孟益德，呂庚鑫，劉攀峰，趙 培，杜紅巖，杜蘭英

（1.國家林業(yè)和草原局 泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.南京林業(yè)大學，江蘇 南京 210037；3.中國林業(yè)科學研究院 經(jīng)濟林研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；4.經(jīng)濟林種質創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，河南 鄭州 450003；5.河南省產品質量監(jiān)督檢驗院，河南 鄭州 450003）

杜仲Eucommia ulmoideOliv.是第四紀冰川侵襲后留存于我國的單種屬孑遺樹種，也是目前我國重要的經(jīng)濟林樹種[1]。杜仲雄花是我國珍貴的花粉資源，富含多種人體健康有益成分，已開發(fā)出杜仲雄花茶、保健酒、養(yǎng)生掛面、功能飲料等系列產品，在市場上倍受青睞[2]。迄今在杜仲雄花中發(fā)現(xiàn)黃酮類、苯丙素類、環(huán)烯醚萜類、木脂素類等活性物質[3]，以京尼平苷、桃葉珊瑚苷、綠原酸、異槲皮苷的研究最為廣泛和深入[4-5]。已證明杜仲雄花具有抗炎、抗菌、抗病毒、降血壓、降血脂、抑菌、抗老化等藥理作用[6]。2014年，杜仲雄花被我國國家衛(wèi)生委員會列入新資源食品名錄[7]。

近年來代謝組學技術已廣泛地應用于中藥材質量控制與品質評價、資源鑒定、植物分類、親緣關系評估以及代謝調控網(wǎng)絡等領域[8-9]。應用UPLC-QTOF/MS 并結合多維統(tǒng)計分析方法將黃岑野生居群劃分為3 種化學型，鑒定出4個差異代謝物，可用于區(qū)分不同產區(qū)的黃芩[10]。也有研究通過非靶向代謝組學方法發(fā)現(xiàn)不同茶樹群體中代謝物含量差異顯著，并且各種群具有各自的特征代謝物[11]。基于LC-ESI-Triple TOF-MS/MS 技術對杜仲雄花中32 種化學成分進行了分析鑒定，結果表明，杜仲雄花化學成分與杜仲皮相似，但是雄花的黃酮苷類成分含量高于杜仲皮[12]。

杜仲雄花代謝成分是品質形成的重要因素[13]，但對杜仲雄花品質性狀區(qū)分的物質基礎尚不明確。以往研究多集中在少數(shù)代謝成分的測定和評價方面[14-15]，尚未利用代謝組方法進行整體和系統(tǒng)研究，而這對于杜仲雄花種質資源鑒定、評價以及代謝成分的生物合成機制研究極為重要。

杜仲在我國亞熱帶至溫帶的27 個省份均有分布[1]。貴州省遵義市是杜仲藥材的道地和主要產區(qū)，河北省安國市、四川省廣元市為我國傳統(tǒng)的杜仲藥材生產基地，而洛陽市和新鄉(xiāng)市為河南省新型杜仲資源培育的主要聚集區(qū)之一[16-17]。因此，本研究通過對5 個典型產地的杜仲雄花進行UPLCQTOF/MS 代謝組學分析，解析不同杜仲種質雄花代謝成分的整體性差異，為后續(xù)全面開展杜仲種質資源精準評價提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采樣樹樹齡6 a，采自于中國林業(yè)科學研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心杜仲國家種質資源庫，地理坐標34°55′N，113°36′E，不同種質立地條件以及管理方式基本一致。2018年采集2～4 株樣樹盛花期的新鮮雄花，每種質6 個生物學重復。除去鱗片和混生在雄花序內的小葉后置50 mL 離心管內液氮冷凍，帶回室內-80℃保存。

1.2 杜仲雄花形態(tài)性狀的測定

分別測定5 份種質枝皮顏色、雄花序形狀、雄花顏色、雄花序數(shù)量、單雄花序鮮質量、雄花序長度、雄花序寬度、雄花數(shù)量、雄花長度、雄蕊數(shù)量以及雄蕊長度等11 個形態(tài)指標，每個指標測定10 個生物學重復。

1.3 提取液的制備

稱取100 mg 杜仲雄花進行液氮研磨，之后向樣品中加入120 μL 預冷的50%甲醇，渦旋1 min，室溫下孵育10 min，將提取混合物在-20℃下儲存過夜。4 000 r/min 離心20 min，上清液轉移至96孔板，待LC-MS 分析。每個樣品取10 uL 進行合并制備QC 樣品。

1.4 UPLC-QTOF/MS 分析

利用超高效液相色譜(SCIEX，UK)系統(tǒng)進行物質分離和高分辨質譜TripleTOF5600plus (SCIEX，UK) 對樣品進 行物質鑒定。液相分析條件：1) 色譜柱(Waters ACQUITYUPLC BEH Amide column)1.7 μm，2.1 mm×100 mm；2) 流動相A 為水+25 mmol 乙酸銨+25 mmol 氨水，B 為乙腈(加0.1%甲酸)；3) 梯度洗脫條件：0～0.5 min，95% B；0.5～9.5 min，95%～65% B；9.5～10.5 min，65%～40% B；10.5～12 min，40% B；12～12.2 min，40%～95% B；12.2～15 min，95% B；4) 柱溫35℃，流速0.4 mL/min，每個樣品的進樣量為4 μL。分別采用電噴霧電離正離子(ESI+)和負離子(ESI-)模式檢測柱中洗脫的代謝物，質譜條件：離子源溫度650℃，質譜電壓5 000 V，氣體Ⅰ和氣體Ⅱ設置60PSI，簾氣30PSI，在DDA 模式下獲得質譜數(shù)據(jù)。每10 針樣品插入1 個質控樣品，用于監(jiān)測和評估質譜系統(tǒng)穩(wěn)定性及試驗數(shù)據(jù)的可靠性[18]。

1.5 代謝組數(shù)據(jù)注釋

質譜下機數(shù)據(jù)利用MSConvert 軟件轉化為.mzXML 格式，利用XCMS 進行峰選擇、峰分組、保留時間校正等預處理，提取到的物質利用Camera 軟件進行加合離子注釋。使用metaX 軟件對一級質譜信息進行鑒定，并利用KEGG、PLANTCYC 數(shù)據(jù)庫進行代謝物注釋。二級質譜信息利用HMDB 數(shù)據(jù)庫以及in-house 標準數(shù)據(jù)庫進行匹配，利用HMDB 數(shù)據(jù)庫進行注釋。將QC 樣本中缺失數(shù)量超過50%的特征離子和測定樣本中缺失數(shù)量超過80%的特征離子去除，剩余缺失值的峰值用k-最近鄰算法進行填充[18]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

綜合ESI+模式和ESI-模式得到的二級質譜數(shù)據(jù)進行多元統(tǒng)計分析，在SIMCA-P 14.1 軟件中進行主成分分析(principal component analysis，PCA)，考察不同樣本生物學重復之間的差異性。采用正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)衡量每個種質與其它4 個種質代謝組之間的差異性，根據(jù)變量對分組貢獻值vip ≥1、組間變化的顯著性(P＜0.05)及差異倍數(shù)(fold change ≥2 和fold change ≤0.5)進行差異性代謝物的篩選。通過R語言對篩選出的雄花差異代謝成分進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同產地杜仲雄花的形態(tài)特征

不同產地杜仲雄花的形態(tài)特征見圖1和表1。不同產地杜仲雄花的枝皮顏色有4 種類型，分別為青灰色、灰褐色、青褐色和褐色；雄花序形狀較為一致，多為扁球形；雄花顏色略有相同。河北安國和河南新鄉(xiāng)杜仲的雄花序數(shù)量(14.4±3.53，14.1±2.02)顯著高于其他3 個產地的杜仲種質；河南洛陽杜仲種質的單雄花序鮮質量(2.04±0.49 g)顯著高于其他4 個產地；而四川廣元和貴州遵義杜仲種質的雄花序寬度(33.06±2.67 mm，32.82±2.68 mm)較高；雄花數(shù)量(9.67±0.58)以四川廣元最低。

表1 不同產地杜仲雄花形態(tài)特征的比較分析Table 1 Comparison of the morphological characteristics of Eucommia ulmoides male flowers from different producing areas

圖1 不同產地杜仲雄花的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Eucommia ulmoides male flowers from different producing areas

2.2 不同產地杜仲雄花代謝組的測定

從樣本TIC 重疊圖（圖2）可以看出，正負離子模式下的TIC 重疊度均較高，所檢測到物質峰都比較豐富，分別在ESI+和ESI-模式下獲得13 341 個和10 387 個初始特征離子（表2），以及11 351 個和9 051 個高質量特征離子。在正負離子模式下，KEGG 數(shù)據(jù)庫分別注釋到6 062 和3 637 個代謝物，PLANTCYC 數(shù)據(jù)庫注釋到3 120和1 400 個代謝物。對一級質譜信息進行篩選，ESI+和ESI-模式下定性到1 368 個代謝物和899個代謝物。

表2 總離子數(shù)和鑒定統(tǒng)計Table 2 Total ion number and identification statistics

圖2 不同產地杜仲雄花的TIC 重疊圖Fig.2 TIC overlap of Eucommia ulmoides male flowers from different producing areas

ESI+和ESI-模式下二級質譜信息篩選定性到212 個代謝物和37 個代謝物。根據(jù)HMDB 數(shù)據(jù)庫對二級定性到的代謝物進行分類，羧酸及其衍生物86 個，脂質和類脂分子35 個，核苷、核苷酸及類似物28 個，有機雜環(huán)28 個，有機氧化合物21 個，黃酮類化合物19 個，苯環(huán)型化合物14 個，肉桂酸及其衍生物7 個，生物堿及其衍生物4 個，有機氮化合物4 個。

2.3 不同產地杜仲雄花代謝組的比較分析

2.3.1 代謝組數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性考察

不同產地杜仲雄花代謝組PCA 分析結果（圖3）表明，各產地杜仲雄花的生物學重復以及6 個QC 樣品都聚集在一起，說明各產地杜仲雄花代謝組數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性較好，在測定過程中未出現(xiàn)明顯偏差。PCA 分析可區(qū)分出4 個主成分，其中主成分1(PC1)的貢獻率為47.2%，主成分2(PC2)的貢獻率為21.2%，不同樣本在兩個維度上表現(xiàn)出較為明顯的分離趨勢，表明不同產地杜仲雄花的代謝組具有一定的差異性。

圖3 不同產地杜仲雄花代謝組的PCA 得分Fig.3 PCA scores of male folwer metabolome of Eucommia ulmoides from different producing areas

2.3.2 不同產地杜仲雄花的差異性比較

不同產地杜仲雄花代謝組OPLS-DA 分析結果表明，每個種質與其他4 個種質代謝組之間差異明顯（圖4）。OPLS-DA 模型中各組都位于置信區(qū)間內，同時參數(shù)R2Y和Q2都大于0.9（表3），表明模型可靠。對OPLS-DA 進行排列驗證（n=200，即200 次排列實驗），在各組模型驗證中，最右側點對應為原始模型的R2Y和Q2，灰點和相應顏色點分別代表Y置換后模型的R2和Q2，均小于原始模型的R2Y和Q2，即相應點都不超過相應的線，表明模型沒有過擬合。

圖4 不同產地杜仲雄花代謝物的OPLS-DA 得分和置換檢驗Fig.4 OPLS-DA score and replacement test of metabolites from Eucommia ulmoides male flowers from different producing areas

續(xù)圖4Continuation of Fig.4

表3 OPLS-DA 模型的主要評估指標Table 3 Main evaluation indexes of OPLS-DA model

2.3.3 差異代謝物的篩選

對定性到的249 個代謝成分進行差異性代謝物篩選，共篩選出45 個差異代謝物，篩選結果見表4。河北安國、四川廣元、河南新鄉(xiāng)、河南洛陽、貴州遵義杜仲種質相較于其他種質分別篩選到22、18、12、5、13 個差異代謝物（圖5）。其中，黃酮類化合物最多，為11 個；其次是羧酸及其衍生物，為10 個。對不同產地杜仲雄花的特有差異代謝物和共有差異代謝物進行交集分析（圖6），5 個產地杜仲雄花的特有差異代謝物分別有11、7、4、2、5 個。3 個及以上樣本共有差異代謝物為花生四烯酸、硬脂酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、錦葵色素-3-葡糖苷、根皮素、咖啡酸、綠原酸，屬于脂質和類脂分子、黃酮類化合物、肉桂酸及其衍生物、有機氧化合物。

表4 杜仲雄花差異代謝物的鑒定信息?Table 4 Identification information of differential metabolites in male flowers of Eucommia ulmoides

續(xù)表4Continuation of table 4

圖5 不同產地杜仲雄花差異代謝物的火山圖Fig.5 Volcanic map of differential metabolites in male flowers of Eucommia ulmoides from different producing areas

圖6 不同產地杜仲雄花差異代謝物的韋恩圖Fig.6 Venny plot of differential metabolites in male flowers of Eucommia ulmoides from different producing areas

2.3.4 差異代謝物聚類及通路分析

根據(jù)篩選出的差異代謝物的特征進行聚類分析（圖7），河北安國、四川廣元、河南新鄉(xiāng)、河南洛陽、貴州遵義杜仲種質分別有4、1、5、4、11 個代謝物的表達量明顯高于其他種質，即相對成分含量增加。河北安國杜仲相對于其他產地杜仲種質上調的化合物為硬脂酸、3-羥基-3-甲基戊二酸、煙酰胺、雌馬酚。四川廣元杜仲上調的化合物為芹菜素7-葡萄糖苷。河南新鄉(xiāng)杜仲上調的化合物為煙酰胺核苷、1-甲基腺苷、脫氧腺苷、3-羥基己糖、根皮素。河南洛陽杜仲上調的化合物為L-亮氨酰-L-脯氨酸、1-?；视土柞Ｄ憠A、鞘胺醇、錦葵色素-3-葡糖苷。貴州遵義杜仲上調的化合物最多，為咖啡酸、木犀草素、5,7-二羥基黃酮、金絲桃苷、迷迭香酸、辣椒素、花生四烯酸、硬脂酸、綠原酸、L-抗壞血酸、6-芐基氨基嘌呤。通過KEGG 數(shù)據(jù)庫對差異代謝物質進行通路富集分析，45 種顯著差異的代謝物主要分布在4 條代謝途徑中，分別為氨?；?tRNA 生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇的生物合成、ABC 轉運蛋白。

圖7 不同產地杜仲雄花間差異代謝物聚類分析Fig.7 Cluster analysis of differential metabolites among male flowers of Eucommia ulmoides from different producing areas

3 討論與結論

代謝組學包括靶向和非靶向，其中非靶向代謝組學能從整體反映代謝物的變化，提供更廣泛的代謝物覆蓋，實現(xiàn)不同樣品間代謝特征的比較[19-20]。本研究采用UPLC-QTOF/MS 結合多元統(tǒng)計方法，對不同產地杜仲的雄花進行代謝組學分析，在ESI+模式和ESI-模式下分別獲得13 341個和10 387 個特征離子，對一級質譜信息進行篩選，ESI+和ESI-模式下定性到1 368 個代謝物和899 個代謝物。檢索公共數(shù)據(jù)庫in-house 標準數(shù)據(jù)庫二級質譜圖，篩選定性到正離子模式212 個代謝物和負離子模式37 個代謝物。通過PCA 分析，不同樣本表現(xiàn)出明顯的分離趨勢，表明不同產地杜仲雄花的代謝組具有一定的差異性。

通過對差異代謝物的篩選，共篩選出45 個顯著差異代謝物，主要參與氨酰基tRNA 生物合成、類黃酮生物合成、黃酮和黃酮醇生物合成以及ABC 轉運蛋白等代謝途徑。其中，黃酮類化合物最多，為11 個；其次是羧酸及其衍生物，為10 個。嚴穎等[5]對杜仲雄花中木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類和黃酮類等32 種成分進行了初步鑒定，丁艷霞等[21]從杜仲雄花95%乙醇提取物中分離鑒定了柚皮素、槲皮素、異鼠李素-3-O-β-D-葡萄糖苷、蘆丁、紫云英苷等10 個黃酮化合物。在本研究中也同樣鑒定到紫云英苷、柚皮素、山柰酚、槲皮素、蘆丁等黃酮類化合物。前期系統(tǒng)研究了不同種質杜仲雄花主要活性成分含量的多樣性，發(fā)現(xiàn)京尼平苷酸變異系數(shù)最大，其次是異槲皮苷、綠原酸等[14]。測定了杜仲種質資源雄花中的17 種氨基酸，發(fā)現(xiàn)脯氨酸(Pro)、半胱氨酸(Cys)、賴氨酸(Lys)和蛋氨酸(Met)變異系數(shù)相對較高[15]。含量變化程度較高的代謝成分綠原酸、賴氨酸(Lys)和蛋氨酸(Met)在本研究中篩選為差異代謝物。

貴州遵義杜仲種質酚類化合物咖啡酸，苯丙素類化合物迷迭香酸、綠原酸，黃酮類化合物5,7-二羥基黃酮、木犀草素、金絲桃苷含量明顯高于其他種質。河南洛陽杜仲種質錦葵色素-3-葡糖苷含量明顯高于其他種質。杜慶鑫等[22]發(fā)現(xiàn)不同變異類型的紅葉杜仲葉片綠原酸、京尼平苷、總黃酮、花色苷含量明顯高于綠葉杜仲。河南洛陽和貴州遵義雄花顏色呈現(xiàn)紫紅色和青紫色，可能與黃酮類化合物含量具有一定相關性。通過對不同產地杜仲雄花的形態(tài)特征進行測定，發(fā)現(xiàn)河南洛陽和貴州遵義杜仲種質的雄花序數(shù)量、單雄花序鮮質量、雄花序長度和寬度、雄花數(shù)量和長度、雄蕊數(shù)量和長度與其他種質相比平均值較高，且河南洛陽和貴州遵義產地的種質相對于其他產地上調的差異代謝物較多，含量較高。Shi 等[23]對小麥重組自交系進行了代謝產物-農藝性狀關聯(lián)，發(fā)現(xiàn)共定位于同一位點的代謝產物與農藝性狀顯著相關。差異代謝物可能與杜仲雄花形態(tài)性狀有一定的相關性，有待進一步研究。

LC-MS 儀器具有高靈敏性和多功能性，可以在非靶向代謝組學研究中檢測數(shù)萬個特征，是代謝組學研究中應用最廣泛的平臺[24-25]。但是在測定過程中不可避免地產生大量錯誤的陽性信號并與真實信號相混合，且存在同位素和加和離子，檢測到的代謝數(shù)據(jù)很大部分是冗余的[26-27]。在本次檢測過程中存在很多假陽性質譜峰信號無法注釋到代謝物，加之數(shù)據(jù)庫中很多代謝物存在同分異構體，導致鑒定結果出現(xiàn)很多一個特征離子對應多個代謝物，影響代謝物注釋，因此后續(xù)需要對注釋出的代謝物進行靶向代謝組驗證。本研究對5 個代表性產地杜仲雄花進行了代謝組學分析，初步證明不同雄花種質的代謝成分存在明顯差異，但是從代謝組角度出發(fā)開展杜仲種質資源的精準評價，需要測定更多的種質資源進行進一步的探索研究。