李 軻, 李 可,趙運勝, 唐慧驥,王曉晶

1. 鄭州海關(guān)技術(shù)中心 (鄭州 450003) 2. 浙江省檢驗檢疫科學(xué)技術(shù)研究院 (杭州 310016) 3. 河南捷信檢測認證有限公司 (鄭州 450003)

即食食品( Ready-to-eat，RTE)，簡稱即食品，是指不需要額外加工處理，打開包裝可直接入口食用的一類食品，屬于非傳統(tǒng)類食品。即食食品的種類繁多，主要包括乳酪、罐頭、烘炒食品、烘焙食品、蜜餞、干果、熟肉制品等[1-2]。因其具有直接食用的特點，故對微生物限量標準的要求相對較高。而蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)主要在食物中增殖[3]，是即食食品中威脅人類健康的主要病原菌之一。

雖然我國近期發(fā)布國家強制標準《食品安全國家標準 散裝即食食品中致病菌限量》GB 31607—2021，僅對以米為主要原料制作的即食食品中蠟樣芽孢桿菌進行了限量規(guī)定[4]，但其他原料制作的即食食品蠟樣芽孢桿菌的檢出率也居高不下，據(jù)食品伙伴網(wǎng)訊，全球發(fā)生因蠟樣芽孢桿菌污染即食食品被召回事件2020年8起，2021年11起，涉及的即時食品主要包括拉米香腸、意大利面條和意大利熏火腿、熏制三文魚、烤雞胸片、鯡魚罐頭、餡餅和軟奶酪、黃油產(chǎn)品、生乳乳酪、花生醬等，涉及國家大多分布在北美洲、西歐等發(fā)達國家，這些國家和我國跨境貿(mào)易來往密切，對此，我國國門生物安全提示高度預(yù)警。

目前，即食食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測主要依據(jù)《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 蠟樣芽胞桿菌檢驗》GB 4789.14—2014[5]，此種方法步驟繁瑣復(fù)雜，檢測周期需要5～7 d，培養(yǎng)基使用多(17種)，除需要使用多種標準菌株以外還需要進行溶血試驗、動力試驗、溶菌酶耐性試驗、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗等復(fù)雜耗時的生化實驗。這些實驗對實驗人員的經(jīng)驗、操作、環(huán)境及試劑的質(zhì)量要求較高，影響結(jié)果因素較多，這些不確定因素給病原菌的分離鑒定工作帶來了一定的困難，使得檢驗人員容易出現(xiàn)誤判。同時，在食品中經(jīng)常遇到多種病原菌混合存在的情況，更增加了檢測工作的難度，使得結(jié)果準確性無法保證。實時光電檢測技術(shù)是一種以傳統(tǒng)經(jīng)典方法為理論基礎(chǔ)的自動檢測技術(shù)，該技術(shù)實時快速、操作簡單、簡化了傳統(tǒng)微生物的檢測方法，人為誤差引入少，可明顯縮短檢測時間[6]，是一種理想的食品快速檢測技術(shù)。

因此，本研究探索建立了基于實時光電技術(shù)的即時食品蠟樣芽孢桿菌快速檢測曲線模型并進行了驗證，實驗設(shè)計檢測數(shù)據(jù)在1×106～9.5×106CFU/mL之間，實驗結(jié)果檢出時間(Detection Time，DT)范圍在5.28～28.31 h之間，符合即時食品限量及快檢要求。應(yīng)用該技術(shù)預(yù)期可提高對即食食品中蠟樣芽孢桿菌的監(jiān)測、溯源、鑒定、預(yù)警和控制能力，對保障我國食品安全具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1樣品

市購各類即食食品24份(奶酪1份、干酪1份、奶片1份、生牛乳1份、奶油1份、香腸1份、熏火腿1份、烤魚片1份、熏制三文魚1份、熟肉丸1份、泡椒鳳爪1份、豆干1份、素雞條1份、豆乳1份、芒果干1份、黃瓜條1份、蘿卜干1份、黃桃罐頭1份、香菇脆1份、小米鍋巴1份、餅干1份、鹵蛋1份、米果1份、即食米片1份)。

1.1.2試劑

蠟樣芽孢桿菌檢測管，紐勤生物科技(上海)有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、胰酪胨大豆多黏菌素肉湯、甘露醇卵黃多黏菌素瓊脂(MYP)、營養(yǎng)瓊脂、蠟樣芽孢桿菌干制生化試劑盒，北京陸橋公司。

1.1.3標準菌株

蠟樣芽孢桿菌標準菌株(CICC10041、CMCC63301-15)，鄭州海關(guān)技術(shù)中心生物實驗室保存。

1.1.4儀器設(shè)備

微生物快速檢測儀(S128)，美國Neogen；恒溫培養(yǎng)箱(INE500)，德國美墨爾特；電子天平(PL601-L)，梅特勒-托利多；拍擊式均質(zhì)器(Masticator)，西班牙IUL；生物安全柜(1379)，美國賽默飛；移液器(0.1～1 mL)，德國eppendorf；麥氏比濁管，北京天安聯(lián)合科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1標準菌液制備

取凍存蠟樣芽孢桿菌標準菌株(CICC10041、CMCC63301-15)各1支，接種100 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯，30 ℃培養(yǎng)50 h；生物安全柜內(nèi)操作，將培養(yǎng)后的菌液10倍遞增稀釋至107倍，保存不同濃度菌液備用。

1.2.2樣品基礎(chǔ)檢測情況

無菌條件下按GB 4789.14方法檢測對1.1.1各樣品進行蠟樣芽孢桿菌檢測，結(jié)果1份樣品疑似陽性，單獨保存，其余陰性樣品留作本試驗備用。

1.2.3人工污染樣制備

無菌條件下稱取1.2.2樣本各25 g，分別放入裝有225 mL PBS無菌均質(zhì)袋內(nèi)，混勻，隨機編號為1、2、3……25，每個樣品平行制作3份，共3組，備用。

取1.2.1原液菌液用麥氏比濁管法校正兩種菌液濃度均約為3.0×108CFU/mL。接種第1組樣品，每個樣品接種1 mL，1～10號接種CICC10041菌液，11～24號接種CMCC63301-15菌液；同樣操作取103倍稀釋菌液接種第2組樣品；106倍稀釋菌液接種第3組樣品。均質(zhì)，備用。

1.2.4標準曲線建立技術(shù)原理

實時光電檢測技術(shù)是以傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)理論、染色技術(shù)為基礎(chǔ)[7]，將新光源和光子探測技術(shù)、二氧化碳傳感技術(shù)結(jié)合在一起，通過雙溫光電檢測系統(tǒng)和計算機控制的模塊化分析系統(tǒng)來監(jiān)控微生物生長代謝所引發(fā)的光密度和顏色的變化[8]，當目標微生物在特異性的檢測瓶中生長，代謝產(chǎn)物二氧化碳引起含有顏色指示劑的傳感器顏色變化[9]，檢測瓶顏色變化所需時間與樣本中微生物含量成反比[10]，即微生物含量越多，變色所需時間越短；微生物含量越少，顏色變化需要的時間越長[11]。

1.2.5標準曲線建立

取蠟樣芽孢桿菌標準菌株(CICC10041)原液及相鄰10倍遞增稀釋菌液各1 mL，按照GB 4789.14 4.2.4分別接種MYP平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，計數(shù)結(jié)果；同時移取0.1 mL菌液原液加入蠟樣芽孢桿菌檢測管，將檢測管擰緊混勻，上機檢測，依據(jù)GB 4789.14設(shè)定條件30 ℃、48 h，每個稀釋度平行測試5次，獲得35組數(shù)據(jù)，以傳統(tǒng)方法的計數(shù)結(jié)果(CFU/mL)的對數(shù)值為縱坐標，以實時光電法相應(yīng)稀釋度的DT值為橫坐標，建立平板計數(shù)和DT值之間的對應(yīng)關(guān)系，剔除偏差較大數(shù)據(jù)，生成標準曲線圖，用于蠟樣芽孢桿菌的定量檢測。

1.2.6標準曲線驗證

取1.2.3第2組樣本1～25號，依據(jù)GB 4789.14檢測，得到計數(shù)結(jié)果；同時各移取0.1 mL加入蠟樣芽孢桿菌檢測管中，設(shè)定儀器參數(shù)30 ℃、48 h，儀器自動記錄各樣本的DT值，將DT值代入標準曲線中得到相應(yīng)樣本的蠟樣芽孢桿菌數(shù)；獲得的2組數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.2.7方法穩(wěn)定性驗證

取1.2.3中所有組樣本，使用實時光電法進行檢測，得到的結(jié)果組內(nèi)求相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)，分析其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線建立

根據(jù)國標法平板計數(shù)結(jié)果，菌液的蠟樣芽孢桿菌含量為5.6×108CFU/mL，將菌液進行7次10倍遞增稀釋，每個稀釋度進行2種方法5次重復(fù)測定，獲得35組一一對應(yīng)的數(shù)據(jù)制作標準曲線如圖1，標準曲線方程為y(lgCFU/mL)=-0.259 6x+7.349 7,相關(guān)系數(shù)R2=0.940 3.表明實時光電法檢出時的DT值和蠟樣芽孢桿菌含量的對數(shù)呈較強的負相關(guān)性。實時光電檢測技術(shù)是通過光電技術(shù)實時監(jiān)測微生物的代謝產(chǎn)物，樣品中微生物含量越高，代謝產(chǎn)物積累到儀器感應(yīng)劑量時間越短，反之亦然[12]，因此，可以利用該標準曲線檢測樣品中蠟樣芽孢桿菌污染程度。

圖1 蠟樣芽孢桿菌檢測標準曲線圖

2.2 標準曲線驗證

選取高濃度菌液人工污染的第1組1～24號及25號樣本，采用實時光電法檢測，得出各樣品對應(yīng)的DT值，同時GB 4789.14進行蠟樣芽孢桿菌測定，測定結(jié)果見表1。剔除25號結(jié)果數(shù)據(jù)，對其余不同方法不同條件下獲得的兩組結(jié)果選擇多種統(tǒng)計方法進行組內(nèi)、間差異性分析，結(jié)果見表2。

依據(jù)ISO 4833-1:2013 《Microbiology of the food chain -Horizontal method for the enumeration of microorganisms-Part 1: Colony count at 30 °C by the pour plate technique》[13]，復(fù)現(xiàn)性限值R=0.45，表1結(jié)果符合率96%，標準曲線可信。表2數(shù)據(jù)分析結(jié)果，兩組數(shù)據(jù)組內(nèi)RSD值均小于5%，表明組內(nèi)數(shù)據(jù)穩(wěn)定，標準曲線有效；組間數(shù)據(jù)單因素方差分析，當a=0.05時，F(xiàn) crit(臨界值)=4.05，F(xiàn)(檢驗統(tǒng)計量)=0.40，P-value(觀測到的顯著水平)=0.53，結(jié)果顯示F

表1 蠟樣芽孢桿菌標準曲線驗證結(jié)果

表2 統(tǒng)計分析表

2.3 穩(wěn)定性驗證

選取1.2.3中高、中、低濃度污染的3組樣品進行穩(wěn)定性試驗。測試結(jié)果見表3。3組樣品測試結(jié)果RSD值分別為3.7%、1.78%、4.80%，均低于5%。表明實時光電法測試即時食品蠟樣芽孢桿菌不受樣品基質(zhì)種類限制，具有良好的穩(wěn)定性。

表3 蠟樣芽孢桿菌穩(wěn)定性試驗結(jié)果

3 結(jié)束語

(1)本研究選取不同基質(zhì)的樣本進行高濃度菌液污染后進行了標準曲線的驗證及穩(wěn)定性驗證。試驗過程發(fā)現(xiàn)同一樣本兩種方法檢測，國標法結(jié)果稍低，推測可能是光電法采用的是指示劑變色原理，利用光子探測技術(shù)對傳感器因顏色變化導(dǎo)致的透光度的變化實時監(jiān)測，自動探測較人工觀察稍靈敏。

(2)試驗過程發(fā)現(xiàn)不同基質(zhì)的樣本檢測結(jié)果穩(wěn)定，RSD值符合要求，實時光電法檢測結(jié)果不受基質(zhì)干擾，方法具有良好的特異性和靈敏性，與張翠芬[14]的研究結(jié)論一致。

(3)本研究前期探索時為避免假陰性出現(xiàn)，把儀器時間參數(shù)設(shè)定為48 h，試驗過程發(fā)現(xiàn)，低濃度污染的樣本30 h以內(nèi)均能實現(xiàn)個位數(shù)結(jié)果檢出，因此在實際應(yīng)用過程中可設(shè)定時間參數(shù)為30 h；依據(jù)GB 31607—2021，以米為主要原料制作的即食食品中蠟樣芽孢桿菌限量規(guī)定≤10 000 CFU/g(mL)，直接根據(jù)限量值，利用標準曲線計算樣本的檢測時間為12.90 h，在檢測以米為主要原料制作的即食食品時可直接設(shè)定時間參數(shù)為13 h，以提高檢測效率；

(4)樣本計數(shù)范圍達到覆蓋5～6 個指數(shù)級時，制作標準曲線時的2 種方法相關(guān)性越可靠[15]，因此，本試驗探索使用7個10倍梯度稀釋菌液建立標準曲線，驗證標準曲線及穩(wěn)定性時使用了兩株不同來源的標準菌株(CICC10041、MCC63301-15)，結(jié)果表明，該標準曲線準確、可靠，覆蓋面廣而具有代表性。

(5) 由于即時食品種類繁多，受防腐劑、色素、抑菌成分、生產(chǎn)環(huán)境、存放條件等的影響，污染的蠟樣芽孢桿菌來源復(fù)雜，標準曲線的適用性有一定的局限，實際工作中需要不定期對標準曲線進行校正和驗證，以提高標準曲線的適用性、準確性、重復(fù)性[16]。

(6)受研究時間限制，本實驗僅收集到1份自然污染樣本，利用標曲模型和國標法測定后，兩種方法得出結(jié)果相吻合。后續(xù)研究可更多關(guān)注即時食品蠟樣芽孢桿菌污染情況，以期收集更多自然污染樣品，完善檢測模型。

綜上，實時光電法蠟樣芽孢桿菌標曲模型的建立基于兩種方法科學(xué)的結(jié)合，因此實時光電法和GB 4789.14傳統(tǒng)方法具有極好的一致性，且操作簡單，應(yīng)用方便，檢測時間縮短明顯，好用，實用，適宜在口岸跨境電商即時食品監(jiān)測、生產(chǎn)企業(yè)衛(wèi)生監(jiān)控、產(chǎn)品質(zhì)量控制等場所推廣應(yīng)用。