu)化，采用“2.2”項(xiàng)下的溶出測(cè)定方法對(duì)制得的樣品進(jìn)行含量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表4）顯示，當(dāng)藥輔比為1∶4和1∶5時(shí)，DHA溶出度較高，分別為94.51%和96.84%，考慮到后續(xù)壓片過(guò)程還需添加其他輔料，為保證含藥量，故選擇1∶4作為最終的原料藥與輔料的比例。

表4 藥輔比篩選結(jié)果

Table 4 Screening results of proportion of drugs and excipients

藥輔比例t/min溶出度/%藥輔比例t/min溶出度/% 1∶11575.241∶33083.67 1∶13088.361∶41580.78 1∶21565.141∶43094.51 1∶23079.971∶51582.30 1∶31568.511∶53096.84

最終得到DHA-SD最優(yōu)處方為DHA 20%、H-β-CD 66.12%、大豆磷脂13.22%、檸檬酸0.66%。制備得到的DHA-SD載藥量較大，溶解性好，制備工藝簡(jiǎn)單可行。

2.3.4 工藝驗(yàn)證 按照最優(yōu)處方制備3批DHA-SD，3批投料量均為100 g。取適量DHA-SD，依法測(cè)定30 min時(shí)的溶出度，考察重現(xiàn)性，結(jié)果（表5）表明該制備工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

Table 5 Results of verification

試驗(yàn)號(hào)得率/%溶出度/% 195.7693.82 294.9994.59 395.4394.07

2.4 固體分散體的表征

2.4.1 XRD分析 通過(guò)XRD檢測(cè)DHA原料藥、DHA-SD、物理混合物（各成分比例與DHA-SD一致）及各載體材料的晶型。工作參數(shù)為靶電壓40 kV，電流40 mA，掃描速度10°/min，掃描范圍23°～40°。由圖1可以看出，DHA存在明顯的特征衍射峰，H-β-CD無(wú)晶體衍射峰，而在物理混合物和DHA-SD中，代表DHA晶型的特征衍射峰依然存在。XRD可用于識(shí)別物質(zhì)的非晶態(tài)和多晶形態(tài)，譜圖中出現(xiàn)尖銳峰表明是晶體物質(zhì)，而鈍峰則表明是無(wú)定形物質(zhì)[12]。因此，推測(cè)在本研究的固體分散體中，DHA依然是以晶體形式存在的。

2.4.2 SEM觀察 使用SEM對(duì)DHA原料藥、DHA-SD及各載體材料的表面微觀形態(tài)進(jìn)行觀察。取少量樣品粘于導(dǎo)電膠上，噴金后進(jìn)行樣品檢測(cè)。

DHA原料藥、大豆磷脂、H-β-CD、檸檬酸、DHA-SD及物理混合物的SEM圖如圖2所示。由圖2-A、B、D、E可以看出，大豆磷脂表面較光滑，DHA原料藥為針狀晶體，H-β-CD為球形帶有凹陷孔洞的顆粒，檸檬酸為表面凹凸不平的不規(guī)則顆粒?？梢钥闯?，DHA與大豆磷脂、H-β-CD、檸檬酸3種載體材料的物理混合物僅為4者的簡(jiǎn)單混合，仍可見(jiàn)H-β-CD和大豆磷脂的特征。而從圖2-C中觀察發(fā)現(xiàn)，DHA與載體材料聚合形成了塊狀、均一的顆粒，在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了的顯著變化，表明幾種化合物之間形成了不同于任何一種原料的物態(tài)形式，這種變化可能是由藥物與聚合物之間相互作用導(dǎo)致的[13]。

圖1 物理混合物、DHA原料藥、DHA-SD、檸檬酸、H-β-CD、大豆磷脂的粉末XRD圖

2.4.3 DSC DSC的研究主要用于觀察在DHA-SD的制備過(guò)程中DHA原料藥的晶型是否發(fā)生了改變，采用DSC法對(duì)樣品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度（g）值進(jìn)行檢測(cè)。分別稱取DHA原料藥、DHA-SD、物理混合物及載體材料1～3 mg于密閉的鋁盤(pán)中，升溫速度為10 ℃/min，氮?dú)怏w積流量為40 mL/min，升溫范圍為30～250 ℃。DHA原料藥、H-β-CD、大豆磷脂、檸檬酸、DHA-SD及物理混合物的DSC圖譜如圖3所示。結(jié)果顯示，檸檬酸在156 ℃左右存在1個(gè)尖銳的吸收峰，H-β-CD和大豆磷脂無(wú)明顯的吸熱峰，說(shuō)明其主要以無(wú)定形形式存在[11]。DHA的熔點(diǎn)峰在168 ℃左右，該峰可作為DHA的晶型指示峰。物理混合物在165 ℃左右仍存在吸熱峰，說(shuō)明DHA與載體材料只是簡(jiǎn)單的混合，并未改變晶型；DHA-SD中未檢測(cè)到DHA的吸熱峰，可能由于藥物已分散于SD中[14]。

圖2 大豆磷脂(A)、DHA (B)、DHA-SD (C)、H-β-CD (D)、檸檬酸(E)及物理混合物(F)的SEM圖

2.4.4 IR分析 IR用于分析化合物的化學(xué)鍵、官能團(tuán)及晶體結(jié)構(gòu)有無(wú)變化。分別取DHA原料藥、DHA-SD、物理混合物及載體材料適量，與干燥的KBr充分混合研磨并壓片，在400～4000 cm?1進(jìn)行掃描，分辨率為2 cm?1，每個(gè)樣品采集32次，結(jié)果見(jiàn)圖4。

對(duì)DHA-SD、DHA原料藥及各輔料的IR圖譜分析可知，DHA-SD在3400 cm?1附近存在寬而鈍的峰，對(duì)應(yīng)H-β-CD上的O-H通過(guò)氫鍵締合后的紅外吸收，而該鈍峰上3 379.5 cm?1處有1明顯的尖峰，對(duì)應(yīng)DHA的12位半縮醛O-H伸縮振動(dòng)；與DHA原料藥和物理混合物相比，DHA-SD中該峰略有藍(lán)移，顯示其鍵能有所增加。大豆磷脂的酯羰基伸縮振動(dòng)峰位于1 738.8 cm?1處，而DHA-SD中相應(yīng)的吸收峰出現(xiàn)在1 733.9 cm?1處，周?chē)鸁o(wú)其他吸收峰干擾。由于DHA結(jié)構(gòu)中不存在羰基，由此可以推斷1 733.9 cm?1的吸收峰是大豆磷脂的酯羰基與DHA或其他輔料形成氫鍵后產(chǎn)生紅移所致。DHA-SD中1 227.4 cm?1處的小峰是DHA結(jié)構(gòu)中C-O的伸縮振動(dòng)所致，而1 156.6 cm?1處的強(qiáng)吸收是H-β-CD吡喃環(huán)上的C-O伸縮振動(dòng)峰。DHA在 1 159.7 cm?1和1 092.9 cm?1處的縮醛（5位）和半縮醛（12位）C-O的伸縮振動(dòng)在物理混合物的紅外圖譜中仍可見(jiàn)，但在DHA-SD中消失，這表明在DHA-SD中DHA與輔料相互作用的強(qiáng)度更大。另外，DHA過(guò)氧鍵的特征峰（824 cm?1處O-O的伸縮振動(dòng)和876 cm?1處的O-O-C的彎曲振動(dòng)）在DHA-SD中仍然保留，顯示DHA的1,2,4-三烷藥效團(tuán)在制劑過(guò)程中未受到影響。

圖3 H-β-CD (a)、大豆磷脂(b)、DHA-SD(c)、物理混合物(d)、DHA原料藥(e)、檸檬酸(f) 的DSC分析圖

圖4 大豆磷脂 (a)、DHA-SD (b)、檸檬酸 (c)、H-β-CD (d)、DHA (e)、及物理混合物 (f) 的紅外光譜掃描圖

2.5 大鼠體內(nèi)相對(duì)生物利用度比較研究

2.5.1 給藥方案與生物樣品的采集 對(duì)制得的DHA-SD進(jìn)行初步壓片，研究其在大鼠體內(nèi)的生物利用度。取健康SD大鼠6只，雄性，隨機(jī)分為2組，每組3只，進(jìn)行單劑量、單次給藥試驗(yàn)。第1組大鼠ig給予原料藥混懸液制劑，另1組大鼠ig給予片劑混懸液制劑。ig給藥量為0.5 mL/kg。給藥前禁食不少于12 h，自由飲水，給藥后2 h統(tǒng)一給食。分別于ig給藥后5、15、30、45 min及1、1.5、2、3、4、6、9、12、24 h各時(shí)間點(diǎn)，從頸靜脈插管采血約0.25 mL于EDTA抗凝管中，立即置于冰上并于15 min內(nèi)離心，吸取50 μL血漿于已加入5 μL 10%甲酸和5 μL 30%雙氧水的EP管中，渦旋混勻，3樣本?70 ℃冰箱凍存至LC-MS/MS定量分析。

2.5.2 生物樣本處理方法 50 μL大鼠含藥血漿，加入5 μL 10%甲酸水溶液及5 μL雙氧水，再加入50 μL內(nèi)標(biāo)青蒿素（100 ng/mL）乙腈工作液及150 μL乙腈溶液，渦旋1 min，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min，渦旋1 min，取100 μL于內(nèi)插管中，4 ℃ 12 000 r/min離心5 min，進(jìn)樣20 μL。

2.5.3 生物樣品分析方法的建立

（1）色譜條件：Zorbax Eclispe C18柱（50 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；體積流量0.5 mL/min；進(jìn)樣體積20 μL；進(jìn)樣器溫度6 ℃；運(yùn)行時(shí)間6.5 min（2.5～4.5 min切換進(jìn)質(zhì)譜）；流動(dòng)相A為10 mmol/L乙酸銨-5%甲醇水溶液，流動(dòng)相B為50%甲醇-乙腈溶液，梯度洗脫程序：0～0.5 min，50% A；0.5～6.0 min，50%～10% A；6.0～7.0 min，10% A；7.0～7.1 min，10%～50% A；7.1～10.0 min，50% A。

（2）質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源（ESI）；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子掃描（MRM）；正離子模式；主要參數(shù)設(shè)置為噴霧電壓（IS）5500 V；源溫（TEM）300 ℃；檢測(cè)質(zhì)核比為/302→267（DHA），/300→209（內(nèi)標(biāo)青蒿素）。

2.5.4 方法學(xué)驗(yàn)證

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍：精密量取10 μL質(zhì)量濃度分別為0.04、0.08、0.16、0.8、2、7.5、10 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，加入190 μL大鼠空白血漿，按照“2.5.2”項(xiàng)下樣品處理方法處理，進(jìn)行LC-MS/MS分析。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（）為縱坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得線性回歸方程＝8.51×10?3＋3.96×10?5，＝0.998 9，線性范圍2～500 ng/mL。

（2）準(zhǔn)確度和精密度：配制并處理質(zhì)量濃度為5、25、400 ng/mL的樣品進(jìn)行LC-MS/MS分析，考察3個(gè)批次，每批次每質(zhì)量濃度6個(gè)樣本。進(jìn)樣分析并計(jì)算準(zhǔn)確度和精密度。結(jié)果表明，大鼠血漿中DHA 3個(gè)質(zhì)量濃度水平質(zhì)控樣品的批內(nèi)準(zhǔn)確度在93.3%～107.0%，批間準(zhǔn)確度在93.7～105.0%；批內(nèi)精密度在2.38%～4.33%，批間精密度在0.95%～10.10%，均符合接受標(biāo)準(zhǔn)。

（3）生物樣品穩(wěn)定性：考察低、高不同質(zhì)量濃度水平的DHA在生物基質(zhì)及處理后各條件的穩(wěn)定性，每質(zhì)量濃度3樣本。分別取DHA質(zhì)量濃度為1、50 μg/mL溶液20 μL，加入大鼠空白全血3980 μL，配制成2個(gè)質(zhì)量濃度水平的全血穩(wěn)定性樣品，質(zhì)量濃度分別為5、250 ng/mL，按照200 μL進(jìn)行分裝至EP管中，達(dá)到各考察條件后離心分離血漿。結(jié)果顯示，含藥全血冰上放置20 min穩(wěn)定（準(zhǔn)確度分別為113%）；含藥血漿室溫放置4 h后穩(wěn)定（準(zhǔn)確度分別為97.2%、93.1%）；含藥血漿?70 ℃至室溫凍融3次穩(wěn)定（準(zhǔn)確度分別為96.6%、87.5%）；含藥血漿?70 ℃凍存14 d穩(wěn)定（準(zhǔn)確度分別為99.6%、94.4%）；沉淀處理后樣品室溫放置4 h穩(wěn)定（準(zhǔn)確度分別為102%、94.8%），處理后樣品于進(jìn)樣器溫度下（2～8 ℃）放置48 h后穩(wěn)定（準(zhǔn)確度分別為96.1%、86.5%）。

2.5.5 數(shù)據(jù)處理 應(yīng)用Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件，對(duì)待測(cè)物DHA和內(nèi)標(biāo)青蒿素進(jìn)行積分，得出峰面積。選擇WinNonlin 8.3.1軟件非房室模型統(tǒng)計(jì)矩法計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（表6），其中曲線下面積（AUC0～t）采用梯形法計(jì)算，消除半衰期采用Best Fit法計(jì)算，max、max采用實(shí)測(cè)值。經(jīng)劑量折算后的AUC0～t計(jì)算相對(duì)生物利用度，ig給予DHA-SD片劑的混懸制劑相比于原料藥組相對(duì)生物利用度為294%，SD大鼠ig DHA原料藥及片劑后，原型DHA在血漿中于0.25～0.5 h達(dá)峰，隨后血藥濃度逐漸下降。ig DHA片劑的混懸制劑后，血漿中原型DHA的暴露量高于原料藥組，藥時(shí)曲線見(jiàn)圖5。

3 討論

DHA屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)中的II類藥物，具有低溶解性、高滲透性的特點(diǎn)[15]，實(shí)驗(yàn)測(cè)得DHA原料藥在25 ℃的24 h平衡溶解度僅為0.140 mg/mL，低溶解性是此類藥物制劑開(kāi)發(fā)中面臨的主要問(wèn)題[16]。如果藥物的溶解速度明顯低于吸收速度，藥物的溶解就成為吸收過(guò)程中的限速步驟[17]。

表6 DHA原料藥和DHA-SD片的主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)比較 (40 mg?kg?1, , n = 3)

Table 6 Main pharmacokinetic parameters for DHA and DHA solid dispersion tablets (40 mg?kg?1,, n = 3)

參數(shù)單位DHA原料藥DHA-SD片劑 Cmaxng?mL?1473±1672100±1210 Tmaxh0.500±0.2500.333±0.144 AUC0～th?ng?mL?1523±1751540±829 AUC0～∞h?ng?mL?1529±1751540±826 t1/2h0.486 0±0.071 20.241 0±0.033 2**

與原料藥比較：**＜0.01

**< 0.01bulk drug

圖5 DHA原料藥和DHA-SD片的血藥濃度-時(shí)間曲線(, n = 3)

制成固體分散體后，DHA的24 h溶解度增加了30倍，在純水中30 min溶出度達(dá)到了94.51%，有效提高了藥物的溶解度。在本研究中，大豆磷脂為固體分散體的關(guān)鍵載體之一，是一種具有多種用途的多功能表面活性劑，磷脂具有兩親性，對(duì)難溶性藥物具有增溶潛力[18]。H-β-CD可通過(guò)將藥物包合到疏水空腔中，作為絡(luò)合劑來(lái)提高藥物的溶解性和生物利用度。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)同時(shí)使用H-β-CD和大豆磷脂作為載體時(shí)，增溶效果明顯優(yōu)于單用H-β-CD，可能由于大豆磷脂分散在水中時(shí)可與藥物形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)或乳化膠束微粒[19]，進(jìn)一步促進(jìn)藥物的溶解，H-β-CD和大豆磷脂的雙重作用增加了載藥量和藥物的溶解度。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)檸檬酸對(duì)DHA有穩(wěn)定作用，故處方中加入少量檸檬酸以提高藥物的穩(wěn)定性。本研究的目標(biāo)劑型為雙氫青蒿素固體分散體片劑，而片劑不利于大鼠的口服給藥，故將片劑制成混懸液ig給藥，以研究其生物利用度。體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示，固體分散體片劑的max較原料藥提高了4.4倍，生物利用度提高了2.94倍，表明其明顯促進(jìn)了藥物的體內(nèi)吸收。

綜上所述，本研究制備的DHA-SD溶解性好，生物利用度高，為DHA的制劑開(kāi)發(fā)提供了新的思路。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and bioavailability of dihydroartemisinin solid dispersions

JIANG Yuan-qi1, TIAN Cheng-wang2, 3, 4, ZHOU Yu-tong2, 3, 4, WANG Xu-guang4, 5, XIA Yuan-yuan4, 5, ZHOU Fu-jun2, 3, 4, CHEN Chang-qing2, 3, 4

1. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 3. Tianjin Key Laboratory of Quality Marker of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 300462, China 4. State Key Laboratory of Drug Delivery and Pharmacokinetics, Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300462, China 5. Research Unit for Drug Metabolism, Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 301617, China

To prepare the solid dispersion (SD) of dihydroartemisinin (DHA) (DHA-SD), optimize and characterize its formulation to improve its dissolution rateand bioavailability in rats.By solubility test, the carrier materials with better compatibility to DHA were screened out. Taking thedissolution rate as the evaluation index, the formulation of DHA-SD was optimized utilizing the orthogonal test. The prepared DHA-SD was characterized with the help of scanning electron microscope (SEM), differential scanning calorimetry (DSC), X-ray diffraction analysis (XRD) and infrared spectroscopy (IR). Then, the DHA-SD was compressed into tablets, the pharmacokinetic characteristics of DHA in rats were analyzed by LC-MS/MS method, and the relative bioavailability of tablets and APIs was compared. Finally, WinNonlin 8.3.1 software non-compartmental model statistical moment method was used to calculate the main pharmacokinetic parameters of DHA.The results of equilibrium solubility showed that the DHA-SD with H-β-CD and soybean phospholipid as the carrier had a better solubilization effect on DHA; the optimized DHA-SD prescription was DHA 20%, H-β-CD 66.12%, soybean phospholipid 13.22%, citric acid 0.66%, whose dissolution rate in pure water could reach 94.51% within 30 min. The results ofbioavailability showed that, after intragastric administration of DHA tablets to SD rats,maxand AUC0—twere 4.44 times and 2.94 times that of the crude drug, respectively.DHA-SD can significantly improve thedissolution and oral bioavailability of the drug.

dihydroartemisinin; solid dispersion; solubility;dissolution rate;bioavailability; LC-MS/MS; pharmacokinetics

R283.6

A

0253 - 2670(2022)04 - 1013 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.007

2021-09-07

國(guó)家重大科技專項(xiàng)（2017ZX09101002-001-005）；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目資助（2019-I2M-5-020）

蔣沅岐，女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹苿┭芯颗c開(kāi)發(fā)。E-mail: yuanqi_jiang@163.com

陳常青 E-mail: chencq@tjipr.com

周福軍E-mail: zhoufj@tjipr.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]